CN117860702A - 一种核酸药物给药系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸药物给药系统，包括核酸药物和包裹核酸药物的脂质体纳米颗粒，其中，脂质体纳米颗粒表面带有甘露糖脂修饰，甘露糖脂是通过还原反应将甘露三糖或甘露五糖与1,2‑双(二苯膦)乙烷偶联制备而成。本申请的给药系统靶向性强，是巨噬细胞摄取的最佳候选化合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种核酸药物给药系统及其制备方法和应用。
背景技术
常规剂型的药物通过静脉，口服，局部注射或吸入给药等方式，到达治疗靶区的药物不仅数量有限，还会带来免疫原性以及毒副作用等隐患。如何在需要的时间，使药物通过局部或全身血液循环聚集在靶组织、靶器官、靶细胞的新型给药系统的研究正日益受到关注与重视。靶向给药系统治疗疾患的理论和实践，经过两代DDS给药系统的发展已经有了近八十年的历史。取得了辉煌的成就，并有着光明未来和广大的发展空间。通过靶向系统的构建降低化疗药物对于人体正常细胞的毒副作用，是当前肿瘤治疗领域的热点和难点之一。本研究是肿瘤靶向治疗的一个主流分支，通过靶向肿瘤相关的效应免疫细胞，提高化疗药物对于肿瘤的杀伤力，同时降低其对于人体的毒副作用。
靶向药物与普通药物和缓释制剂相比具有1)药物集中在靶向治疗区域；2)减少药物使用剂量；3)提高治疗效果；4)减少药物毒副作用等优势。根据靶向药物的载体形态与剂型可分为小分子药物，蛋白质和多肽药物，抗体药物(单抗与双抗，ADC药物)，核酸药物以及活细胞疗法药物。这些靶向药物具有1)易降解：药物在循环系统或胃肠道内，易被血液中的消化酶，蛋白酶等降解，失去药物活性；2)核酸类的靶向药物只有实现细胞吞后，才能在细胞内部释放药效，达到治疗疾病的目的；3)人工合成的药物(包括核酸药物，小分子药物，蛋白质和多肽药物，抗体药物)需要解决免疫原性的困扰；4)已授权或已知技术较多，专利瓶颈难以突破；5)给药系统的研发是靶向药物的共同瓶颈。
公开号为CN108175759A的中国发明专利公开了一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用，属于生物技术领域。该系统由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成，特别提供了靶头是基于适配体AS1411，脂膜囊状物为外泌体由来共同组成的递送let-7的给药系统。本发明除了提供上述系统的制备方法，还提供了上述AS1411-exosome-let-7在细胞水平和小鼠在体水平的靶向性检测结果和抗肿瘤的应用，结果说明采用AS1411-exosome，与单独的exosome相比在细胞水平和小鼠体内均有更强的靶向性，而且可将let-7更有效的递送到肿瘤组织中发挥抑制肿瘤增殖和迁移功能。该技术方案采用靶向肿瘤细胞的靶头修饰脂膜囊状物，涉及到exosome的收集、AS1411-exosome-let-7的制备，过程耗时、复杂且要求较高。且不适用于AS1411低表达甚至是不表达肿瘤细胞体系的治疗与诊断。在适用性，预期药效与性价比上面临挑战。
纳米粒是一种新型药物递送系统，可包载化疗药物、基因药物等多种药物。通过对纳米粒表面结构的修饰可改变药物的体内分布，具有靶向给药、缓释药物、降低药物毒副作用、提高药物稳定性、促进药物在体内的转运和吸收、提高大分子药物生物利用度等优势，因此，本申请以纳米粒作为给药系统的基础，进一步通过对纳米粒的表面修饰与改进，旨在开发一种易合成、长稳定期、且具有靶向性的给药系统。
发明内容
现有技术中缺乏长期有效的给药系统，来保障核酸药物对靶细胞，靶组织，靶器官提供有效疗效的同时，降低其对于人体的毒副作用和耐药性。
为解决上述技术问题，本申请一方面提供了一种脂质体核酸药物的给药系统，包括核酸药物和包裹所述核酸药物的脂质体纳米颗粒，其中，脂质体纳米颗粒表面带有甘露糖脂修饰，甘露糖脂是通过还原反应将甘露三糖或甘露五糖与1,2-双(二苯膦)乙烷偶联制备而成。
根据本申请的实施例，核酸药物采用环状RNA技术设计成环状结构。
根据本申请的实施例，脂质体纳米颗粒采用二棕榈酰磷脂酰胆碱、Chol以及甘露三糖制备的甘露糖脂或甘露五糖制备的甘露糖脂中的一种或两者的任意组合制备而成。
根据本申请的实施例，脂质体纳米颗粒表面修饰的甘露糖脂靶向识别巨噬细胞表面的甘露糖受体(mannose receptor，MR)，从而实现核酸药物的细胞内吞。
根据本申请的实施例，脂质体纳米颗粒对所述核酸药物的包封率为80-100％。
根据本申请的实施例，脂质体纳米颗粒的平均粒径为100±20nm。
一种如上所述的一种核酸药物给药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)通过还原反应将甘露三糖或甘露五糖与DPPE偶联制备成甘露糖脂，甘露三糖或甘露五糖与DPPE摩尔比为1：2-4；2)对甘露糖脂进行色谱柱柱层析纯化，得到纯化的甘露糖脂；3)将摩尔比为1.5-2:1的DPPC和Chol的混合物用氯仿/甲醇体积比为1：5的溶液溶解并置于锥形烧瓶中通过旋转蒸发干燥；4)将含有1.0-3.0μmol甘露糖脂的乙醇溶液加入上步的锥形烧瓶中并通过旋转蒸发以制备含有甘露糖脂的脂质膜；5)通过强烈的涡旋分散，在干燥的甘露糖脂的脂质膜中添加1.0-2.0μmol循环RNA，再用PBS生成包被了核酸药物的脂质体溶液。
根据本申请的实施例，步骤1)中甘露三糖或甘露五糖与DPPE的摩尔比优选为1：3-3.5。
根据本申请的实施例，步骤1)中甘露糖脂按如下步骤制备：
(1)甘露三糖或甘露五糖以及DPPE溶解在氯仿/甲醇/水体积比为10：10：1的溶液中；
(2)将上述混合物移入密封的反应瓶中，水浴下超声处理10分钟，37°C加热2小时，再加入溶解在甲醇中的氰基硼氢化钠，并将反应混合物在80°C下保持5小时；
(3)采用氯仿/甲醇/水体积比为4：50：50的混合溶液平衡C18色谱柱，进行洗脱，用氯仿/甲醇/水体积比为10：10：3的混合溶液从色谱柱中洗脱出甘露糖脂，洗脱出的甘露糖脂采用TLC检测分子量进行结构的确认，并采用飞行时间质谱法对其纯度进行确认。
根据本申请的实施例，步骤(5)中，甘露糖脂的脂质膜与环状RNA的摩尔比为(30-80):(20-70)。
本申请的另一方面公开了一种核酸药物给药系统在关节炎自身性免疫系统疾病的预防与治疗的应用。
本发明技术方案相对于现有技术的有益效果是：
与现有技术相比，本申请的技术方案具有以下有益效果：
1.采用脂质体给药系统对核酸药物进行包裹，当包裹有药物的脂质体给药系统进入人体后，会启动被动免疫机制，利用单核吞噬细胞系(Mononeuclear Phagocyte System，MPS)吞噬脂质体纳米颗粒，从而在腹膜，脾、肺和骨髓等组织中靶向性地富集，并在富集位置释放其中包裹的核酸药物，发挥治疗效果。
2.基于单核吞噬细胞系的被动靶向潜能，其靶向性不足以应对治疗需求。附加甘露糖脂对脂质体纳米颗粒的表面进行修饰，增加包被药物进入巨噬细胞的主动靶向选择能，同时功能性靶向分子(甘露糖脂)不与包被药物直接接触或链接。这样既不会对包被药物的机能造成影响，又不会限制或制约递送药物的种类，理论上无论是水溶液药物或脂溶性药物，任何种类的候选药物均可被包被递送，适用范围更加宽广.
3.小分子以及核酸药物具有设计简单，易人工合成，研发周期短，靶点丰富，适用症广等优势。本发明提供的给药系统通过对包被核酸药物的修饰：核酸药物的表面修饰，采用环状RNA(CirRNA)技术，将核酸药物设计成环状结构，延长核酸药物在循环系统或胃肠道内的稳定性与完整性。
附图说明
图1是本发明示例中无修饰的核酸药物、甘露三糖修饰的核酸药物、甘露五糖修饰的核酸药物在巨噬细胞中被摄取情况的对比示意图；
图2是本发明示例中甘露三糖修饰的脂质体核酸药物的结构图；
图3是本发明示例在关节炎模型鼠治疗疗效示意图；
图4是本发明示例中实验终点时不同治疗组实验小鼠的症状展示图；
图5是本发明示例中实验小鼠的脾脏组织示意图；
图6是本发明示例中实验终点骨髓巨噬细胞分型示意图；
图7为本发明示例中核酸药物表面有无甘露糖脂修饰，对F4/80+骨髓巨噬细胞的核酸药物摄取的影响。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
纳米粒是一种新型药物递送系统，可包裹化疗药物、基因药物等多种治疗药物。对纳米粒的表面修饰可改变药物的体内分布，具有增强靶向指示性、缓释药物、降低药物用量及毒副作用、提高给药稳定性、促进生物膜的转运和吸收、提高生物大分子药物生物利用度等优势，在生物大分子药物给药系统中的应用尤为广泛。
本发明提供了一种基于巨噬细胞的核酸药物给药系统及其应用，以实现对自身性免疫系统疾病(如：类风湿性关节炎等)以及难治性疾病的预防与治疗。为了实现本发明的上述战略目标，通过采用以下技术方案：
首先：本发明提供了一种以巨噬细胞为靶向的，基于活体细胞(巨噬细胞)的核酸药物给药系统。该系统包括核酸药物与给药系统；核酸药物采用环状RNA(CirRNA)技术，给药系统为脂质体纳米颗粒(LNPs)。作为本发明的一种优选技术方案，所述脂质体纳米颗粒为平均粒径100±20nm，LNPs表面带有甘露糖脂(M3-DPPE或M5-DPPE)修饰。
其次：本发明先制备含有甘露糖脂(M3-DPPE或M5-DPPE)的脂质膜进行表面修饰，再将活性药物如核酸药物包被在脂质体中。因为功能性靶向分子甘露糖脂不与活性药物直接接触，所以不会对活性药物的功能造成影响，通过对LNPs的结构改造，可实现多重属性(水溶性或脂溶性)核酸药物的包被与递送，扩大适用范围，提高活性药物的治疗效果。
其中，脂质体纳米颗粒表面修饰的甘露糖脂靶向识别巨噬细胞表面的甘露糖受体(mannose receptor，MR)，从而实现核酸药物的细胞内吞。
本发明提供的一种核酸药物给药系统的制备方法，包括以下步骤：
1)通过还原反应将甘露三糖或甘露五糖与DPPE偶联制备成甘露糖脂，甘露三糖或甘露五糖与DPPE摩尔比为1：2-4；
2)对甘露糖脂进行色谱柱柱层析纯化，得到纯化的甘露糖脂；
3)将摩尔比为1.5-2:1的DPPC和Chol的混合物用氯仿/甲醇体积比为1：5的溶液溶解并置于锥形烧瓶中通过旋转蒸发干燥；
4)将含有1.0-3.0μmol甘露糖脂的乙醇溶液加入上步的锥形烧瓶中并通过旋转蒸发以制备含有甘露糖脂的脂质膜；
5)通过强烈的涡旋分散，在干燥的脂质膜中添加1.0-2.0μmol循环RNA，再用PBS生成包被了核酸药物的脂质体溶液。
实施例1甘露三糖(Man3)或甘露五糖(Man5)与DPPE偶联制备成甘露糖脂
通过还原反应将甘露三糖[Man3：Manα1-6(Manα1-3)Man]或甘露五糖Man5：Manα1-6(Manα1-3)Manα1-6(Manα1-3)Man]与DPPE偶联制备成甘露糖脂；作为本发明的一种优选技术方案，所述甘露三糖或甘露五糖与DPPE摩尔比为(1：2-4),更加优选的摩尔比为(1：3-3.5)；甘露三糖或甘露五糖以及DPPE溶解在5mL氯仿/甲醇/水的混合溶液中，氯仿/甲醇/水的体积比为10：10：1；将混合物移入密封的反应瓶中，水浴下超声处理10分钟，37℃加热2小时；加入1μmol的氰基硼氢化钠的甲醇溶液，并将反应混合物在80℃下保持5小时；将甘露糖脂(DPPE修饰的甘露三糖或甘露五糖)的混合反应液采用氯仿/甲醇/水体积比为4：50：50的混合溶液洗涤，同时用氯仿/甲醇/水体积比为4：50：50的混合溶液平衡C18色谱柱后，用30mL氯仿/甲醇/水(10：10：3，v/v/v)从色谱柱中洗脱出甘露糖脂；经柱层析分离纯化后的甘露糖脂的结构和纯度采用高性能TLC和飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)分型得到确认。
实施例2甘露糖脂修饰的脂质体纳米颗粒的制备
将摩尔比为(1.5-2):(1)的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和胆固醇(Chol)用5ml氯仿/甲醇(1：5，v/v)溶液置于锥形烧瓶中并通过旋转蒸发干燥；将实施例1中得到的甘露糖脂用乙醇配置成浓度为2.0μmol的溶液，取10ml该乙醇溶液加入烧瓶中并通过旋转蒸发以制备含有甘露糖脂的脂质膜；将环状RNA(CirRNA)用PBS稀释成浓度为1.0-2.0μmol，在强烈的涡旋分散下，在干燥的脂质膜中加入1ml环状RNA(CirRNA)的PBS溶液，生成包被了核酸药物的脂质体溶液。
如图2所示，DPPE修饰的甘露三糖与脂质体作用，形成甘露三糖修饰的脂质膜，该脂质膜内包裹了核酸药物，形成了甘露糖脂修饰的脂质体核酸药物。
实施例3脂质体药物表面有无甘露糖脂修饰对巨噬细胞的药物摄取的影响
为了了解脂质体药物表面甘露糖脂修饰的有无，是否有助于巨噬细胞更有效地摄取脂质体，制备了一系列包裹有荧光标记BSA的脂质体药物并注射到关节炎模型小鼠的皮下，这些脂质体表面部分修饰有甘露糖脂，部分没有任何修饰。注射后一小时，测定来自病患区骨髓巨噬细胞中胞吞的FITC-BSA的荧光信号，通过FACS(流式细胞仪)评估骨髓巨噬细胞摄入脂质体核酸药物的效率。如图1显示，最左边是骨髓巨噬细胞中胞吞到的无甘露糖脂修饰的脂质体核酸药物的荧光强度、中间是检测到的骨髓巨噬细胞中胞吞到的甘露三糖修饰的脂质体核酸药物的荧光强度，最右边是检测到的骨髓巨噬细胞中胞吞到的甘露五糖修饰的脂质体核酸药物的荧光强度，荧光强度从左到右逐步增强。实验结果显示，无甘露糖脂修饰的脂质体核酸药物的荧光信号几乎没有，说明骨髓巨噬细胞胞吞核酸药物的效果与甘露糖脂修饰呈正相关联。甘露糖脂修饰脂质体药物测试中，Man3-liposome(甘露三糖修饰的脂质体核酸药物)修饰的脂质体药物比Man5-liposome(甘露五糖修饰的脂质体核酸药物)更加有效地被摄入骨髓巨噬细胞。我们预测甘露糖脂修饰的脂质体药物有望成为巨噬细胞摄取的最佳候选化合物。并且根据实验结果，Man3-liposome脂质体药物的骨髓巨噬细胞内吞略好于Man5-liposome。
进一步地，如图7所示，设置对照组，以Man3-liposome的脂质体药物为研究对象，大多数骨髓巨噬细胞(超过70％的F4/80阳性表达骨髓巨噬细胞)摄取了甘露糖脂修饰(Man3-liposome)的脂质体药物，呈现显著的荧光标记-BSA信号(如图7的右半部分)。相比之下，只有约5.5％的F4/80阳性骨髓巨噬细胞检测出没有甘露糖脂修饰(Bare liposome)脂质体药物的弱信号(如图7的左半部分)。由此可见，本发明中的脂质体药物表面有无甘露糖脂修饰，显著影响F4/80阳性骨髓巨噬细胞内吞甘露糖脂修饰脂质体药物的效率。
实施例4甘露糖脂修饰的核酸药物治疗效果的测定
为了确认甘露糖脂修饰(Man3-liposome)的脂质体核酸药物的治疗效果，采用6-8周龄的DAB雄性小鼠制备了对照组，溶媒组，阳性对照组与治疗组模型。实验计划具体如图3所示的自身免疫性疾病关节炎造模与治疗流程，分别在D0与D21用胶原剂佐剂建模，D28开始治疗，D49天终止实验。
如图3所示，从左至右依次为实验小鼠的对照组，溶媒组和阳性对照组，D49实验终止日，影像学(Micro CT)检测结果可见阳性药对照组关节存在骨缺失，病理学辅助诊断(HE与番红固绿染色)可见类似现象。
治疗组，将实验小鼠分为5组，如图所示，从上到下依次分别为对照组、模型组、低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组，D49实验终止日，如图4所示，关节炎症部位高剂量治疗组的关节肿胀已明显消退。
实施例5甘露糖脂修饰的核酸药物靶向性的测定
本发明公开的甘露糖脂修饰脂质体核酸药物可在腹膜，脾、肺和骨髓等组织中靶向性地富集，并在富集位置释放其中包裹的药物，发挥治疗效果。在实施例4的基础上，如图5所示，将实施例中治疗组小鼠的脾脏进行称重和比较，脾脏称重(数据未显示)与影像结果显示高剂量治疗组已恢复到对照组平均水平，可见，甘露糖脂修饰的脂质体药物对脾脏等组织具有靶向性。
实施例6甘露糖脂修饰的脂质体药物对实验小鼠关节炎治疗效果的测定
在实施例4的基础上，流式检测结果显示MHCII与CD206双阳性辅助M2型巨噬细胞与MHCII+与CD206-辅助M1型巨噬细胞的数量比，如图6所示，从对照组的(9.92：40)；模型组(1.08：22.6)；低剂量组(2.34：16.6)；中剂量组(0.96：14.4)到高剂量组(4.18：23.6)，逐渐呈现从促炎的M1型巨噬细胞向血管新生、修复组织的M2型巨噬细胞转化的趋势，转化程度与治疗效果保持一致。因此，可以说明本给药系统能够应用于类似与关节炎修复等自身性免疫性疾病的治疗。
综上所述，本申请的发明具有以下有益效果：
1.采用脂质体递药系统对核酸药物进行包裹，当包裹有药物的脂质体递药系统进入人体后，会启动被动免疫机制，利用单核吞噬细胞系(Mononeuclear Phagocyte System，MPS)吞噬脂质体纳米颗粒，从而在腹膜，脾、肺和骨髓等组织中靶向性地富集，并在富集位置释放其中包裹的药物，发挥治疗效果。
2.基于单核吞噬细胞系的被动靶向潜能，其靶向性不足以应对治疗需求。附加甘露糖脂对脂质体纳米颗粒的表面进行修饰，增加包被药物进入巨噬细胞的主动靶向选择能，同时功能性靶向分子(甘露糖脂)不与包被药物直接接触或链接。这样既不会对包被药物的机能造成影响，又不会限制或制约递送药物的种类，理论上无论是水溶液药物或脂溶性药物，任何种类的候选药物均可被包被递送，适用范围更加宽广.
3.小分子以及核酸药物具有设计简单，易人工合成，研发周期短，靶点丰富，适用症广等优势。本发明提供的给药系统通过对包被核酸药物的修饰：核酸药物的表面修饰，采用环状RNA(CirRNA)技术，将核酸药物设计成环状结构，延长核酸药物在循环系统或胃肠道内的稳定性与完整性)。
以上仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种核酸药物给药系统，其特征在于，包括核酸药物和包裹所述核酸药物的脂质体纳米颗粒，其中，所述脂质体纳米颗粒表面带有甘露糖脂修饰，所述甘露糖脂是通过还原反应将甘露三糖或甘露五糖与1,2-双(二苯膦)乙烷偶联制备而成。
2.根据权利要求1所述的一种核酸药物给药系统，其特征在于，所述核酸药物采用环状RNA技术设计成环状结构。
3.根据权利要求1所述的一种核酸药物给药系统，其特征在于，所述脂质体纳米颗粒采用二棕榈酰磷脂酰胆碱、Chol以及甘露三糖制备的甘露糖脂或甘露五糖制备的甘露糖脂中的一种或两者的任意组合制备而成。
4.根据权利要求1所述的一种核酸药物给药系统，其特征在于，所述脂质体纳米颗粒表面修饰的甘露糖脂靶向识别巨噬细胞表面的甘露糖受体，从而实现核酸药物的细胞内吞。
5.根据权利要求1所述的一种基于巨噬细胞的核酸药物给药系统，其特征在于，所述脂质体纳米颗粒对所述核酸药物的包封率为80-100％，所述脂质体纳米颗粒的平均粒径为100±20nm。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的一种核酸药物给药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过还原反应将甘露三糖或甘露五糖与DPPE偶联制备成甘露糖脂，甘露三糖或甘露五糖与DPPE摩尔比为1：2-4；
2)对甘露糖脂进行色谱柱柱层析纯化，得到纯化的甘露糖脂；
3)将摩尔比为1.5-2:1的DPPC和Chol的混合物用氯仿/甲醇体积比为1：5的溶液溶解并置于锥形烧瓶中通过旋转蒸发干燥；
4)将含有1.0-3.0μmol甘露糖脂的乙醇溶液加入上步的锥形烧瓶中并通过旋转蒸发以制备含有甘露糖脂的脂质膜；
5)通过强烈的涡旋分散，在干燥的甘露糖脂的脂质膜中添加1.0-2.0μmol环状RNA，再用PBS洗脱生成包被了核酸药物的脂质体溶液。
7.根据权利要求6所述的一种核酸药物给药系统的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述甘露三糖或甘露五糖与DPPE的摩尔比优选为1：3-3.5。
8.根据权利要求6所述的一种核酸药物给药系统的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述甘露糖脂按如下步骤制备：
(1)甘露三糖或甘露五糖以及DPPE溶解在氯仿/甲醇/水体积比为10：10：1的溶液中；
(2)将上述混合物移入密封的反应瓶中，水浴下超声处理10分钟，37°C加热2小时，再加入溶解在甲醇中的氰基硼氢化钠，并将反应混合物在80°C下保持5小时；
(3)采用氯仿/甲醇/水体积比为4：50：50的混合溶液平衡C18色谱柱，进行洗脱，用氯仿/甲醇/水体积比为10：10：3的混合溶液从色谱柱中洗脱出甘露糖脂，洗脱出的甘露糖脂采用TLC检测分子量进行结构的确认，并采用飞行时间质谱法对其纯度进行确认。
9.根据权利要求6所述的一种核酸药物给药系统的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述甘露糖脂的脂质膜与所述环状RNA的摩尔比为30-80:20-70。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的一种核酸药物给药系统在关节炎自身性免疫系统疾病的预防与治疗的应用。
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