CN117844701A - 降解秸秆的蜡样芽孢杆菌bj-2及芽孢杆菌bj-2菌剂制备方法 - Google Patents

降解秸秆的蜡样芽孢杆菌bj-2及芽孢杆菌bj-2菌剂制备方法 Download PDF

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降解秸秆的蜡样芽孢杆菌BJ‑2及芽孢杆菌BJ‑2菌剂制备方法，本发明涉及一种降解秸秆的蜡样芽孢杆菌及其菌剂制备方法。本发明降解秸秆的蜡样芽孢杆菌BJ‑2保藏编号为CCTCC NO：M 2023950。蜡样芽孢杆菌BJ‑2的菌剂制备方法一、获得菌种；二、获得种子液；三、将种子液加入到1000g液体培养基中，并把营养液加入到上述液体培养基中，在摇床内培养发酵。本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BJ‑2，在短时间内有效降解秸秆残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，溶液中秸秆去除率达到63％以上。使用芽孢杆菌BJ‑2生产制备得到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理土壤等环境中秸秆造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。

Description

降解秸秆的蜡样芽孢杆菌BJ-2及芽孢杆菌BJ-2菌剂制备方法
技术领域
本发明涉及一种降解秸秆的蜡样芽孢杆菌及其菌剂制备方法。
背景技术
秸秆是成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，通常指麦秆、玉米秆、高粱秆、稻草、豆秆和其它农作物(通常为粗粮)在收获籽实后的剩余部分。焚烧秸秆会产生固体颗粒物，对局部地区特殊时段的PM2.5浓度有一定贡献率，对城乡生态环境和居民身心健康都带来严重威胁。
木质素(Lignin)是秸秆主要成分之一，是一类复杂的有机聚类物，其在维管植物和一些藻类的支持组织中形成重要的结构材料。木质素在细胞壁的形成中是特别重要的，特别是在木材和树皮中，因为它们赋予刚性并且不容易腐烂。在化学上，木质素是交叉链接的酚聚合物。
木质素是由苯丙烷单元通过碳-碳键和醚键连接而成的无定形聚合物，是植物界中储量仅次于纤维素的第二大生物质资源。作为典型的生物质材料，木质素是芳香族化合物中少有的可再生资源之一。木质素作为植物界继纤维素之后第二大资源的生物质材料，全球每年产量约5000万吨，其中源自农业残留物的木质素约占10％～20％，源自森林生物质材料的木质素约占20％～30％，来源甚广且产量巨大。因此，研究解决木质素残留问题对扩大它在生产上应用，减少对后茬作物及环境造成的污染具有重要意义。
近年来，生物修复(Bioremediation)理论渐渐成为大家关注的焦点，生物修复技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点已成为处理环境中有机污染物的有效措施。目前大量研究证明利用微生物的代谢途径可以降解秸秆，其中投加高效降解菌株是生物修复中最常见最有效的一种方法。微生物降解秸秆残留依靠自然力量，不产生二次污染。通过筛选高效秸秆降解菌株，将其经过发酵加工成菌剂，应用于秸秆残留降解，从而达到消除土壤、水体、农产品中秸秆残留。
发明内容
本发明提供了一种降解秸秆的蜡样芽孢杆菌BJ-2及芽孢杆菌BJ-2菌剂制备方法。
本发明降解秸秆的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BJ-2保藏编号为CCTCC NO：M2023950，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年6月5日。
上述蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌剂制备方法按照以下步骤进行：
一、将蜡样芽孢杆菌BJ-2接种于LB液体培养基中，65℃、180rpm条件下振荡培养至对数生长期，以pH为7.0的磷酸盐磷酸盐缓冲溶液清洗，获得菌种；
二、将步骤一获得的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶培养基，65～70℃、150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；其中每100mL种子瓶培养基按重量百分比由0.3～0.5％蔗糖、0.04～0.08％MgSO4·7H2O、0.15～0.2％K2HPO4、0.08～0.1％NaCl、0.05～0.07％KH2PO4、0.15～0.2％酵母膏和余量水组成，调pH为7.0；
三、将15～20mL步骤二制备得到的种子液加入到1000g液体培养基中，并把15～20mL的营养液加入到上述1000g的液体培养基中，在65～70℃条件下摇床内培养发酵12～48h，即得蜡样芽孢杆菌BJ-2制剂；其中液体培养基是将15g蛋白胨、酵母粉4g、磷酸氢二钠2.52g和磷酸二氢钾0.28g加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0；每100mL营养液组成按重量百分比由蔗糖0.5～0.7％、KH2PO4 0.08～0.1％、MgSO4·7H2O 0.08～0.1％、K2HPO4 0.18～0.2％、NaCl 0.1～1.2％、酵母粉0.8～1.0％和余量水组成。
本发明的菌株经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株在在LB固体平板培养基上生长很快，菌落高出表面，光滑而黏湿，两端钝圆的大杆菌，能够形成链条状排列，并在生长的6h内形成椭圆形芽孢，位于菌体中心，灰白色，不透明，表面粗糙的菌落，其形态似蜡，均匀浑浊生长。本发明所述菌株革兰氏阴性，能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不液化明胶，不产生吲哚，不形成H2S，能分解利用柠檬酸，分解尿素，赖氨酸鸟氨酸呈阴性，ONPG、精氨酸、氧化酶呈阴性，在普通无机盐培养基上易生长。
本发明的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BJ-2，在短时间内有效降解秸秆残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，溶液中秸秆去除率达到63％以上。使用芽孢杆菌BJ-2生产制备得到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理土壤等环境中秸秆造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。
本发明降解秸秆的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BJ-2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学(邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2023950，保藏日期为2023年6月5日。
附图说明
图1为BJ-2生长对数期；
图2为菌落形态图如所示；
图3为显微镜40x照片；
图4为显微镜100x照片；
图5为BJ-2电镜照片。
图6为PCR电泳条带照片；
图7为构建系统发育树如所示。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式降解秸秆的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BJ-2保藏编号为CCTCC NO：M 2023950，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年6月5日。
本实施方式降解秸秆的蜡样芽孢杆菌BJ-2(降解菌BJ-2)的分离与鉴定
1、降解菌BJ-2的分离与筛选
称取长期食用秸秆牛的粪便(2023年3月10日来自吉林省公主岭市东北地理所试验站)10.0g于250mL三角锥形瓶中，加入100mL无机盐培养基，三角锥形瓶置于摇床(65℃，180rpm)上培养7d，取5mL培养液，加入100mL分离培养基，三角锥形瓶置于摇床(65℃，180rpm)上培养7d，取10mL培养液接种至新鲜分离培养基中，然后在65℃摇瓶培养7d，依次类推5次接种。
每次接种前将浑浊的分离培养基菌悬液逐级稀释成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6 5个系列稀释液，每个稀释液都用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，65℃培养两天，根据其不同的外观形态和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形态特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。
根据降解效果，最终获得一个编号为BJ-2的菌株，命名为降解菌BJ-2，该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50.0mg/L的秸秆在7d降解63.2％。
HPLC测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent)；检测器：Agilent1260紫外检测器(美国Agilent)；色谱柱：C18反相柱(Waters,150mm×4.60mm,5μm)；流动相为甲醇∶水60∶40，V/V)，流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长：222nm；进样量：10μL。
降解率计算方法如下：
上述实施例中使用的培养基如下：
无机盐培养基(MSM)：NaCl 1.0g、K2HPO4 1.5g、KH2PO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、蔗糖1g，溶解于1000mL蒸馏水，pH＝7.0，高压蒸汽灭菌121℃，30min；
分离培养基：NaCl 1.0g、K2HPO4 1.5g、KH2PO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2g、蔗糖1g，按实验设计要求添加不同浓度秸秆以及滤纸条作为氮源，以蒸馏水补足1000mL，调节pH为7.0(固体分离纯化培养基(AMSM)添加20g琼脂)。
以上培养基均在高压锅中121℃灭菌30min。培养基中，30℃，150rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种。
2、降解菌BJ-2的鉴定
(1)降解菌BJ-2的形态学鉴定
将处于对数生长期，BJ-2生长对数期如图1所示，且菌落大小稳定，上述分离并纯化得到的降解菌BJ-2进行单菌落状态描述，菌落形态图如图2所示，上述分离并纯化得到的降解菌BJ-2在LB固体平板培养基上生长很快，光滑而黏湿，两端钝圆的大杆菌，能够形成链条状排列，并在生长的6h内形成椭圆形芽孢，位于菌体中心，灰白色，不透明，表面粗糙的菌落，其形态似蜡，均匀浑浊生长，粘稠易挑取，电镜观察为表面不光滑，其中图3为显微镜40x照片，图4显微镜100x照片，图5为BJ-2电镜照片。
(2)生理生化特征分析
参考《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999.)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2011.)测定降解菌BJ-2的生理生化特征。
测定结果显示，该菌株革兰氏阴性，能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不液化明胶，不产生吲哚，不形成H2S，能分解利用柠檬酸，分解尿素，赖氨酸鸟氨酸呈阴性，ONPG、精氨酸、氧化酶呈阴性。
(3)降解菌16S rDNA的同源性分析
采用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA基因，引物为27F(5‘-AGAGTTGATCCTGCTCAG-3’)，1492R(5‘-GTTACCTTTACGACTT-3’)。50μL扩增体系：Premix taq25μL，模版(芽孢杆菌DNA)500ng，1492R、27F各10μL，用无菌水补足50μL。PCR循环参数为：95℃预加热5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，72℃下延伸10min，用1％琼脂糖凝胶电泳和EasyPure凝胶进行纯化，PCR电泳条带照片如图6所示。提取试剂盒(转基因生物技术有限公司，北京，中国)，然后由生工生物技术有限公司进行测序。(中国上海)。PCR产物用V-gene核酸纯化试剂盒(TIANGEN)纯化回收16S rDNA片段，将DNA洗脱至收集管中，4℃冷藏。将测序结果委托上海生工工程有限公司完成。测序结果用Blast软件Genbank中的16SrDNA序列进行同源性比较。构建系统发育树如图7所示，获得BJ-2的16S rDNA序列如SEQ IDNO：1所示，该菌株的16S rDNA序列已经提交到GenBank数据库(GenBank登录号：OR104997)，发现该序列与Bacillus cereus strain 8AQ等菌株的基因序列同源性达98％。
3、生长特性分析
进行了菌株最适最适温度最适pH和底物浓度生长实验。
温度实验中，在100mL无机盐培养基中加入秸秆使其浓度达到50mg/L，调节pH为7，接入5％的BJ-2菌悬液，调节培养温度分别为30℃、45℃、50℃、65℃、70℃，于180rmp摇床培养。
pH值实验中，在100mL无机盐培养基中调节pH值分别为5、7、9，加入木质素使其浓度达到50mg/L，接入体积百分数5％的BJ-2菌悬液，于65℃、180rmp摇床培养。
底物浓度实验是在无机盐培养基中加入秸秆碎屑，使其终浓度分别为10mg/L、20mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/L，以体积百分比为5％的接菌量接入BJ-2菌悬液，65℃、180rpm摇床震荡培养，
上述处理分别在3d、5d、7d、9d和11d时取样，测定秸秆降解菌BJ-2的生长情况和秸秆重量。每次处理重复三次，用未接菌的作为对照，培养、观察、记录菌株生长情况。
结果表明，所述降解菌BJ-2的最适生长温度为20-45℃，最适生长pH为碱性7.2±0.2。鉴于上述菌株BJ-2的形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，将降解菌BJ-2鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BJ-2。
具体实施方式二：具体实施方式一所述的蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌剂制备方法按照以下步骤进行：
一、将蜡样芽孢杆菌BJ-2接种于LB液体培养基中，65℃、180rpm条件下振荡培养至对数生长期，以pH为7.0的磷酸盐磷酸盐缓冲溶液清洗，获得菌种；
二、将步骤一获得的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶培养基，65～70℃、150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；其中每100mL种子瓶培养基按重量百分比由0.3～0.5％蔗糖、0.04～0.08％MgSO4·7H2O、0.15～0.2％K2HPO4、0.08～0.1％NaCl、0.05～0.07％KH2PO4、0.15～0.2％酵母膏和余量水组成，调pH为7.0；
三、将15～20mL步骤二制备得到的种子液加入到1000g液体培养基中，并把15～20mL的营养液加入到上述1000g的液体培养基中，在65～70℃条件下摇床内培养发酵12～48h，即得蜡样芽孢杆菌BJ-2制剂；其中液体培养基是将15g蛋白胨、酵母粉4g、磷酸氢二钠2.52g和磷酸二氢钾0.28g加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0；每100mL营养液组成按重量百分比由蔗糖0.5～0.7％、KH2PO4 0.08～0.1％、MgSO4·7H2O 0.08～0.1％、K2HPO4 0.18～0.2％、NaCl 0.1～1.2％、酵母粉0.8～1.0％和余量水组成。
本实施方式步骤三的营养液pH值为自然。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中LB培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和10g胰蛋白胨，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
实施例1降解蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌剂(秸秆土壤生物修复菌剂)的制备
1)将蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌株接种于LB液体培养基中，65℃，180rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种；所述LB培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和5g胰蛋白胨，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调pH为7.0；
2)将上述培养好的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶，65℃，180rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；每1000mL种子瓶培养基组成是：NaCl 1.0g，K2HPO41.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.4g，蔗糖3.0g、酵母膏0.2，以水补足至1000mL，调pH为7.0；
3)将获得的种子液20mL(OD600＝2)加入1000g发酵培养基，同时把20mL的营养液加入到1000g液体培养基中，在28℃下摇床内培养发酵48h，即得到降解菌BJ-2菌株的土壤生物修复菌剂。
实施例2蜡样芽孢杆菌BJ-2BJ-2菌剂对土壤修复作用
首先称取土壤1000g，加入由秸秆制成的水溶液，将含有BJ-2菌株的土壤生物修复菌剂(由实施例1得到的蜡样芽孢杆菌BJ-2BJ-2菌剂)按重量百分比为10％施于该土壤中，充分混匀，放于65℃的培养箱中恒温培养，定时取样测定木质素在液体中的残留。
结果表明，使用含有BJ-2菌株的土壤生物修复菌剂，秸秆降解率明显提高，土壤中加入BJ-2菌剂7天木质素降解率达到63.2％，而没加菌剂7天降解率仅为11.1％。

Claims (3)

1.降解秸秆的蜡样芽孢杆菌BJ-2，其特征在于降解秸秆的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BJ-2保藏编号为CCTCC NO：M 2023950，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2023年6月5日。
2.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌剂制备方法，其特征在于蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌剂制备方法按照以下步骤进行：
一、将蜡样芽孢杆菌BJ-2接种于LB液体培养基中，65℃、180rpm条件下振荡培养至对数生长期，以pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液清洗，获得菌种；
二、将步骤一获得的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶培养基，65～70℃、150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；其中每100mL种子瓶培养基按重量百分比由0.3～0.5％蔗糖、0.04～0.08％MgSO4·7H2O、0.15～0.2％K2HPO4、0.08～0.1％NaCl、0.05～0.07％KH2PO4、0.15～0.2％酵母膏和余量水组成，调pH为7.0；
三、将15～20mL步骤二制备得到的种子液加入到1000g液体培养基中，并把15～20mL的营养液加入到上述1000g的液体培养基中，在65～70℃条件下摇床内培养发酵12～48h，即得蜡样芽孢杆菌BJ-2制剂；其中液体培养基是将15g蛋白胨、酵母粉4g、磷酸氢二钠2.52g和磷酸二氢钾0.28g加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0；每100mL营养液组成按重量百分比由蔗糖0.5～0.7％、KH2PO4 0.08～0.1％、MgSO4·7H2O 0.08～0.1％、K2HPO4 0.18～0.2％、NaCl 0.1～1.2％、酵母粉0.8～1.0％和余量水组成。
3.根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌BJ-2的菌剂制备方法，其特征在于步骤一中LB培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和10g胰蛋白胨，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0。
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