CN117844903A - 一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：缓冲液，过氧化物酶，苯酚或类似物，防腐剂，有机溶剂1，有机溶剂2；所述R2试剂包含：缓冲液，葡萄糖氧化酶，4‑氨基安替比林，防腐剂。本发明制备的，试剂盒能增加溶液中溶解氧含量，有效消除溶解氧含量变化对高浓度样本检测的影响，提高葡萄糖氧化酶法试剂盒线性，真实反应出病人血清样本中葡萄糖含量，且制备工艺简单，利于产业化，2.具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物诊断试剂领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
葡萄糖是血液中最重要的单糖。血中的葡萄糖称为血糖(Glu)。葡萄糖是人体的重要组成成分，也是能量的重要来源。正常人体每天需要很多的糖来提供能量，为各种组织、脏器的正常运作提供动力。所以血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人血糖的产生和利用处于动态平衡的状态，维持在一个相对稳定的水平。葡萄糖以糖酵解的形式降解。检测葡萄糖的浓度用于对糖代谢紊乱(糖尿病、婴儿性低糖血症、自发性低糖血症以及胰岛细胞癌)的诊断及治疗。
现有技术中检测血糖的主要方法为葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法两种。葡萄糖氧化酶法精确度更高，能够精确特异测量生物样品中葡萄糖浓度，是世界卫生组织推荐也是中国《全国临床检验操作规程指定的临床血糖检测方法》，葡萄糖氧化酶法试剂盒的主要反应原理大都基于Trinder反应模式，具体反应过程原理如下：血清中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化下与水分子和氧分子反应生成葡萄糖酸和双氧水，最后双氧水在过氧化物酶的催化下与色原底物4-氨基安替比林和苯酚反应生成红色化合物醌亚胺。由于醌亚胺在波长500nm处有吸收峰,所以在一定底物浓度范围内500nm处吸光度的变化值与样本中葡萄糖的含量成正比。
氧化酶法测葡萄糖特异性高于己糖激酶法，但氧化酶法容易受溶液中氧含量变化的干扰，高浓度样本线性做不好，导致高浓度样本可能测试不准确，影响临床判定。因此，需要调整葡萄糖氧化酶法试剂盒的组分，使得其在高浓度反应时仍能准确测量，减少氧含量对样本检测的影响，保证高浓度样本反应的准确性，能真实地反映人血清样本中葡萄糖水平。
发明内容
为克服现有技术缺陷，本发明采用了以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：缓冲液，过氧化物酶，苯酚或类似物，防腐剂，有机溶剂1，有机溶剂2；所述R2试剂包含：缓冲液，葡萄糖氧化酶，4-氨基安替比林，防腐剂；
进一步的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，其pH为6.5～7.5；进一步优选的，所述缓冲液浓度为40～60mmol/L；
进一步的，过氧化物酶占所述试剂盒浓度1KU/L～10KU/L；
进一步的，所述苯酚或类似物选自苯酚、对氯苯酚、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐中的任意一种或几种；进一步优选的，所述苯酚或类似物浓度为3～6mmol/L；
进一步的，所述防腐剂为叠氮钠(NaN3)；进一步优选的，所述防腐剂占所述试剂盒质量百分含量的0.1～1.0％；
进一步的，所述有机溶剂1为N,N-二甲基甲酰胺；进一步优选的，所述有机溶剂1其占所述试剂盒质量百分含量的3～15％；
进一步的，所述有机溶剂2所述有机溶剂2选自二氧六环、丙酮、甲醇中的任意一种或几种；进一步优选的，所述有机溶剂2占试剂盒质量百分含量的2～10％；
进一步的，所述葡萄糖氧化酶占所述试剂盒浓度的100～150KU/L；
进一步的，所述4-氨基安替比林占所述试剂盒浓度的1～10mmol/L；
本发明的第二方面提供了上述任一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
有益效果
1.本发明通过在溶液中添加特定的有机溶剂1(N,N-二甲基甲酰胺)与有机溶剂2(二氧六环、丙酮、甲醇等)组合，能增加溶液中溶解氧含量使高浓度样本在检测时不会出现底物耗尽的情况导致反应曲线呈下降趋势，能有效消除溶解氧含量变化对高浓度葡萄糖样本检测的影响使化学反应能持续发生，提高葡萄糖氧化酶法试剂盒线性，真实反应出病人血清样本中葡萄糖含量，反应原理如下：
葡萄糖+O2+H2O+葡萄糖氧化酶→葡萄糖酸+H2O2
H2O2+苯酚+4-氨基安替比林+过氧化物酶→醌亚胺+H2O；
2.本发明的制备原料及制备工艺简单，利于实施和工业化生产，能够准确检测血糖浓度，有利于糖代谢紊乱、糖尿病、婴儿性低糖血症、自发性低糖血症以及胰岛细胞癌的诊断及治疗，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1：实施例3和对比例1、2、3四组试剂检测高值血样本1线性图对比
图2：实施例3和对比例1、2、3四组试剂检测高值血样本2线性图对比
图3：实施例1检测高值样本在高浓度时反应曲线图
图4：比对例1、2、3检测高值样本在高浓度时反应曲线图
具体实施方式
实施例1：
一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：pH为7.0、浓度为40mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度2KU/L过氧化物酶、浓度为3mmol/L对氯苯酚、0.5wt％叠氮钠(NaN3)、3wt％N,N-二甲基甲酰胺及2wt％二氧六环；R2试剂包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度100KU/L葡萄糖氧化酶、浓度1mmol/L 4-氨基安替比林以及0.2％叠氮钠(NaN3)；制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
实施例2：
一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：pH为7.0、浓度为60mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度8KU/L过氧化物酶、浓度为6mmol/L 2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠、1.0wt％叠氮钠(NaN3)、15wt％N,N-二甲基甲酰胺及10wt％二氧六环；R2试剂包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度150KU/L葡萄糖氧化酶、浓度10mmol/L 4-氨基安替比林以及1.0％叠氮钠(NaN3)；制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
实施例3：
一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度5KU/L过氧化物酶、浓度为4mmol/L苯酚、0.5wt％叠氮钠(NaN3)、3wt％N,N-二甲基甲酰胺及3wt％二氧六环；R2试剂包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度120KU/L葡萄糖氧化酶、浓度2mmol/L4-氨基安替比林以及0.5％叠氮钠(NaN3)；制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
对比例1：
一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度5KU/L过氧化物酶、浓度为4mmol/L苯酚、0.5wt％叠氮钠(NaN3)；R2试剂包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度120KU/L葡萄糖氧化酶、浓度2mmol/L 4-氨基安替比林以及0.5％叠氮钠(NaN3)；制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
对比例2：
一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度5KU/L过氧化物酶、浓度为4mmol/L苯酚、0.5wt％叠氮钠(NaN3)、3wt％甲醇及2wt％二氧六环；R2试剂包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度120KU/L葡萄糖氧化酶、浓度2mmol/L 4-氨基安替比林以及0.5％叠氮钠(NaN3)；制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
对比例3：
一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度5KU/L过氧化物酶、浓度为4mmol/L苯酚、0.5wt％叠氮钠(NaN3)、2wt％N,N-二甲基甲酰胺及3wt％二氧六环；R2试剂包含：pH为7.0、浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度120KU/L葡萄糖氧化酶、浓度2mmol/L4-氨基安替比林以及0.5％叠氮钠(NaN3)；制备方法，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
对于实施例1与对比例1、对比例2、对比例3。同时检测从医院收集回的葡萄糖高浓度血清配制成的线性样本，计算(0.00～5.00mmol/L)区间绝对偏差；[5.00～35.00mmol/L]相对偏差。
具体实验事项如下：检测参数以全日立全自动生化分析仪7180上为例，主波长为500nm(或附近)；副波长660nm(或附近)；吸光度范围0～3.2A；比色杯光径为1.0cm。试剂加样比见表1：
表1各试剂加样比
注意事项：①本试剂盒默认单位为：mmol/L。②校准曲线的绘制：采用Linear 2点校准曲线定标法，以空白样本定值为0.00mmol/L，对校准品测定相应的△A，以△A为Y轴，浓度为X轴。在自动分析仪上，采用Linear 2点建立校准曲线。计算时根据样本的△A值在校准曲线上找到相应的浓度。③样品中葡萄糖浓度按下述公式计算：葡萄糖
④：试剂和样本用量可以按仪器要求进行增减。⑤：本产品引进相关的质控体系作为参考。各实验室测定值可能有所不同，但所测定值必须在给定的范围内。如果超出范围，请于生产厂家联系。⑥样本中若葡萄糖含量超出线性范围，请用生理盐水稀释后测定，结果乘以稀释倍数。⑦实施例1与对比例1、2、3的葡萄糖氧化酶法测定试剂盒的参考范围均是健康成年人，空腹血清葡萄糖为3.9～6.1mmol/L.
在日立全自动生化分析仪7180上检测结果如表2所示：
表2-1 4组试剂盒检测高值血样本1结果
表2-2 4组试剂盒检测高值血样本1平均值结果
取均值作图形成线性图如图1所示。
表3-1 4组试剂盒检测高值血样本2结果
表3-2 4组试剂盒检测高值血样本2平均值结果
取均值作图形成线性图如图2所示。
实施例1在检测高浓度葡萄糖样本时的反应曲线如图3所示，反应时不会出现底物耗尽导致高浓度葡萄糖样本检测不出的情况。
对比例1/2/3在检测高难度葡萄糖样本时的反应曲线如图4所示，反应时会出现底物耗尽导致高浓度葡萄糖样本检测不出的情况。
通过上述试剂配制及检测样本处理数据，得出，本实施例1与对比例1相比，检测葡萄糖高浓度线性样本情况明显改善，通过在葡萄糖氧化酶法测定试剂盒中添加百分含量在3～15％的有机溶剂1(N,N-二甲基甲酰胺)与添加百分含量在2～10％的有机溶剂2(二氧六环、丙酮、甲醇等)能有效消除试剂中溶解氧含量变化对高浓度样本检测的影响。明显改善试剂盒高浓度样本线性，真实反应出病人血清样本中葡萄糖含量，由实施例看高浓度葡萄糖样本线性得到明显改善；其次，本发明的制备条件及制备工艺简单，利于实施和工业化生产，能够准确检测血糖浓度，有利于糖代谢紊乱、糖尿病、婴儿性低糖血症、自发性低糖血症以及胰岛细胞癌的诊断及治疗，具有良好的市场应用前景。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，均在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1包含：缓冲液，过氧化物酶，苯酚或类似物，防腐剂，有机溶剂1，有机溶剂2；所述R2试剂包含：缓冲液，葡萄糖氧化酶，4-氨基安替比林，防腐剂。
2.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，其pH为6.5～7.5；进一步优选的，所述缓冲液浓度为40～60mmol/L。
3.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述过氧化物酶占所述试剂盒浓度1KU/L～10KU/L。
4.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述苯酚或类似物选自苯酚、对氯苯酚、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐中的任意一种或几种；进一步优选的，所述苯酚或类似物浓度为3～6mmol/L。
5.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠(NaN3)；进一步优选的，所述防腐剂占所述试剂盒质量百分含量的0.1～1.0％。
6.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述有机溶剂1为N,N-二甲基甲酰胺；进一步优选的，所述有机溶剂1占所述试剂盒质量百分含量的3～15％。
7.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述有机溶剂2选自二氧六环、丙酮、甲醇中的任意一种或几种；进一步优选的，所述有机溶剂2占所述试剂盒质量百分含量的2～10％。
8.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中，所述葡萄糖氧化酶占所述试剂盒浓度的100～150KU/L。
9.根据权利要求1所述葡萄糖氧化酶法检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中，所述4-氨基安替比林占所述试剂盒浓度的1～10mmol/L。
10.一种权利要求1～9任一项葡萄糖氧化酶法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：按上述配比将各组份精确量取后充分混合均匀后，即得。
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