CN117838661A - 一种软骨靶向的dna水凝胶-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体公开一种软骨靶向的DNA水凝胶‑壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用。所述制备方法包括采用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒;配制基于滚环扩增反应的DNA水凝胶反应体系;制备DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒,用以靶向递送药物到目标细胞。这种外壳‑内核结构的药物递送载体设计可以很好地发挥两种材料的优势,壳聚糖纳米“核”保证药物的高效率搭载;DNA水凝胶“壳”使递药载体精准靶向关节软骨部位,大幅降低非患处释药的发生;同时,壳‑核结构的设计减少了DNA纳米材料的使用,在利用DNA纳米材料完成精准靶向的同时,大大降低了递药载体制备成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域,具体涉及一种软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
近年来随着纳米技术的快速发展,纳米材料已经被广泛应用于生物医药领域。这为药物载体的研究和开发提供了巨大的机遇。纳米药物载体因其稳定性、靶向性、智能性、纳米尺寸效应及高的生物利用度等优异特性,可以显著提高治疗效果,引起研究者们的关注,相关研究也极大地推动了药物领域的发展。
其中,壳聚糖纳米颗粒作为药物递送载体具有如下优势:①源自天然成份,生物相容性和生物可降解性好;②具有丰富的氢键形成位点并带强正电,易于高效搭载有机小分子药物与蛋白质/核酸类生物制剂;③制备成本低。故而,壳聚糖纳米颗粒在药物递送中具有重大应用潜力。
然而,壳聚糖纳米颗粒递送载体精准靶向能力不足:现有靶向分子(适配体、多肽等)在壳聚糖纳米颗粒中的引入,不论是通过在纳米颗粒制备前与壳聚糖分子共价连接,还是通过在壳聚糖纳米颗粒表面吸附或修饰,均存在纳米颗粒表面靶向分子密度低或结合弱易脱落的问题,同时壳聚糖纳米颗粒的pH呈酸性,静脉注射会发生溶血现象,限制了壳聚糖纳米颗粒的靶向递药效果。
包含核酸适配体的DNA水凝胶纳米材料兼具优秀的生物相容性和精准靶向性,血浆中稳定性好,易进入靶细胞,构建DNA水凝胶-壳聚糖纳米复合材料应用于靶向药物递送有望同时突破壳聚糖药物载体在精准靶向与可控释药上的局限。
DNA水凝胶以DNA分子为主要构建材料,DNA分子的物理、化学和生物性质决定了DNA水凝胶纳米颗粒具有高度的可设计性、可修饰性、可编程性、生物相容性和生物可降解性。DNA水凝胶纳米材料在核酸适配体这种可特异性靶向细胞/分子的“化学抗体”的搭载上具有其他纳米材料难以具备的便捷性、高可控性和可设计性。利用核酸适配体,多种具备精确的分子识别/靶向能力的DNA水凝胶纳米材料已被应用在靶向递药、细胞捕获等研究中。
单纯的DNA水凝胶纳米颗粒在药物递送的应用中存在药物搭载效率低、载体制备成本高的缺陷。利用DNA水凝胶可靶向疾病特征细胞/分子、稳定性高、易进入靶细胞的特性,及壳聚糖纳米颗粒可高效搭载药物、制备成本低的优势,构建DNA水凝胶-壳聚糖复合纳米材料,应用于小分子药物递送治疗疾病的相关研究尚未见报道,极具研究价值。
发明内容
针对上述存在的问题,本发明旨在提供一种软骨细胞靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,能够大大降低成本,易于操作,且制备出来的DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒既为提升有机高分子纳米递药载体的靶向性提供了一种方案,也为降低DNA纳米递药载体的成本、调和其高功能-高成本这一矛盾提供了一种解决途径。预期研究结果具有普适性,可应用于医学领域药物递送。
为实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
本发明提供一种软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其包括如下步骤:
1)采用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒:取壳聚糖溶液,向其中缓慢加入三聚磷酸钠溶液,边加边搅拌,得到药物载体壳聚糖纳米颗粒;任选地,还包括离心去除上清液中未被交联的壳聚糖分子,然后用去离子水重悬得到药物载体壳聚糖纳米颗粒;
2)配制基于滚环扩增反应的DNA水凝胶反应体系,其中包括含有Tgg2适配体的磷酸化的环状DNA模板链以及Tgg2环形引物链,进行退火后,在上述体系中继续加入T4连接酶,混合均匀后静置,以将磷酸化的线性模板5’端与3’端连接起来;
3)制备DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒:向第2)步反应体系中继续加入DNA聚合酶,脱氧核糖核苷三磷酸以及牛血清蛋白溶液,再加入DNA聚合酶反应缓冲液;然后加入第1)步制备的壳聚糖纳米颗粒,于25-35℃恒温反应以得到透明均质的DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒。
优选地,所述第1)步中所述壳聚糖溶液溶解在乙酸溶液中,更具体的制备方法为:称取分子量为15000-30000Da的壳聚糖,溶解在乙酸溶液中,置于室温条件下,采用磁力搅拌器在400-800rpm/min的条件下,搅拌12-24h;配制成10mg/ml的壳聚糖溶液,调节pH至5,然后用微孔滤膜过滤器过滤(所述的微孔滤膜过滤器的过滤尺寸为0.45μm);优选地,壳聚糖溶液浓度为0.5-2mg/ml,更优选为1mg/ml。
另外优选地,所述第1)步中所述三聚磷酸钠溶液的具体制备方法:将三聚磷酸钠粉末溶于去离子水中,调节pH至4,然后用微孔滤膜过滤器过滤(所述的微孔滤膜过滤器的过滤尺寸为0.22μm);优选地,三聚磷酸钠溶液浓度为0.5-2mg/ml,更优选为1mg/ml。
进一步优选地,所述第1)步的具体操作为:取壳聚糖溶液,采用磁力搅拌器,以400-800rpm/min的转速,逐滴加入步骤三聚磷酸钠溶液,边加边搅拌均匀;所述壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为2-4:1。
优选地,所述第2)步中,基于DNA滚环扩增反应DNA水凝胶反应体系的具体操作是:
①将构建Tgg2适配体的磷酸化的环状DNA模板链以及Tgg2环形引物链复温至室温;
②合成T4连接酶反应体系:在反应体系中加入0.6μM磷酸化的线性DNA单链模板,以及1.2μM的与Tgg2适配体互补的引物链,再加入10×连接酶缓冲液,用去离子水补足体积;具体地,基于DNA滚环扩增的反应终体系定为100μl;
③上述体系混合后,进行退火处理,优选地按照95℃/2min-65℃/30min-50℃/30min-37℃/30min-22℃/30min的条件进行退火处理;
④退火处理完成后,继续加入5-15U/μl的T4连接酶,混合均匀后、室温静置2-4h。
更具体地,所述Tgg2适配体序列如下:CGCAGTGGCCGGGACTTCCGGCGT GACGGCGATATGCCGAGCG(SEQ ID NO:1);所述Tgg2环状DNA模板链序列为5’-P:ACGCCGGAAGTCCCGGCCACTGCGTGCTGCTGCAGCGATACGCGTATCGCTATGGC ATATCGTACGATATGCCGCAGCAGCACGCTCGGCATATCGCCGTC-3’(SEQ ID NO:2);
Tgg2环形引物链的序列为:CGCAGTGGCCGGGACTTCCGGCGTGACGGCGATATGCCGAGCGTGCTGCTGC(SEQ ID NO:3)。
优选地,所述第3)步的具体操作步骤包括,将步骤S2中的用连接酶连接的DNA模板与引物反应体系中继续加入phi 29DNA聚合酶,脱氧核糖核苷三磷酸以及牛血清蛋白溶液,再加入10×DNA聚合酶反应缓冲液;优选地,DNA水凝胶反应体系与壳聚糖体积比90:10至75:25,例如90:10或75:25。
本发明因而也提供所述的制备方法得到软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒。
本发明进一步提供所述的软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒在药物递送中的应用。
本发明还提供所述的软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒在制备药物递送载体中的应用。
本发明的有益效果:
将壳聚糖作为药物的递送载体,设计和构建一种壳-核结构DNA水凝胶-壳聚糖复合纳米颗粒。由外到内顺次为外壳—DNA水凝胶包被层:借助壳聚糖纳米颗粒表面的强正电性与DNA分子的负电性,通过静电吸附在新形成的壳聚糖纳米颗粒表面制备DNA水凝胶包被层。内核—壳聚糖纳米颗粒:壳聚糖通过静电吸附、氢键作用、物理缠绕搭载药物,再通过离子交联法制备搭载药物的壳聚糖纳米颗粒。
在反应体系中加入所需负载药物,完成药物的原位包裹。在DNA水凝胶中的每个周期性重复单元嵌入可靶向软骨细胞的适配体Tgg2,赋予纳米颗粒针对软骨的精准靶向能力。实现既可以高效递送药物,又能够在目标部位缓释,发挥药物缓解靶向治疗作用。
DNA水凝胶包被层通过DNA滚环扩增反应制备,每个重复单元均有靶向软骨细胞的适配体Tgg2。DNA水凝胶-壳聚糖这种外壳-内核结构的药物递送载体设计可以很好地发挥两种材料的优势。壳聚糖纳米“核”保证药物的高效率搭载;DNA水凝胶“壳”使递药载体精准靶向关节软骨部位,大幅降低非患处释药的发生;同时,壳-核结构的设计减少了DNA纳米材料的使用,在利用DNA纳米材料完成精准靶向的同时,大大降低了递药载体制备成本。
因此,本发明构建的这种核-壳结构的复合纳米药物载体,兼具壳聚糖纳米载体和DNA水凝胶纳米载体的优势,利用壳聚糖纳米颗粒具有丰富的氢键形成位点并带强正电,易于高效搭载有机小分子药物,满足小分子药物的高载量高靶向性递送。以壳聚糖纳米颗粒为载体的核,高效搭载药物;以软骨靶向的适配体功能化的DNA纳米颗粒为载体的壳,实现高靶向性,提高载体的血浆稳定性,减少非靶向的药物泄露。
附图说明
图1为本发明DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的合成示意图;
图2为本发明DNA水凝胶合成模板5’端与3’端连接成功的凝胶电泳图;
图3为本发明明确最佳包被率混合体积比的流式图;
图4为本发明基于滚环扩增的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒扫描电子显微镜图;
图5为本发明基于滚环扩增的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒激光共聚焦图;
图6为本发明基于滚环扩增的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒动态光散射图;
图7为本发明基于滚环扩增的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒zeta电位图;
图8为本发明DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒靶向软骨细胞的激光共聚焦图;
图9为本发明DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒靶向软骨细胞的扫描电子显微镜图;
图10为本发明DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒对小鼠原代软骨细胞毒性的影响。
具体实施方式
为了使本领域的一般技术人员能更好的理解本发明的技术方案,下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例一:软骨细胞靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的制备
按以下步骤制备软骨细胞靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒:
S1:配制浓度为1%的壳聚糖溶液:称取200mg的高分子量的壳聚糖,溶解于1%的乙酸溶液中,置于磁力搅拌器上550rpm/min,室温搅拌18h,然后再采用0.45μm的微孔滤膜过滤器滤过,配制成10mg/ml的壳聚糖溶液,调节壳聚糖溶液的pH为5。
S2:配制浓度为0.1%的三聚磷酸钠溶液:称取10mg的三聚磷酸钠粉末,溶解于10ml的去离子水中,配制成1mg/ml的三聚磷酸钠溶液,然后将三聚磷酸钠溶液的pH调成4;
S3:制备药物载体壳聚糖纳米颗粒:取S1中配制的10mg/ml的壳聚糖溶液1ml,然后通过0.22μm的微孔滤膜过滤器逐滴加入三聚磷酸钠溶液330μl,边加边搅拌,加完继续搅拌5h,得到药物载体壳聚糖纳米颗粒。将壳聚糖纳米颗粒在9000g下离心15min,弃去上清液中未被交联的壳聚糖分子,然后用50μl去离子水重悬得到药物载体壳聚糖纳米颗粒。
S4:制备基于滚环扩增反应的DNA水凝胶反应体系;
其中,Tgg2适配体序列如下:CGCAGTGGCCGGGACTTCCGGCGT GACGGCGA TATGCCGAGCG(SEQ ID NO:1)。包含Tgg2适配体的DNA模板链以及引物链序列如下:
Tgg2环状DNA模板链5’-P:
ACGCCGGAAGTCCCGGCCACTGCGTGCTGCTGCAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCGTACGATATGCCGCAGCAGCACGCTCGGCATATCGCCGTC-3’(SEQ ID NO:2);
Tgg2环形引物链:
CGCAGTGGCCGGGACTTCCGGCGTGACGGCGATATGCCGAGCGTGCTGCTG(SEQ ID NO:3)。此两条链由DNA滚环扩增反应制备出包含Tgg2适配体的DNA水凝胶。
首先配置T4连接酶缓冲液50μl反应体系:在反应体系中加入上述0.6μM磷酸化的Tgg2环状DNA单链模板,以及1.2μM的与Tgg2环形引物链,再加入5μl 10×连接酶缓冲液,用水补足50μl体积。上述体系混合后,按照95℃/2min-65℃/30min-50℃/30min-37℃/30min-22℃/30min的条件进行退火处理。退火完成后,在上述体系中继续加入0.5μl的T4连接酶,混合均匀后、室温静置3h,以将磷酸化的线性模板5’端与3’端连接起来,结果如图2所示,加入T4连接酶之后,所得产物的分子量明显增大,表明线性模板5’端与3’端连接成功。
S5:制备DNA水凝胶包被不同体积的壳聚糖纳米颗粒:
将步骤S4中的用T4连接酶连接的DNA模板与引物反应体系中继续加入10μl的phi29DNA聚合酶,2μl的脱氧核糖核苷三磷酸以及0.5μl的牛血清蛋白溶液,再加入10μl10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液。
将10μl、15μl、20μl及25μl不同体积的步骤S3制备出来的壳聚糖纳米颗粒加入到滚环扩增反应体系中,终体系不足100μl的,用去离子水补足。
将上述反应体系在30℃恒温反应15h,得到透明均质的DNA水凝胶包被的不同体积的壳聚糖纳米颗粒。
后续分析加入不同体积壳聚糖纳米颗粒的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的包被率,确定最佳壳聚糖纳米颗粒体积。
实施例二:软骨细胞靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的包被率和形貌
检测实施例一制备的DNA水凝胶包被壳聚糖纳米颗粒的包被率,但为了检测,具体操作为在合成壳聚糖纳米颗粒时将壳聚糖插入一个FITC的荧光标签,FITC标记壳聚糖的原理为FITC含有异硫氰基,在碱性条件下FITC的异硫氰根(N=C=S)能与壳聚糖的伯胺基共价结合,形成比较稳定的共价结合物FITC-CIS。具体操作为将壳聚糖溶于0.1mol/L乙酸溶液中,配制成1%的壳聚糖乙酸溶液,加入2mg/ml FITC无水甲醇溶液,调整溶液的PH=9,在室温条件下,反应3h。壳聚糖与荧光素的反应控制质量比为60:1。反应结束后将混合样品置于透析袋中,然后将透析袋置于装有2L去离子水的大烧杯中透析3天,每天换两次去离子水,将样品冷冻干燥。,然后在RCR反应中通过化学修饰的脱氧核苷酸Cy3-dUTP被掺入到DNA水凝胶纳米颗粒中,使DNA水凝胶上插入一个Cy3的荧光标签,采用流式细胞术检测加入不同壳聚糖纳米颗粒体积,FITC与Cy3双阳比例。确定最佳混合体积比,如图3所示,结果显示DNA水凝胶与壳聚糖体积比为3:1时包被效率最好。。
具体DNA水凝胶滚环扩增反应体系体积与不同体积壳聚糖混合,DNA水凝胶包被率结果如下表1所示。
表1、DNA水凝胶包被率结果(终体积为100μl)
由表1可知结果显示,虽然各比例均有较高的包被率,但DNA水凝胶包被壳聚糖的比率与壳聚糖加入的量并不成正相关,而90:10与75:25的体积比包被率较高。分析原因可能是因为当DNA水凝胶体系与壳聚糖纳米颗粒的体积比只有90:10的时候,体系中的壳聚糖纳米颗粒较少,DNA水凝胶较多,因而对壳聚糖的包被层较厚,故而双阳比例较高。当DNA水凝胶反应体系与壳聚糖体积比为75:25时,DNA水凝胶的量刚好包被壳聚糖。在后面的实验中均采用75:25的体积比进行实验。
步骤S5中制备出来的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒呈澄清透明状液体,采用扫描电子显微镜观察制备出的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的形貌,验证DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒成功构建,结果如图4所示,SEM下可见颗粒较为规整、表面光泽不一、粒径大体合适、多分散性指数一般的壳聚糖纳米颗粒。与壳聚糖纳米颗粒以及DNA滚环扩增反应制备出的DNA水凝胶纳米颗粒相比,基于DNA滚环扩增反应制备的DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒呈现中间为较为规整表面光泽的壳聚糖纳米颗粒,在新形成的壳聚糖纳米颗粒表面包被DNA水凝胶层,形成核-壳结构的双层结构。。同时采用激光共聚焦进行再次验证,结果如图5所示,带有FITC荧光的壳聚糖纳米颗粒与带有Cy3荧光标记的DNA水凝胶存在共定位。
测定步骤S5制备出来的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的粒径及zeta电位大小,结果如图6和图7所示。从图6可以看出,与单独壳聚糖纳米颗粒及DNA水凝胶纳米颗粒相比,DNA水凝胶包被上壳聚糖纳米颗粒粒径显著增加,粒径为900nm左右。从图7可以看出,在zeta电位上,DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒总体表现出正的zeta电位。但是与单独壳聚糖纳米颗粒相比,zeta电位是降低的。可能原因是由于DNA水凝胶带负电,包被壳聚糖纳米颗粒时与壳聚糖纳米颗粒产生静电吸附作用,中和了一部分壳聚糖的正电荷。
综上所述,可以明确表明基于滚环扩增反应的DNA水凝胶对壳聚糖成功包被,成功制备得到DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒。
实施例三:软骨细胞靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒特异性靶向软骨细胞
将制备出的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒处理小鼠原代软骨细胞,具体步骤为将化学修饰的脱氧核苷酸FAM-dUTP掺入到DNA水凝胶纳米颗粒中,使DNA水凝胶上插入一个FAM的荧光标签的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒与原代小鼠软骨细胞共孵育24h,后采用激光共聚焦观察DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒结合小鼠原代软骨细胞的荧光强度,以及扫描电子显微镜观察DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒结合小鼠软骨细胞的形貌。结果如图8及图9所示。从图8及图9中可以看出,小鼠原代软骨细胞上的荧光强度明显比对照组角质细胞上的荧光强,表明制备出的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒能够特异性靶向软骨细胞而与其他细胞不结合。
将制备出的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒处理软骨细胞,具体操作为将带有荧光标记的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒与小鼠原代软骨细胞进行共孵育24h,采用MTT法检测制备出的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒对软骨细胞活力的影响,具体操作为将小鼠软骨细胞接种至96孔板中与DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒共孵育24h后,加入MTT试剂6h,弃去上清,加入100μl的DMSO,用酶标仪检测对应的OD值。,结果如图10所示。从图10中可以看出,相较于未经任何处理的软骨细胞,经DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒376ng/ml、3.76μg/ml以及37.6μg/ml的浓度处理的软骨细胞的活力为108%、108%以及104%。由此可见制备出的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒未见明显的细胞毒性,反而对细胞活力有一定的促进作用。
综上所述,利用本发明制备方法制备出来的靶向软骨细胞的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒质地透明均匀,有规则致密的结构,对负载药物有缓释作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求本发明范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)采用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒:取壳聚糖溶液,向其中缓慢加入三聚磷酸钠溶液,边加边搅拌,得到药物载体壳聚糖纳米颗粒;任选地,还包括离心去除上清液中未被交联的壳聚糖分子,然后用去离子水重悬得到药物载体壳聚糖纳米颗粒;
2)配制基于滚环扩增反应的DNA水凝胶反应体系,其中包括含有Tgg2适配体的磷酸化的环状DNA模板链以及Tgg2环形引物链,进行退火后,在上述体系中继续加入T4连接酶,混合均匀后静置,以将磷酸化的线性模板5’端与3’端连接起来;
3)制备DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒:向第2)步反应体系中继续加入DNA聚合酶,脱氧核糖核苷三磷酸以及牛血清蛋白溶液,再加入DNA 聚合酶反应缓冲液;然后加入第1)步制备的壳聚糖纳米颗粒,于25-35℃恒温反应以得到透明均质的DNA水凝胶包被的壳聚糖纳米颗粒。
2.一种如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述第1)步中所述壳聚糖溶液溶解在乙酸溶液中,更具体的制备方法为:称取分子量为15000-30000Da的壳聚糖,溶解在乙酸溶液中,置于室温条件下,采用磁力搅拌器在400-800rpm/min的条件下,搅拌12-24h;配制成10mg/ml的壳聚糖溶液,调节pH至5,然后用微孔滤膜过滤器过滤(所述的微孔滤膜过滤器的过滤尺寸为0.45μm);优选地,壳聚糖溶液浓度为0.5-2mg/ml,更优选为1mg/ml。
3.一种如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述第1)步中所述三聚磷酸钠溶液的具体制备方法:将三聚磷酸钠粉末溶于去离子水中,调节pH至4,然后用微孔滤膜过滤器过滤(所述的微孔滤膜过滤器的过滤尺寸为0.22μm);优选地,三聚磷酸钠溶液浓度为0.5-2mg/ml,更优选为1mg/ml。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的制备方法,其特征在于:所述第1)步的具体操作为:取壳聚糖溶液,采用磁力搅拌器,以400-800rpm/min的转速,逐滴加入步骤三聚磷酸钠溶液,边加边搅拌均匀;所述壳聚糖溶液与三聚磷酸钠溶液的体积比为2-4:1。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的制备方法,其特征在于:所述第2)步中,基于DNA滚环扩增反应DNA水凝胶反应体系的具体操作是:
①将构建Tgg2适配体的磷酸化的环状DNA模板链以及Tgg2环形引物链复温至室温;
②合成T4 连接酶反应体系:在反应体系中加入0.6μM磷酸化的线性DNA单链模板,以及1.2μM的与Tgg2适配体互补的引物链,再加入10×连接酶缓冲液,用去离子水补足体积;具体地,基于DNA滚环扩增的反应终体系定为100μl;
③上述体系混合后,进行退火处理,优选地按照95℃/2min- 65℃/30min- 50℃/30min- 37℃/30min-22℃/30min的条件进行退火处理;
④退火处理完成后,继续加入5-15U/μl的T4连接酶,混合均匀后、室温静置2-4h。
6.一种如权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述Tgg2适配体序列如下:CGCAGTGGCCGGGACTTCCGGCGT GACGGCGATATGCCGAGCG;所述Tgg2环状DNA模板链序列为5’-P:ACGCCGGAAGTCCCGGCCACTGCGTGCTGCTGCAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCGTACGATATGCCGCAGCAGCACGCTCGGCATATCGCCGTC-3’;
Tgg2 环形引物链的序列为:CGCAGTGGCCGGGACTTCCGGCGTGACGGCGATATGCCGAGCGTGCTGCTGC。
7.一种如权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述第3)步的具体操作步骤包括,将步骤S2中的用连接酶连接的DNA模板与引物反应体系中继续加入phi 29 DNA聚合酶,脱氧核糖核苷三磷酸以及牛血清蛋白溶液,再加入10×DNA聚合酶反应缓冲液;
优选地,DNA水凝胶反应体系与壳聚糖体积比90:10至75:25。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的制备方法得到软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒。
9.如权利要求8所述的软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒在药物递送中的应用。
10.如权利要求8所述的软骨靶向的DNA水凝胶-壳聚糖纳米颗粒在制备药物递送载体中的应用。
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