CN117866023A - 一种活性甘油糖脂化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物及新型医药农药技术领域,具体为一种新型含糖甘油脂类活性化合物,并进一步公开其制备方法与应用。本发明所述活性甘油糖脂化合物FW‑6‑2,经活性测试,其对细菌中金黄色葡萄球菌与藤黄微球菌具有细胞毒活性,不仅发现新的含糖甘油脂类化合物,尤其为研究开发新的抑制细菌药物提供了先导化合物。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及新型医药农药技术领域,具体为一种新型含糖甘油脂类活性化合物,并进一步公开其制备方法与应用。
背景技术
小单孢菌属(Micromonospora)属于稀有放线菌目小单孢菌科(Micromonosporaceae),其菌株来源广泛,有来自淡水湖泊,也有分离来自海洋环境的。据Talukdar等人的统计,截至2016年,近700种抗生素来自于小单孢菌属的代谢产物。因此,稀有放线菌中的小单胞菌属是生物活性次级代谢产物的一个重要的宝库(Qi et al.,2020)。
2000年,Librada M.Canedo等人从海洋小单孢菌Micromonospora sp.中发现了新型螺环类大环内酯化合物IB-96212,并验证了其具有抗细菌活性,尤其对Micrococcusluteus(藤黄微球菌)MIC值达到0.4ug/ml,并同时对多种肿瘤细胞有很强的细胞毒作用,尤其对P388细胞株的IC50值达0.1ng/ml,活性显著高于对照品紫杉醇(200ng/ml)以及依托泊苷(100ng/ml),甚至是阿霉素(20ng/ml)。另外,IB-96212类化合物结构与寡霉素类化合物相比,除了特征性的螺环结构外,多出了一个糖环L-rhodinose(L-玫红糖),目前,该类化合物仅发现此一个,对其抗菌机理和生物合成机理尚未报道。
如中国专利CN114907367A公开的利用海洋小单胞菌发酵制备天然大环内酯类化合物FW-Z的方法,并验证了所述化合物具有类似于寡霉素的抗真菌性能,对真菌中黑曲霉具有细胞毒活性。又如中国专利CN115504990A公开的利用海洋小单胞菌发酵制备天然含糖-螺环-大环内酯类化合物FW-5-39的方法,所述含糖-螺环-大环内酯化合物FW-5-39具有类似于寡霉素的抗真菌性能,该化合物FW-5-39对真菌中黑曲霉及白色念珠菌具有细胞毒活性。
因此,本领域期待开发更多的具有抗菌活性的化合物,对新型抗生素药物的研发具有积极的意义。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种新型活性甘油糖脂化合物FW-6-2,该含糖甘油脂FW-6-2对细菌中金黄色葡萄球菌与藤黄微球菌具有细胞毒活性;
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述新型活性甘油糖脂化合物FW-6-2的制备方法;
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供上述新型活性甘油糖脂化合物FW-6-2用于制备新型抗生素药物的用途。
为解决上述技术问题,本发明所述的一种活性甘油糖脂化合物,其特征在于,所述化合物记为FW-6-2,具有如下式(Ⅰ)所示的结构:
本发明还公开了一种发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,包括将海洋小单孢菌株FIMYZ51接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤;
所述海洋小单孢菌株FIMYZ51,其分类命名为小单孢菌Micromonospora sp.,于2021年12月9日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.24067。
具体的,所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,包括如下步骤:
(1)种子液培养:取斜面保存的所述海洋小单孢菌(Micromonospora sp.)FIMYZ51接入液体种子培养基中进行恒温培养,收集种子液,备用;
(2)发酵液培养:将所述种子液转接至发酵培养基中进行恒温培养,即得含有所需活性甘油糖脂化合物的发酵液。
具体的,所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,所述步骤(1)中:
所述种子培养基的组分包括:可溶性淀粉1-2wt%,葡萄糖0.3-0.8wt%,黄豆粉0.3-0.8wt%,酵母提取物0.3-0.8wt%,MgSO4·7H2O 0.03-0.08wt%,NaCl 0.03-0.08wt%,(NH4)2SO4 0.03-0.08wt%,CaCO3 0.05-0.15wt%,pH 6.0-8.5;
优选的,所述种子培养基的组分包括:可溶性淀粉1.5%,葡萄糖0.5%,黄豆粉0.53%,酵母提取物0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,NaCl0.05%,(NH4)2SO4 0.05%,CaCO30.1%,pH 6.0-8.5;
所述恒温培养步骤的温度为25-35℃,培养时间1-3天。
具体的,所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,所述步骤(2)中:
所述发酵培养基的组分包括:可溶性淀粉3-5wt%,葡萄糖0.3-0.8wt%,玉米浆干粉2-3wt%,酵母粉0.3-0.8wt%,MgSO4·7H2O 0.03-0.08wt%,K2HPO4 0.03-0.08wt%,CaCO3 0.05-0.15wt%,pH 6.0-8.5;
优选的,所述发酵培养基的组分包括:可溶性淀粉4%,葡萄糖0.5%,玉米浆干粉2.5%,豆油0.5%,酵母粉0.5%,MgSO4·7H2O0.05%,K2HPO4 0.05%,CaCO3 0.1%,pH 6.0-8.5;
所述恒温培养步骤的温度为25-35℃,培养时间3-6天。
具体的,所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,所述方法还包括对所述活性甘油糖脂化合物进行提取及纯化的步骤,具体包括:
(3)提取:将收集的发酵液加入XAD-16树脂进行吸附,过滤并将滤饼进行解吸回收浓缩后,得到粗提物A;
(4)纯化:将所述粗提物A采用C18反相柱层析,以甲醇:水进行梯度洗脱,经高效液相分析型色谱检测,分段收集洗脱液;收集40-80%区段洗脱液组分,并经过制备型C18反相高压液相色谱进行梯度洗脱,收集50%区段组分,得到所需活性甘油糖脂化合物FW6-2纯品。
具体的,所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,所述步骤(3)中,所述XAD-16树脂与所述发酵液的体积比为1:10-1:30混合;
所述解吸步骤为100%乙醇解吸。
具体的,所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,所述步骤(4)中:
所述C18反相柱层析步骤中,控制甲醇-水的体积比为30%-100%进行梯度洗脱;
所述制备型C18反相高压液相色谱步骤中,采用体积比为40%-75%的乙腈-水进行梯度洗脱。
本发明还公开了所述活性甘油糖脂化合物用于制备医用、兽用或农用非治疗目的抗细菌制剂的用途;
优选的,所述抗细菌制剂包括金黄色葡萄球菌抑菌剂、藤黄微球菌抑菌剂。
本发明还公开了一种海洋小单孢菌株FIMYZ51用于发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的用途;
所述海洋小单孢菌株FIMYZ51,其分类命名为小单孢菌Micromonospora sp.,于2021年12月9日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.24067。
本发明利用从海洋放线菌中分离并筛选到一株具有抗真菌活性的海洋小单孢菌(Micromonospora sp.)FIMYZ51进行发酵制备所述化合物FW-6-2,可以从小单孢菌(Micromonospora sp.)FIMYZ51发酵液中提取分离得到对对细菌中金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌具有抑制活性的化合物FW6-2化合物,经发酵液提取及纯化获得化合物纯品,发酵效率及提取效率均较为理想。
本发明所述活性甘油糖脂化合物FW-6-2,经活性测试,其对细菌中金黄色葡萄球菌以及藤黄微球菌具有细胞毒活性,不仅发现新的含糖甘油脂类化合物,尤其为研究开发新的抑制细菌药物提供了先导化合物。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中,
图1是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2高分辨质谱图;
图2是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2的1H核磁共振图1H谱;
图3是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2的13C核磁共振图13C谱;
图4是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2的1H-1HCOSY相关图谱;
图5是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2的HSQC图谱;
图6是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2的HMBC相关图谱;
图7是本发明中活性甘油糖脂化合物FW-6-2的抗菌测试结果,其中,(A)为金黄色葡萄球菌,(B)为藤黄球菌。
具体实施方式
本发明如下实施例中,利用筛选的小单孢菌菌株(Micromonospora sp.)FIMYZ51进行发酵制备所述活性甘油糖脂化合物FW-6-2。
所述小单孢菌菌株(Micromonospora sp.)FIMYZ51,其分类命名为小单孢菌Micromonospora sp.,于2021年12月9日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.24067,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明如下实施例从小单孢菌菌株(Micromonospora sp.)FIMYZ51发酵液中提取分离获得一种对细菌中的金黄色葡萄球菌与藤黄微球菌具有细胞毒活性的活性甘油糖脂化合物FW-6-2。
实施例1活性甘油糖脂化合物FW-6-2获得
将保存的小单孢菌Micromonospora sp.FIMYZ51接种于淀粉天冬素琼脂斜面培养物接入液体种子培养基,温度30℃培养时间2天后,将得到的种子液与人工发酵培养基按照体积比1:10的比例混合,置于温度30℃,振荡培养5天,收集发酵产物。
所述液体种子培养基的组分为:可溶性淀粉1.5%,葡萄糖0.5%,黄豆粉0.53%,酵母提取物0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,NaCl 0.05%,(NH4)2SO40.05%,CaCO3 0.1%,自来水配制,pH 6.0-8.5。
所述发酵培养基的组分为:可溶性淀粉4%,葡萄糖0.5%,玉米浆干粉2.5%,豆油0.5%,酵母粉0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.05%,CaCO30.1%,自来水配制,pH6.0-8.5。
收集的发酵产物进行固液分离,分别收集发酵液和菌丝体,其中,将所述发酵液用树脂XAD-16进行吸附,吸附后经离心或者过滤获得滤饼,滤饼经100%工业乙醇浸泡过夜,取溶剂层,经减压浓缩后得粗提物A。
将上述得到的粗提物A,采用C18反相柱进行层析,以甲醇:水(体积比30%-100%)进行梯度洗脱(30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%),利用高效液相分析型色谱进行检测(色谱柱为Agilent SB-C18,4.6×250mm),检测波长为200nm,收集甲醇体积占比为40%-80%区段的洗脱液;经过制备型Agilent SB-C18(20×250mm)反相高压液相色谱的制备梯度洗脱(体积比40%-75%的乙腈-水),在乙腈体积占比50%的区段,得到所需抗细菌活性的化合物FW6-2纯品。
实施例2化合物FW-6-2的结构解析
本实施例通过MS和NMR技术鉴定上述活性甘油糖脂化合物FW-6-2的结构。
经鉴定,所述化合物FW-6-2为淡黄色无定型固体,分子式:C33H58O14,其不饱和度为5,分子量:678.38;经高分辨质谱测量值:m/z[M+Na]+=701.3707,[M+NH4]+=696.4159,理论值m/z 701.3719[M+Na]+。
所述化合物可溶于甲醇、丙酮、乙腈、氯仿、乙酸乙酯和二甲亚砜等有机溶剂,不溶于水。
所述化合物FW-6-2的1H核磁共振波谱(DMSO-d6,600MHz):δ5.35(ddd,J=11.1,7.0,1.6Hz,1H),5.33(dd,J=6.9,1.3Hz,1H),5.31(dd,J=6.9,1.3Hz,1H),5.29(ddd,J=11.1,7.0,1.6Hz,1H),4.68(d,J=3.6Hz,1H),4.58(s,1H),4.51(s,1H),4.39(s,1H),4.09(t,J=3.7Hz,1H),4.04(dd,J=11.2,4.0Hz,1H),3.97(dd,J=11.2,6.6Hz,1H),3.81(dq,J=11.0,6.0Hz,1H),3.70(d,J=3.9Hz,1H),3.68(d,J=5.6Hz,1H),3.66(d,J=5.6Hz,1H),3.60(m,1H),3.59(dd,J=5.9,2.5Hz,1H),3.57(d,J=5.8Hz,1H),3.55(d,J=3.9Hz,1H),3.53(d,J=6.3Hz,1H),3.51(d,J=7.0Hz,1H),3.49(d,J=4.5Hz,1H),3.43(dd,J=5.8,4.5Hz,1H),3.42(dd,J=5.8,3.2Hz,1H),3.33(dd,J=2.5Hz,1H),3.29(d,J=2.1Hz,2H),3.16(s,1H),3.12(s,1H),2.73(dd,J=7.5,6.1Hz,2H),2.29(t,J=7.5Hz,2H),2.01(q,J=6.8Hz,4H),1.50(q,J=7.2Hz,2H),1.31(t,J=6.9Hz,3H),1.28(dd,J=4.1,1.8Hz,2H),1.27–1.26(m,6H),1.25(d,J=1.6Hz,2H),1.24(d,J=4.1Hz,2H),0.85(t,J=7.0Hz,3H)。
所述化合物FW-6-2的13C核磁共振波谱(DMSO-D6,150MHz):δ173.0,129.8,127.8,104.0,99.5,73.1,72.9,71.3,70.5,70.4,69.6,68.8,68.4,68.1,67.4,66.5,65.5,60.6,33.4,30.9,29.0,28.7,28.6,28.5,28.5,26.6,26.6,25.2,24.4,22.0,13.9。
同时,本实施例还测定了该化合物FW-6-2多种核磁共振图谱,分别见图1-图6,从而确定了该化合物所有的碳原子和氢原子的归属及该化合物的化学结构,确定其为结构新颖的含糖甘油脂类化合物,FW-6-2化合物的1H和13C(DMSO-6)归属等结构表征信息如下表1。
FW-6-2的核磁数据
综上,本发明经提取纯化得到的化合物FW-6-2的结构式如下:
实施例3化合物FW-6-2生物活性测定
本实施例对所述活性甘油糖脂化合物FW-6-2进行了体外抑制细菌试验,结果表明,其具有抑制金黄色葡萄球菌与藤黄微球菌生长的作用。
本实施例采用纸片-琼脂扩散实验(paper-agar disk diffusion assay)测定了化合物FW-6-2对细菌与真菌的抑制活性。
首先将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、八叠球菌、枯草杆菌以107个/ml菌落密度倒MH平板;白色念珠菌、黑曲霉以105个/ml菌落密度倒沙氏平板;取获得的化合物FW-6-2纯品溶解于甲醇溶液,取8μl待测样品于6mm直径的圆形滤纸片上,将载有样品的滤纸片贴于含有上述浓度的测试菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)平板上,同时,以二甲亚砜溶液作为阴性对照,28-35℃恒温培养24-48小时。观察记录抑菌圈直径大小,抑菌圈直径越大则说明该菌株的抗细菌活性越强,结果见附图7所示。
如图7所示实验结果表明,本发明获得的化合物FW-6-2表现出了对金黄色葡萄球菌(A)以及藤黄球菌(B)的抑制活性,抑菌圈直径分别为7-8mm与18-22mm。因此,所述化合物FW-6-2有望可作为抗细菌活性先导化合物。
综上,从该含糖甘油脂的体外抑制细菌活性试验表明,其具有抑制细菌活性,因而为研究开发新的抑制细菌药物提供了先导化合物。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种活性甘油糖脂化合物,其特征在于,所述化合物记为FW-6-2,具有如下式(Ⅰ)所示的结构:
2.一种发酵制备权利要求1所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,包括将海洋小单孢菌株FIMYZ51接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤;
所述海洋小单孢菌株FIMYZ51,其分类命名为小单孢菌Micromonospora sp.,于2021年12月9日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.24067。
3.根据权利要求2所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)种子液培养:取斜面保存的所述海洋小单孢菌
(Micromonospora sp.)FIMYZ51接入液体种子培养基中进行恒温培养,收集种子液,备用;
(2)发酵液培养:将所述种子液转接至发酵培养基中进行恒温培养,即得含有所需活性甘油糖脂化合物的发酵液。
4.根据权利要求3所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,所述步骤(1)中:
所述种子培养基的组分包括:可溶性淀粉1-2wt%,葡萄糖0.3-0.8wt%,黄豆粉0.3-0.8wt%,酵母提取物0.3-0.8wt%,MgSO4·7H2O 0.03-0.08wt%,NaCl 0.03-0.08wt%,(NH4)2SO4 0.03-0.08wt%,CaCO3 0.05-0.15wt%,pH 6.0-8.5;
优选的,所述种子培养基的组分包括:可溶性淀粉1.5%,葡萄糖0.5%,黄豆粉0.53%,酵母提取物0.5%,MgSO4·7H2O 0.05%,NaCl
0.05%,(NH4)2SO4 0.05%,CaCO3 0.1%,pH 6.0-8.5;
所述恒温培养步骤的温度为25-35℃,培养时间1-3天。
5.根据权利要求3或4所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,所述步骤(2)中:
所述发酵培养基的组分包括:可溶性淀粉3-5wt%,葡萄糖0.3-0.8wt%,玉米浆干粉2-3wt%,酵母粉0.3-0.8wt%,MgSO4·7H2O 0.03-0.08wt%,K2HPO4 0.03-0.08wt%,CaCO30.05-0.15wt%,pH 6.0-8.5;
优选的,所述发酵培养基的组分包括:可溶性淀粉4%,葡萄糖0.5%,玉米浆干粉2.5%,豆油0.5%,酵母粉0.5%,MgSO4·7H2O
0.05%,K2HPO4 0.05%,CaCO3 0.1%,pH 6.0-8.5;
所述恒温培养步骤的温度为25-35℃,培养时间3-6天。
6.根据权利要求2-5任一项所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,所述方法还包括对所述活性甘油糖脂化合物进行提取及纯化的步骤,具体包括:
(3)提取:将收集的发酵液加入XAD-16树脂进行吸附,过滤并将滤饼进行解吸回收浓缩后,得到粗提物A;
(4)纯化:将所述粗提物A采用C18反相柱层析,以甲醇:水进行梯度洗脱,经高效液相分析型色谱检测,分段收集洗脱液;收集40-80%区段洗脱液组分,并经过制备型C18反相高压液相色谱进行梯度洗脱,收集50%区段组分,得到所需活性甘油糖脂化合物FW6-2纯品。
7.根据权利要求6所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述XAD-16树脂与所述发酵液的体积比为1:10-1:30混合;
所述解吸步骤为100%乙醇解吸。
8.根据权利要求6或7所述发酵制备所述活性甘油糖脂化合物的方法,其特征在于,所述步骤(4)中:
所述C18反相柱层析步骤中,控制甲醇-水的体积比为30%-100%进行梯度洗脱;
所述制备型C18反相高压液相色谱步骤中,采用体积比为40%-75%的乙腈-水进行梯度洗脱。
9.权利要求1所述活性甘油糖脂化合物用于制备医用、兽用或农用非治疗目的抗细菌制剂的用途;
优选的,所述抗细菌制剂包括金黄色葡萄球菌抑菌剂和藤黄微球菌抑菌剂。
10.一种海洋小单孢菌株FIMYZ51用于发酵制备权利要求1所述活性甘油糖脂化合物的用途;
所述海洋小单孢菌株FIMYZ51,其分类命名为小单孢菌Micromonospora sp.,于2021年12月9日保藏于中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.24067。
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