CN117844919A - Mfap5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及IPC A61K48，更具体地涉及，MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用。本发明公开了与主动脉瘤/夹层相关的基因标志物及其致病性变异，所述基因标志物为MFAP5。本发明首次发现了位于MFAP5上的一个新致病性变异c.C295T p.R99W(NM_003480)与主动脉瘤/夹层的发生相关，通过斑马鱼模型实验进一步证明了MFAP5p.R99W与主动脉瘤/夹层的发生相关，并通过斑马鱼模型评价了MFAP5p.R99W变异的致病性，MFAP5的致病性变异可用于主动脉瘤/夹层的临床诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及IPC A61K48，更具体地涉及，MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用。
背景技术
心血管疾病是当今世界首要的死亡原因，是世界各国普遍面临的一个重大卫生问题。我国由于受人口老龄化和不良生活方式的影响，平均每年每十万人中，大约有六人发生心血管疾病，并且发病率呈逐年递增趋势。
主动脉瘤/夹层(aortic aneurysms and dissection，AAD)是大血管疾病中的危急重症。主动脉瘤(aortic aneurysms，AA)是指主动脉壁局部或弥漫性异常扩张，超过正常血管直径的50％，血管壁全层向外膨出，形成的所谓的血管“瘤”。主动脉夹层(aorticdissection，AD)是在各种因素作用下主动脉内膜撕裂，高速高压的血流通过破口进入主动脉壁内，导致主动脉壁广泛分离，在血管腔内形成真腔和假腔。急性升主动脉夹层(thoracic aortic dissection，TAD)在临床上最常见，约占急性主动脉夹层数量的60-70％。急性升主动脉夹层病情危重，进展迅速，死亡率极高。急性期死亡率每小时增加1％-2％，约50％的患者在发病48小时内死亡，80％的患者在发病1周内死亡。
越来越多的遗传学证据表明主动脉瘤/夹层的发生和发展与遗传因素高度相关，遗传性主动脉瘤/夹层发病数约占主动脉瘤/夹层发病总数的1/4。遗传性主动脉瘤/夹层往往以主动脉逐渐形成动脉瘤/夹层为主要临床表现，其基础的病理生理特点是主动脉中层结缔组织中结构蛋白变异，引起弹性纤维表达降低或形态异常，导致主动脉力学特性降低，在血流压力下形成主动脉夹层/主动脉瘤。
遗传性主动脉瘤/夹层对个人、家庭和社会均具有较大影响。首先因为遗传性主动脉瘤/夹层常常在家族中的代际之间呈垂直遗传，所以遗传性主动脉瘤/夹层不仅使患者本人身心遭受病痛，而且使家族承受了巨大的经济压力和心理压力，还使社会负担增加。其次，遗传性主动脉瘤/夹层既可以呈孤立性发病，又可以与其他心内的畸形共存，还可以包含在综合征中，而且还是某些心血管系统罕见病的组成部分。遗传性主动脉瘤/夹层早期无症状，患者无法早期得到及时有效的诊断和干预，未能延缓疾病进展。再次，这些致病性变异携带者往往一旦出现心血管系统表现往往就是心血管系统的危急重症，如主动脉夹层，增加了患者猝死风险。综上所述，就诊难，诊断难，治疗周期长严重威胁患者生命健康。因此，阐明遗传性主动脉瘤/夹层的病因和病理生理过程，对于疾病开展早期预防、早期诊断、早期干预和精准治疗方面均有重大研究意义。
主动脉壁在出生后是持续生长发育的，因此主动脉瘤/夹层只能在出现主动脉扩张后得到诊断。某些存在临床综合征中的胎儿患者，特别是高度怀疑主动脉扩张、智力发育障碍、严重肢体畸形等，如果能在胎儿时期早期发现，可以及早采取措施，在胎儿时期进行主动脉介入手术或者避免胎儿出生。有明确家族性遗传病史的，还可以依据父母的遗传检测结果，采取三代试管婴儿等手段，阻断下一代遗传同样的疾病。目前研究发现MFAP5蛋白结构的改变与遗传性主动脉瘤/夹层息息相关，一系列MFAP5基因突变导致MFAP5蛋白上C-末端的富含半胱氨酸残基(cysteine residues)的区域发生改变，影响早期胚胎发育。
可见，主动脉瘤/夹层的早期发现、早期诊断与鉴别诊断、早期干预治疗和判断预后是十分重要的。因此，探索主动脉瘤/夹层的关键分子对明确主动脉扩张发生的分子机制以及以此为靶点进行辅助分子诊断具有重要意义，有助于主动脉瘤/夹层早期发现、早期诊断和早期治疗。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明公开了与遗传性主动脉瘤/夹层相关的基因标志物及其致病性变异，所述基因标志物为MFAP5。本发明首次发现了位于MFAP5上的一个新致病性变异c.C295T p.R99W(NM_003480)与主动脉瘤/夹层的发生相关，通过斑马鱼模型实验进一步证明了MFAP5 p.R99W致病性变异与主动脉瘤/夹层的发生相关，并且评价了该变异的致病性，提示MFAP5的这个新致病性变异可用于主动脉瘤/夹层的临床诊断。
本发明的目的之一在于提供一种与遗传性主动脉瘤/夹层相关的基因MFAP5。
本发明的目的之二在于提供一种检测MFAP5致病性变异基因和MFAP5基因致病性变异体表达产物的制剂、芯片或试剂盒在主动脉瘤/夹层诊断方面的应用。
本发明的目的之三在于提供一种遗传性主动脉瘤/夹层动物模型及其在评价MFAP5基因变异体的致病性中应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用。
优选的，所述检测产品为制剂、芯片或试剂盒。
优选的，所述产品包括检测MFAP5致病性变异基因或MFAP5基因致病性变异体表达产物的试剂。
优选的，所述MFAP5基因的核苷酸序列为NCBI Reference Sequence:NG_041814；23945bp DNA；具体的，为NCBI Reference Sequence:NG_041814；23945bp DNA；12号染色体；SOURCE：Homo sapiens(human)；具体见表1。
所述MFAP5致病性变异基因在所述核苷酸序列的17347位上存在点突变。
优选的，所述MFAP5致病性变异基因在所述核苷酸序列的17347位上存在由C变为T的点突变，对应的互补核苷酸序列(cDNA)，也就是在295位上存在由胞嘧啶(cytosine，C)变为腺嘌呤(adenine，T)(c.C295T)。
优选的，所述MFAP5基因的正常状态下第17347位附近一段的核苷酸序列为SEQ IDNO.1：gtgcatcggc cggttaaaca atgcattcat cagttatgct tcaccaggta agggatccca。
优选的，所述MFAP5致病性变异基因第17347位附近一段的核苷酸序列为SEQ IDNO.2：gtgcattggc cggttaaaca atgcattcat cagttatgct tcaccaggta agggatccca。
优选的，所述MFAP5基因在正常状态下的表达产物的氨基酸序列为SEQ ID NO.3：
MSLLGPKVLLFLAAFIITSDWIPLGVNSQRGDDVTQATPETFTEDPNLVNDPAT
DETVLAVLADIAPSTDDLASLSEKNTTAECWDEKFTCTRLYSVHRPVKQCIHQ
LCFTSLRRMYIVNKEICSRLVCKEHEAMKDELCRQMAGLPPRRLRRSNYFRLPPCENVDLQRPNGL。
优选的，所述MFAP5基因致病性变异体表达产物的氨基酸序列为SEQ ID NO.4：
MSLLGPKVLLFLAAFIITSDWIPLGVNSQRGDDVTQATPETFTEDPNLVNDPATDETVLAVLADIAPSTDDLASLSEKNTTAECWDEKFTCTRLYSVHWPVKQCIHQLCFTSLRRMYIVNKEICSRLVCKEHEAMKDELCRQMAGLPPRRLRRSNYFRLPPCENVDLQRPNGL，所述氨基酸序列在第99位上存在由精氨酸(Arginine，Arg，R)变异为色氨酸(Tryptophan，Trp，W)。
优选的，所述检测产品中的测试方法包括核酸直接测序、核酸杂交、核酸扩增、核酸探针或免疫检测中的至少一种。
优选的，所述测试方法中试剂包括特异性识别MFAP5致病性变异基因的探针，或特异性扩增MFAP5基因致病性变异体的引物，或特异性结合MFAP5致病性变异体表达产物(变异蛋白)的抗体或配体。
优选的，所述特异性识别MFAP5致病性变异基因的探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.5：AGCATAACTGATGAATGCATTGTTTAACCGGCCGA所示。
优选的，所述的检测产品中的测试方法为核酸扩增时，扩增与如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的抗体或配体。
优选的，所述的检测产品中的测试方法为核酸扩增时，使用如SEQ ID NO.6：TCTATCCTTCCCAATTCCTTC和SEQ ID NO.7：AACTTTGGCCCCATCAAAG所示核苷酸序列的引物。
优选的，所述MFAP5致病性基因与遗传性主动脉瘤/夹层的关系，通过遗传性主动脉瘤/夹层动物模型验证。
优选的，所述遗传性主动脉瘤/夹层动物模型的构建方法为：向培养体系施用MFAP5致病性变异试剂，其中，所述培养体系选自细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
优选的，所述MFAP5致病性变异试剂具针对如SEQ ID NO.8：tccttcccaattccttcaat ccttcattta tgctgcttct atttggacct ccttatttttttgtattggg cttcctcagagtgctgggatgagaaattta cctgcacaag gctctactct gtgcattggc cggttaaaca atgcattcatcagttatgct tcaccaggtaagggatccca gaatgcccaa aaagcatctt ccatggtagt gtttctgtgttgataactat ttaatgagca cccactatggaattgcaaac tttgatgggg ccaaagtttt tagcacaaccctcctagtta ttgctgaatg taccaactag aacctggagtatgggctgaa gtgtacaaag aacaggcaga所示的核苷酸序列。
表1
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有益效果
1、本发明首次发现了MFAP5 p.R99W致病性变异与遗传性主动脉瘤/夹层相关，通过检测MFAP5的特定位点是否发生致病性变异可以判断携带者是否患有主动脉瘤/夹层。
2、本发明提供了一种主动脉瘤/夹层动物模型的构建方法，为评价MFAP5基因致病性，为临床上遗传性主动脉瘤/夹层的研究以及药物的筛选提供了新的手段。
3、本发明通过设计特异性引物和探针、抗体和配体，能够检测MFAP5p.R99W变异情况。本发明人发现，MFAP5 p.R99W致病性变异与遗传性主动脉瘤/夹层息息相关，通过特异性引物和探针、抗体和配体能够检测MFAP5p.R99W位点的变异情况，从而进行辅助分子诊断，通过对基因的致病性变异进行检测，可以在早期发现遗传性主动脉瘤夹层等疾病，从而为患者提供早期治疗的机会，提高治愈率和生存率。。
4、本发明中，通过公开与主动脉瘤夹层相关的基因标志物及其致病性变异，可以为遗传性主动脉瘤/夹层的临床诊断提供依据，促进遗传性主动脉瘤/夹层的早期发现和治疗。同时，该发明也可以推广应用到其他遗传性疾病的诊断和治疗中。
5、本发明可以为遗传性主动脉瘤/夹层和其他心血管系统疾病的研究和治疗提供重要的参考和借鉴，对于保障人类健康和提高生活质量具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一种实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为受试者测序结果和变异位点保守性分析；
图2为斑马鱼MFAP5 WT和MFAP5 MO的背主动脉发育情况；
图3为斑马鱼MFAP5 WT，MFAP5 E4I4-MO+MFAP5 E99K，MFAP5E4I4-MO+MFAP5 WT的背主动脉发育情况。
具体实施方式
实施例1
下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，术语“外显子”一词是指在mRNA加工过程中被保留和翻译成氨基酸的那部分mRNA。内含子是在mRNA加工过程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在，不能被翻译成氨基酸。外显子和内含子都是对于基因而言的。变异既有个体的正常多态性变异，也有致病性的变异。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法对基因及其编码的蛋白进行检测。本领域技术人员应当理解，检测基因的手段不是本发明的重要方面。本发明中的基因使用本领域普通技术人员已知的多种检测技术进行检测。
检测基因致病性变异或蛋白致病性变异的方法包括(但不限于)：CRISPR-Cas9法，PCR-SSCP法、异源双链分析法、变性梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶链反应、等位基因特异性扩增法、直接测序法。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。
本发明中的探针，包括基因组探针(genomic probe)，cDNA探针(cDNA probe)，寡核苷酸探针。标记方式包括：同位素标记、非同位素标记。探针标签类型，包括荧光素、Cy3、DNP、地高辛和生物素。
1、全外显子组测序和Sanger测序验证MFAP5致病性变异
1.1、样品收集
确诊的主动脉瘤/夹层受试者(XY-男性-40岁)。主动脉瘤/夹层的诊断通过心脏超声、数字减影血管造影(DSA)、磁共振成像/血管摄影或计算机断层摄影证实。
1.2、全外显子组测序
1.2.1、提取DNA
使用血基因组DNA提取试剂盒提取受试者外周血全基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计进行DNA定量检测。
1.2.2、全外显子组测序和致病性变异注释
采用超声打断仪(Covaris s2，Massachusetts，USA)将基因组DNA随机打断成主带200-300bp的片段，取500ng提纯的DNA片段进行末端修复并连接上标记性接头，构建DNA测序文库。按照illumina标准建库方法进行3步酶促反应：通过末端修复，加“A”和连接Illumina测序接头(通过PCR反应，将一个8bp的barcode连接至DNA片段上)，形成样本文库。使用SureSelect Human All Exon V6+UTR r2core design(91Mb,Agilent)进行外显子捕获，具体操作参见使用说明。
全外显子组测序使用的试剂盒为SureSelect Human All Exon V6，安捷伦。
使用Illumina HiSeq X-ten platform平台进行测序，使用GATK v4.0检测SNP位点和插入缺失标记，采用ANNOVAR进行注释。
利用生物信息学预测工具预测候选变异的保守性和致病性。所有变异均对比公用数据库1000Genomes Project(http://www.internationalgenome.org/),Exome variantserver,NHLBI GO Exome Sequencing Project(ESP)http://evs.gs.washington.edu/EVS/)，和Exome Aggregation Consortium(ExAC)(http://exac.broadinstitute.org/)，筛选致病性的变异。
1.2.3、Sanger测序验证
使用sanger测序对致病性变异位点进行验证，在ABI3730测序仪上进行Sanger测序。MFAP5的引物序列如下：
正向引物SEQ ID NO.6：5’-TCTATCCTTCCCAATTCCTTC-3’；反向引物SEQ ID NO.7：5’-AACTTTGGCCCCATCAAAG-3’
1.3、结果
结果如图1所示。
图1中，(a)显示Sanger测序表明在受试者携带致病性变异；(B)显示保守性分析，箭头所示，氨基酸序列第99位点在各个物种间呈高度保守。
综合全外显子组测序结果显示，受试者携带MFAP5基因变异c.C295Tp.R99W(NM_003480)。
2、构建MFAP5斑马鱼主动脉发育障碍模型和致病性评价
2.1、构建MFAP5-MO斑马鱼主动脉发育障碍模型
2.1.1、斑马鱼品系繁育
使用斑马鱼fli1a:EGFP品系作为研究对象。
2.1.2、利用Morpholino技术构建MFAP5-MO模型
为了排除特异性，针对某MFAP5基因的mRNA，分别设计两个反义的MO寡聚物，E4I4-MO和ATG-MO。在斑马鱼受精卵1细胞时期卵黄内显微注射4ng MO寡聚物，通过与mRNA结合，阻断MFAP5 mRNA的翻译。
2.1.3、观察主动脉发育状况
观察斑马鱼背主动脉的生长情况，主动脉直径，管腔直径，管壁厚度等，结果见图2。
2.2、评价MFAP5 p.R99W的致病性
2.2.1、构建载体
分别对编码人类MFAP5全长(1-173AA)的MFAP5-WT及其致病性变异株MFAP5-R99W的cDNA进行聚合酶链反应扩增，Sanger测序验证。这些序列被克隆到载体pcDNA3.1 vectorWT和pcDNA3.1 vector MUT(Invitrogen)中；使用的试剂盒为上海生工科技的构建载体的试剂盒
2.2.2、转染并测定主动脉发育状况
在每个胚胎，分别将4ng E4I4-MO和50pg人类MFAP5-WT野生型，4ng E4I4-MO和MFAP5-R99W突变型的cDNA的pcDNA3.1共同注射到单细胞胚胎的卵黄中。观察斑马鱼背主动脉的生长情况，背主动脉直径，管腔直径，管壁厚度等。
2.3、结果
4ng E4I4-MO和MFAP5-R99W共同注射后，显著导致斑马鱼背主动脉(DA)直径减小(p＜0.05)，结果如图3所示(I-L)。
4ng E4I4-MO和50pg人类MFAP5-WT共同注射后，斑马鱼背主动脉直径无明显异常(p＞0.05)，结果如图3所示(M-P)。
需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品为制剂、芯片或试剂盒；所述产品包括检测MFAP5致病性变异基因或MFAP5基因致病性变异体表达产物的试剂；MFAP5基因的核苷酸序列为NCBI Reference Sequence:NG_041814；23945bp DNA，所述MFAP5致病性变异基因在所述核苷酸序列的17347位上存在由C变为T的变异；所述MFAP5基因致病性变异体表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述氨基酸序列在第99位上存在由精氨酸变为色氨酸的变异。
2.根据权利要求1所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述检测产品中的测试方法包括核酸直接测序、核酸杂交、核酸扩增、核酸探针或免疫检测中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述测试方法中试剂包括特异性识别MFAP5致病性变异基因的探针，或特异性扩增MFAP5基因致病性变异体的引物，或特异性结合MFAP5致病性变异体表达产物的抗体或配体。
4.根据权利要求3所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述特异性识别MFAP5致病性变异基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求2所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述的检测产品中的测试方法为核酸扩增时，扩增与如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的抗体或配体。
6.根据权利要求2所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述的检测产品中的测试方法为核酸扩增时，使用如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的引物。
7.根据权利要求1所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述的主动脉瘤/夹层为遗传性主动脉瘤/夹层。
8.根据权利要求7所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述MFAP5致病性基因与遗传性主动脉瘤/夹层的关系，通过遗传性主动脉瘤/夹层动物模型验证。
9.根据权利要求8所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述遗传性主动脉瘤/夹层动物模型的构建方法为：向培养体系施用MFAP5致病性变异试剂，其中，所述培养体系选自细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
10.根据权利要求9所述的MFAP5致病性基因在制备主动脉瘤/夹层检测产品中的应用，其特征在于，所述MFAP5致病性变异试剂具针对如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
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