CN117844824A - 水稻OsSPL10基因在调控水稻穗发芽中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻OsSPL10基因在调控水稻穗发芽中的应用，属于分子生物学、植物基因工程技术领域；利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsSPL10基因，构建OsSPL10基因靶位点特异性敲除的重组表达载体，以日本晴(Nipponbare，NIP)为背景，转基因获得OsSPL10基因功能缺陷型突变的三种纯合突变体株系ospl10‑1、ospl10‑2、ospl10‑3；在培养箱设置的高温高湿环境下开展了穗发芽模拟实验，发现OsSPL10突变材料的穗发芽抗性显著高于野生型。本发明提供了一种提高水稻穗发芽抗性的方法，可以加快抗穗发芽水稻新品种的培育过程。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学、植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsSPL10基因在调控水稻穗发芽中的应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，全国约有60％人口以稻米为主食，保证水稻安全生产对保障我国粮食安全和农业发展中意义重大。良好的种子萌发与水稻的出苗率、苗期的整齐程度以及幼苗健壮程度直接相关。穗发芽是一种特殊的萌发现象，即种子在收获前在母体上萌发出芽。在中国、印度、日本等世界水稻主产地都有穗发芽现象的发生。尤其在我国南方稻区，水稻成熟期与收获期高温多雨天气频发，穗发芽危害更为严重。穗发芽现象不仅影响水稻的种用价值，还严重影响了水稻的产量、贮藏和加工品质。除气候因素外，水稻品种的自身遗传特性也是影响穗发芽情况的关键因素之一。因此，针对性地选育和创制抗穗发芽种质是解决水稻穗发芽最经济有效途径之一，越来越受到育种家的重视。
目前，水稻穗发芽相关研究进展总体较为缓慢，主要表现为具有育种利用价值的抗穗发芽基因较少，且遗传调控网络仍不清晰。因此，挖掘新的穗发芽抗性相关基因，并将其快速应用于水稻穗发芽抗性改良，可以有效解决水稻生产中穗发芽严重的问题，对保障我国粮食安全具有重要意义。CRISPR/Cas9系统是近几年逐步成熟的一种定点基因组编辑工具，可以通过对植物自身基因的快速、定点改变，实现对作物性状的精准改良。
发明内容
本发明提供一种通过基因编辑技术培育抗穗发芽水稻的方法。该方法以NIP为受体材料，利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsSPL10基因，构建OsSPL10基因敲除重组载体，以农杆菌介导法转化受体材料NIP的水稻愈伤组织，经筛选和分子鉴定后，获得纯合突变株系，用其穗子进行试验，测定发芽率及发芽时间，验证得出筛选的OsSPL10敲除纯合突变体水稻植株在抗穗发芽方面有一定增强。
本发明采用如下技术方案，
一种水稻OsSPL10蛋白，所述水稻OsSPL10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种水稻OsSPL10基因，所述水稻OsSPL10基因编码权利要求1所述的水稻OsSPL10蛋白，所述水稻OsSPL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
本发明还提供上述的蛋白或上述的基因在调控水稻穗发芽中的应用。
进一步的，所述调控水稻穗发芽为降低水稻穗发芽率。
进一步的，构建靶位点特异性敲除的CRISPR/Cas9编辑载体，将构建的CRISPR-Cas9-OsSPL10载体转化到农杆菌中，通过筛选获得含有此CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌；基因工程菌转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：将筛选获得含有CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌转入待基因编辑的受体水稻愈伤组织中，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；所得转基因植株的水稻穗在设置的高温高湿环境下穗发芽率降低。
进一步的，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的水稻OsSPL10基因第1个外显子的111bp-130bp处，gRNA靶位点序列为：为5’-GATGAGCGGTAGGATGAACG-3’。
进一步的，扩增引物序列为：
F序列：5'-ggcaGATGAGCGGTAGGATGAACG-3'，
R序列：5'-aaacCGTTCATCCTACCGCTCATC-3'。
进一步的，鉴定引物序列为：
F序列：GACAACCAACACGCCAATA；
R序列：GCCGCGAAGTCCAAGC。
本发明还提供一种培育抗穗发芽水稻的方法，其特征在于，在水稻中敲除上述的水稻OsSPL10基因，所得转基因水稻与所述目的水稻相比，水稻穗发芽降低。
本发明还提供一种通过基因编辑技术培育抗穗发芽水稻的方法，利用CRISPR/Cas9基因工程技术对水稻OsSPL10基因进行定向编辑，将OsSPL10基因靶位点特异性敲除的CRISPR-Cas9-OsSPL10载体转化到受体水稻品种中，并筛选得到转基因改良水稻植株，以调控水稻的穗发芽，具体过程为：
(1)构建CRISPR-Cas9-OsSPL10载体：针对OsSPL10基因，构建靶位点特异性敲除的CRISPR/Cas9编辑载体，基因编辑靶点设计如图1所示；
(2)构建工程菌：将构建的CRISPR-Cas9-OsSPL10载体转化到农杆菌中，通过筛选获得含有此CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌；
(3)基因工程菌转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：将筛选获得含有CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌转入待基因编辑的受体水稻愈伤组织中，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；
(4)利用OsSPL10测序-F特异引物和OsSPL10测序-R特异引物，扩增过程3获得的转基因水稻植株的基因组片段，测序，筛选水稻突变植株；
进一步限定，水稻OsSPL10其特征在于，位于水稻Chr6染色体上，坐标为27114985-27117417，CDS长1281bp，序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步限定过程(1)，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的水稻OsSPL10基因第1个外显子的518bp-539bp处，gRNA靶位点序列为：为5’-GATGAGCGGTAGGATGAACG-3’，如SEQ ID NO.3所示，设计对应引物F序列：5'-ggcaGATGAGCGGTAGGATGAACG-3'，如SEQ ID NO.4所示，R序列：5'-aaacCGTTCATCCTACCGCTCATC-3'，如SEQ ID NO.5所示。pC1300-Cas9载体用Kpn I和BamH I进行酶切，gRNA用Kpn I和Bgl II进行酶切并回收gRNA片段，并将gRNA片段连接pC1300-Cas9载体上，构建敲除重组载体CRISPR-Cas9-OsSPL10；
进一步限定过程(2)，其特征在于，将构建的CRISPR-Cas9-OsSPL10载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素筛选，获得含有此CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌；
进一步限定过程(3)，其特征在于，用含有CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的农杆菌EHA105侵染以日本晴(Nipponbare，NIP)为背景的水稻愈伤组织，并于28℃培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养；经过3-4周培养后，获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田，筛选获得OsSPL10基因功能缺陷型突变的T0代阳性植株。
进一步限定过程(4)，所述OsSPL10测序-F特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，即GACAACCAACACGCCAATA。所述OsSPL10测序-R特异引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，即GCCGCGAAGTCCAAGC。获得的T1代OsSPL10突变体，共有3种突变类型，命名为敲除突变体株系osspl10-1、osspl10-2、osspl10-3，如图3所示，均导致蛋白翻译提前终止。
有益效果
本发明通过构建OsSPL10基因的敲除载体，采用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织获得OsSPL10基因的敲除水稻植株，并通过测序筛选到敲除纯合水稻株系，进行穗发芽验证试验，测定发芽率。首次提出了OsSPL10基因对水稻穗发芽方面的影响。水稻SPL转录因子家族基因OsSPL10的敲除突变株系相较于野生型NIP表现出穗发芽现象推迟的现象，说明OsSPL10是控制水稻穗发芽的重要因子之一。转化载体可以应用于水稻抗穗发芽性状改良，在作物育种领域具有重要应用价值，对预防水稻减产降质有积极意义。
附图说明
图1为OsSPL10基因的序列分析及基因编辑靶点设计；
图2为OsSPL10转基因植株及野生型靶位点测序图；
图3为osspl10-1～osspl10-3突变体氨基酸变化示意图；
图4为OsSPL10转基因植株与野生型植株的穗发芽情况；
图5为OsSPL10转基因植株与野生型植株的穗发芽率统计图。
具体实施方式
以下对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的实施方式并不局限于此。凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的的保护范围。
实施例1
1、水稻OsSPL10基因敲除载体的构建
1)确定靶位点序列。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则，以PAM位点为NGG的目标序列作为敲除靶位点，在OsSPL10基因的第1个外显子的111bp-130bp处，确定gRNA靶位点序列为5’-GATGAGCGGT AGGATGAACG-3’(SEQ ID NO.3)，基因编辑靶点设计如图1所示；
2)设计对应引物F、R序列。F序列为
5'-ggcaGATGAGCGGTAGGATGAACG-3'(SEQ ID NO.4)，R序列为
5'-aaacCGTTCATCCTACCGCTCATC-3'(SEQ ID NO.5)；
3)中间载体构建
A.SK-gRNA载体进行Aar I酶切(Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体，具体酶切体系如下表1所示；
| 成分 | 加入量 |
| 10×buffer AarI | 2ul |
| 50×oligonudeotide | 0.4ul |
| Aar I | 0.6ul |
| SK-gRNA | 8ul |
| ddH20 | 9ul |
B.F与R引物混合后95℃下变性5min、退火30S，形成互补双链DNA，用于后续载体的构建；
C.将酶切后的SK-gRNA载体和上述B步骤DNA片段在22℃下连接1h，之后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到中间载体，具体连接体系如下表2所示；
D.利用公共引物T7或T3进行测序检测，验证是否正确。
4)C过程所得中间载体用限制性内切酶Kpn I和Bgl II在37℃下进行酶切30min，并回收片段，具体酶切体系如下表3所示：
| 成分 | 加入量 |
| 步骤3所得中间载体 | 10ul |
| Kpn I | 0.5ul |
| Bgl II | 0.5ul |
| 2×buffer | 2ul |
| ddH20 | 7ul |
5)用限制性内切酶Kpn I和BamH I在37℃下酶切pC1300-Cas9载体30min，酶切体系如下表4所示：
| 成分 | 加入量 |
| pC1300-Cas9 | 10ul |
| Kpn I | 0.5ul |
| BamH I | 0.5ul |
| 2×buffer | 2ul |
6)将步骤4所得片段和步骤5酶切的pC1300-Cas9载体混合30min进行连接，获得含有所述靶位点序列的最终载体，具体连接体系如下表5所示：
| 成分 | 加入量 |
| pC1300-Cas9(步骤5产物) | 1.5ul |
| SK-gRNA(步骤4产物) | 7ul |
| 10x T4 DNA Iigase buffer | 1ul |
| T4连接酶 | 0.5ul |
连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，菌落PCR检测出阳性克隆，经鉴定和测序确认敲除重组载体构建成功。
2、OsSPL10基因敲除水稻的遗传转化及筛选
1)转愈伤。采取冻融法将构建的敲除重组载体CRISPR-Cas9-OsSPL10转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌，浸染日本晴NIP水稻愈伤组织；
2)筛选抗性愈伤。将上述愈伤于22℃培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养，经过3-4周培养后，获得抗性愈伤；
3)将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田，筛选获得OsSPL10基因功能缺陷型突变的T0代阳性植株。
4)测序鉴定。对敲除水稻进行测序鉴定，OsSPL10测序-F特异引物的核苷酸序列为：GACAACCAACACGCCAATA，如SEQ ID NO.6所示，OsSPL10测序-R特异引物的核苷酸序列为：GCCGCGAAGTCCAAGC，如SEQ ID NO.7所示。
5)序列对比。测序结果采用Snap Gene软件分析，并进行预期基因序列比对。测序结果分析筛选到3株纯合突变体，分别命名为osspl10-1、osspl10-2、osspl10-3。其中osspl10-1在编辑靶序列第17bp处缺失一个碱基‘A’，osspl10-2在编辑靶序列第16-17bp处缺失‘GA’，osspl10-3在编辑靶序列第14-18bp处‘ATGAA’变‘C’，以上三种突变体及对照型NIP水稻序列如图2所示。如图3所示，3个突变体均导致OsSPL10蛋白翻译提前终止。
3、水稻穗发芽实验
1)选取成熟度、长势等条件尽可能一致的转基因型植株osspl10-1、osspl10-2、osspl10-3及野生对照NIP的各15个穗子，统一流水清洗3次；
2)对以上水稻穗子进行统一浸水处理，模拟大田高温多雨环境，于光温适宜的培养箱中处理，以芽长漏出1mm为发芽标准，每12小时统计一次穗发芽情况，计算发芽率(Germination percentage，GP)，共统计8天；
3)结果如图4、5所示，敲除突变体osspl10-1、osspl10-2、osspl10-3的穗发芽率相对于野生型的59.70％分别降低了25.55％、49.26％、18.15％，均显著低于对照NIP，表现出穗发芽现象迟于野生型的特点，说明OsSPL10基因参与调控水稻穗发芽，靶向敲除OsSPL10基因会使得水稻抗穗发芽能力增强，为延缓水稻穗发芽方面的研究提供了新方向。
SEQ ID NO.1MMSGRMNAAGDESPFPFGAMQAPGPGAYVGFDHGAAAVAAAAAAAQRAGMLQHHHHHMYDGLDFAAAMQFGGGQDAPPHPQLLALPPSMAAPPPPPMPMPLQMPMTMPMPGDVYPALGIVKREGGGGGQDAAAGRIGLNLGRRTYFSPGDMLAVDRLLMRSRLGGVFGLGFGGAHHQPPRCQAEGCKADLSGAKHYHRRHKVCEYHAKASVVAASGKQQRFCQQCSRFHVLTEFDEAKRSCRKRLAEHNRRRRKPAAAATTAVAAAKDAAAAPVAAGKKPSGGAATSYTGDNKNVVSMSAAKSPISSNTSVISCLPEQGKHAAAAARPTALTLGGAPPHESSAPQIGAMLHHHHHHQQDHMQVSSLVHINGGGGGGSNNILSCSSVCSSALPSTATNGEVSDQNNDNSHNNGGNNNNMHLFEVDFM
SEQ ID NO.2
ATGATGAGCGGTAGGATGAACGCGGCGGGGGACGAGTCGCCGTTCCCGTTCGGGGCGATGCAGGCGCCGGGGCCGGGGGCGTACGTCGGGTTCGACCATGGCGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCTGCGGCGGCGCAGCGGGCGGGGATGCTGCAGCACCACCACCACCACATGTACGACGGCTTGGACTTCGCGGCGGCGATGCAGTTCGGCGGCGGGCAGGACGCGCCGCCGCACCCGCAGCTGCTGGCGCTGCCGCCGAGCATGGCGGCGCCGCCGCCGCCGCCCATGCCGATGCCGCTGCAGATGCCCATGACGATGCCGATGCCCGGAGACGTGTACCCGGCGCTCGGCATCGTGAAGCGCGAGGGCGGGGGCGGAGGTCAGGACGCCGCCGCCGGGAGGATCGGGCTCAACCTCGGCCGCCGGACCTACTTCTCCCCCGGCGACATGCTCGCCGTCGACCGCCTCCTCATGCGCTCCCGCCTCGGCGGCGTGTTCGGCCTCGGCTTCGGCGGCGCCCACCACCAGCCACCTCGCTGCCAGGCCGAGGGCTGCAAGGCCGACCTCTCCGGCGCCAAGCACTACCACCGCCGCCACAAGGTCTGCGAGTACCACGCCAAGGCCTCCGTCGTCGCCGCCTCCGGCAAGCAGCAGCGCTTCTGCCAGCAATGCAGCAGGTTTCACGTGCTCACGGAGTTTGATGAGGCCAAGAGGAGCTGCCGGAAGCGGCTGGCGGAGCACAACCGTCGCCGGCGGAAGCCGGCGGCGGCGGCGACGACCGCCGTGGCGGCGGCCAAGGACGCGGCGGCGGCGCCGGTAGCCGCCGGGAAGAAGCCTAGCGGCGGCGCCGCCACGTCTTACACCGGTGACAACAAGAACGTGGTGTCCATGAGCGCGGCCAAGTCGCCCATCTCGTCGAACACCAGCGTGATCAGCTGCCTGCCCGAGCAGGGCAAGCATGCGGCGGCGGCGGCGAGGCCGACGGCGCTCACGCTCGGCGGCGCGCCGCCGCACGAGAGCTCCGCGCCGCAGATCGGCGCCATGCTCCATCACCACCACCATCACCAGCAAGACCACATGCAGGTGAGCTCCCTGGTCCACATCAATGGCGGCGGCGGCGGCGGTAGCAACAACATCTTGTCGTGCTCGTCGGTGTGCTCCAGCGCGCTGCCGTCGACGGCGACCAACGGCGAGGTATCAGACCAGAACAACGACAACAGCCACAACAATGGCGGCAACAACAACAACATGCATCTGTTCGAGGTCGACTTCATGTAG
SEQ ID NO.3
gatgagcggt aggatgaacg 20
SEQ ID NO.4
ggcagatgag cggtaggatg aacg 24
SEQ ID NO.5
aaaccgttca tcctaccgct catc 24
SEQ ID NO.6
gacaaccaac acgccaata 19
SEQ ID NO.7
gccgcgaagt ccaagc 16
Claims (10)
1.一种水稻OsSPL10蛋白，其特征在于，所述水稻OsSPL10蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种水稻OsSPL10基因，其特征在于，所述水稻OsSPL10基因编码权利要求1所述的水稻OsSPL10蛋白，所述水稻OsSPL10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
4.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在调控水稻穗发芽中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述调控水稻穗发芽为降低水稻穗发芽率。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，构建靶位点特异性敲除的CRISPR/Cas9编辑载体，将构建的CRISPR-Cas9-OsSPL10载体转化到农杆菌中，通过筛选获得含有此CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌；基因工程菌转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：将筛选获得含有CRISPR-Cas9-OsSPL10载体的基因工程菌转入待基因编辑的受体水稻愈伤组织中，通过潮霉素筛选，再生获得转基因水稻植株；所得转基因植株的水稻穗发芽率降低。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的水稻OsSPL10基因第1个外显子的111bp-130bp处，gRNA靶位点序列为：5’-GATGAGCGGTAGGATGAACG-3’。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，扩增引物序列为：
F序列：5'-ggcaGATGAGCGGTAGGATGAACG-3'，
R序列：5'-aaacCGTTCATCCTACCGCTCATC-3'。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，鉴定引物序列为：
F序列：GACAACCAACACGCCAATA；
R序列：GCCGCGAAGTCCAAGC。
10.一种培育抗穗发芽水稻的方法，其特征在于，在水稻中敲除权利要求2所述的水稻OsSPL10基因，所得转基因水稻与所述目的水稻相比，水稻穗发芽降低。
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