CN117821633A - 用于甘薯种质鉴定的kasp标记引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于甘薯种质鉴定的KASP标记引物组合及其应用，所述KASP标记引物组合由74对KASP引物组成。本发明提供的甘薯基因组KASP标记引物，可有效区分甘薯种质材料基因组单核苷酸位点的基因型，74对引物扩增结果可以构建甘薯种质材料、品种的指纹图谱，作为区别不同品种的依据，有效解决“一品多名”、“一名多品”等问题，为甘薯新品种保护与推广提供技术支撑，也可用于辨别品种真假、鉴别品种纯度、分析品种间的亲缘关系、构建遗传连锁图谱等。
Description
技术领域
本发明属于分子技术领域，具体涉及用于甘薯种质鉴定的KASP标记引物组合及其应用。
背景技术
甘薯是无性繁殖的六倍体作物，基因组大，杂合度高，遗传背景复杂，分子生物学研究水平远落后于水稻、玉米等其他主要作物，可用分子标记的种类和数量也相对较少。一直以来，甘薯中常用的第一代、第二代RAPD、AFLP、ISSR、SSR等分子标记已经很难满足研究需求。随着测序技术的迅速发展，第三代单核苷酸多态性分子标记发展迅速。与以往分子标记相比，其具有在动植物基因组分布中分布广泛、密度高、遗传稳定好、与表型性状相关性强等优点。已成为小麦、水稻、玉米等作物中应用最多的分子标记。目前，已开发出多种单核苷酸多态性分子标记检测方法，如基于传统凝胶电泳技术的单链构象多态性法、酶切扩增多态性序列法、等位基因特异性PCR技术、高分辨率熔解曲线，以及基于高通量自动化检测技术的Sanger测序法、焦磷酸测序法、基因芯片法、竞争性等位基因特异性PCR分型法、质谱法和测序法等。以上方法均可区分基因组单核苷酸多态性位点，但是很多方法都存在实验设备昂贵、操作繁琐等问题。目前，只有高分辨率熔解曲线法、基因芯片法、TaqMan探针法，特别是竞争性等位基因特异性PCR分型法是应用最为广泛。
竞争性等位基因特异性PCR分型方法是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测插入缺失片段，可用2个通用荧光探针、2个通用淬灭探针，再加多个位点特异引物来检则多个SNP位点。相较于其他单核苷酸多态性区分方法，该方法通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针，大大节约成本，而且不受物种和环境条件的限制，适用于作物、果蔬、畜牧、水产、中草药、模式动物、人等物种，在分子育种、品种质控、人类基因组、基因功能、药物开发等方面应用广泛，已成为国际主流的单核苷酸多态性分型工具之一，也是国内外开展分子育种、种质鉴定、指纹图谱构建、基因精细定位等相关研究的首选标记。
DNA指纹图谱是利用分子标记在DNA水平上鉴定品种纯度、真实性及生物个体差异的有效手段，具有快速、高效、准确的优点。在SNP分子标记大量应用之前，主要使用SSR等分子标记基于扩增片段长度构建指纹图谱。随着SNP分子标记的大量开发与应用，小麦、水稻、玉米、油菜、棉花、大豆等作物已经构建了基于SNP分型的指纹图谱。与其他作物相比，甘薯的DNA指纹图谱构建仍以RAPD、ISSR、SSR标记和形态学标记为主，SNP标记开发还处于起步阶段，因此，构建甘薯基于SNP分子标记数据的DNA指纹库迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：针对甘薯研究中现有分子标记少、操作复杂、实验成本高等问题，提供一种用于甘薯种质鉴定的KASP标记引物组合及其应用。
本发明的技术方案为：用于甘薯种质鉴定的KASP标记引物组合，所述KASP标记引物组合由74对KASP引物组成，KASP引物的核苷酸序列如下表所示：
进一步地，所述KASP标记引物的正向引物序列-1的5'端添加GAAGGTGACCAAGTTCATGCT接头序列，正向引物序列-2的5'端添加GAAGGTCGGAGTCAACGGATT接头序列。
一种试剂盒，含有上述所述的KASP标记引物组合。
本发明的KASP标记引物组合或试剂盒在甘薯种质鉴定或甘薯DNA指纹图谱构建中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的甘薯基因组KASP标记引物组合，可有效区分甘薯种质材料基因组单核苷酸位点的基因型，74对引物扩增结果可以构建甘薯种质材料、品种的指纹图谱，作为区别不同品种的依据，有效解决“一品多名”、“一名多品”等问题，促进新品种保护与推广提供技术支撑，也可用于辨别品种真假、鉴别品种纯度、分析品种间的亲缘关系、构建遗传连锁图谱等。
附图说明
图1本发明技术流程示意图。
图2本发明引物SHIb007、SHIb056、SHIb033、SHIb0290、SHIb419、SHIb358、SHIb280、SHIb180、SHIb190对供试甘薯种质材料济薯25、冀薯19-40、黄皮大苕、宜宾秧、福菜23、徐紫201、菜薯830、湘薯1号、潮薯15号、2019516、三桂15、泉薯19、红旗4号、龙薯10、2019513002、龙薯599、川薯20、川薯383、福薯7号、川薯217、台湾紫秧、红条薯、无外苕、5号菜薯、赣薯7号、龙薯14、宿宁1号、日紫1号、南薯88、冀薯6-8、徐薯27、徐薯18、日紫薯7号、日紫薯9号、日本紫薯、广菜薯5号、广菜薯6号、万紫薯56、龙薯35、北京553、普薯32、泉薯17、良种苕的KASP分子标记分型结果。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
对60份甘薯种质材料进行RAD简化基因组测序，通过生物信息学分析，找到一批多态性高、稳点好的SNP标记，针对这些位点成功开发出74对KASP引物。
表1 74对KASP引物的核苷酸序列
/>
/>
实施例：
使用本发明的74对KASP引物对42份甘薯种质材料进行分型，构建每个材料的指纹图谱，具体方法如下：
1)材料准备：选取42个甘薯种质材料，分别为济薯25、冀薯19-40、黄皮大苕、宜宾秧、福菜23、徐紫201、泉薯830、湘薯1号、潮薯15号、2019516、三桂15、泉薯19、红旗4号、龙薯10、2019513002、龙薯599、川薯20、川薯383、福薯7号、川薯217、台湾紫秧、红条薯、无外苕、5号菜薯、赣薯7号、龙薯14、宿宁1号、日紫1号、南薯88、冀薯6-8、徐薯27、徐薯18、日紫薯7号、日紫薯9号、日本紫薯、广菜薯5号、广菜薯6号、万紫薯56、龙薯35、北京553、普薯32、泉薯17、良种苕(这些种质材料都是已推广甘薯品种或者地方种，公众可以通过公开的途径获得)。于春季3月在试验地进行种植。
2)DNA提取：取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃采用CTAB法提取参试材料DNA，溶于1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl。100V恒定电压下，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。
3)引物修饰及合成：为使74对引物满足KASP试剂扩增的要求，分别在74对引物的正向引物5’端添加KASP试剂说明中建议添加探针序列，具体处理方法如下：正向引物序列-1的5'端添加GAAGGTGACCAAGTTCATGCT序列，正向引物序列-2的5'端添加GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。在生工生物工程(上海)股份有限公司合成本发明开发引物。
4)PCR扩增：
反应体系如下：
PCR扩增条件为：
本发明反应均在成都瀚辰光翼科技有限公司生产的水浴PCR仪中进行。
5)扩增产物的基因分型：使用高速荧光扫描仪及数据分析软件(成都瀚辰光翼科技有限公司)对42份甘薯种质材料的74对引物PCR扩增产物进行扫描分析，基因型结果如表2所示(部分引物扫描分型结果如图2所示)。结果可见，74对引物扩增SNP分子标记基因型构成了不同种质独特DNA指纹信息，可以通过这些信息差异将42份参试甘薯种质材料清楚地区分开来。
表2 74对引物对应SNP分子标记构成指纹图谱
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Claims (4)
1.用于甘薯种质鉴定的KASP标记引物组合，其特征在于，所述KASP标记引物组合由74对KASP引物组成，KASP引物的核苷酸序列如下表所示：
2.根据权利要求1所述的KASP标记引物组合，其特征在于，所述KASP标记引物的正向引物序列-1的5'端添加GAAGGTGACCAAGTTCATGCT接头序列，正向引物序列-2的5'端添加GAAGGTCGGAGTCAACGGATT接头序列。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的KASP标记引物组合。
4.权要求1或2所述的KASP标记引物组合或权利要求3所述的试剂盒在甘薯种质鉴定或甘薯DNA指纹图谱构建中的应用。
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