CN117821610A - 用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物分子生物学技术领域，涉及一种用于鉴定拉萨裂腹鱼的引物及应用。本发明提供了一种可以准确评估拉萨裂腹鱼放流效果的用于鉴定拉萨裂腹鱼的引物及应用，可行性强、准确率高，可以广泛应用到拉萨裂腹鱼的增殖放流效果评估中。
Description
技术领域
本发明属于动物分子生物学技术领域，涉及一种用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法。
背景技术
拉萨裂腹鱼(Schizothorax waltoni)隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)，裂腹鱼属(Schizothorax)，仅分布于西藏自治区雅鲁藏布江中上游干、支流及附属水体，为我国的特有种。裂腹鱼属鲤形目鲤科。因鱼的臀鳍两侧具有排列成行的大鳞片，鳞片之间似腹部裂口，故名裂腹鱼。西藏裂腹鱼属有15个种，占中国已知该属39个种的38.5％，主要分布于金沙江、澜沧江、怒江、伊洛瓦底江和雅鲁藏布江下游海拔相对较低的河段，只有拉萨裂腹鱼、巨须裂腹鱼、异赤裂腹鱼、横口裂腹鱼和西藏裂腹鱼分布在海拔3000～4500米的雅鲁藏布江中游、印度河上游和班公错等水体，是该属鱼类分布海拔最高的种类。从栖息环境分析，除西藏裂腹鱼可同时分布于江、湖两种水体外，其他均在外流河水环境生活。
增殖放流就是用人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域放流水生生物苗种或亲体的活动。通过增殖放流可以补充和恢复生物资源的群体，因为水生生物资源下降，有的资源甚至很少或者没有，通过增殖放流，人工的来补充这些生物资源到水里去，这样就增加了资源，改善了生物的种群结构，同时也能够维护生物的多样性。有些濒危的物种，就是现在水里面很少的、受到保护的这些品种，通过增殖放流的方式可以增加它的数量，起到了对这些濒危物种的保护作用。
拉萨裂腹鱼的数量急剧减少是不可争论的事实。为了更好的保护拉萨裂腹鱼的野生资源，连续多年展开拉萨裂腹鱼增殖放流活动，为保护拉萨裂腹鱼做出了巨大贡献。随着拉萨裂腹鱼增殖放流活动的成熟开展，拉萨裂腹鱼的放流效果评估也越来越受重视。传统的放流效果评估方法为通过捕捞收集、信息调查和数据收集等手段，分析评估放流江段内放流鱼类的存活、生长状况，对增殖放流效果进行跟踪监测。传统放流的具体方法为剪鳍法、挂牌法、体内达标法等，上述方法操作简单，不需要仪器。但是上述方法也有弊端，比如会影响放流个体的游泳速度和生存，挂牌法的牌容易脱落，体内达标法价格昂贵等。年来，微卫星分子标记作为一种新型的标志方法，已在国内外开始逐步试用。与传统标志方法相比，分子标记技术是以个体间遗传物质为基础的遗传标记，不存在脱落或改变的情况，最大程度减少了传统标志方法对鱼体造成的伤害，适用于鱼类的放流活动效果评估。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种可以准确评估拉萨裂腹鱼放流效果的用于鉴定拉萨裂腹鱼的引物及应用试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物，其特征在于：所述用于鉴定拉萨裂腹鱼的引物包括10对引物，10对引物的序列及退火温度分别是：
优选地，本发明所提供的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物中，引物LSLFY1与引物LSLFY2配合使用，两对引物在同一离心管中同时进行PCR扩增；引物LSLFY3与引物LSLFY4配合使用，两对引物在同一离心管中同时进行PCR扩增；引物LSLFY5与引物LSLFY6配合使用，两对引物在同一离心管中同时进行PCR扩增；引物LSLFY7与引物LSLFY8配合使用，两对引物在同一离心管中同时进行PCR扩增；引物LSLFY9与引物LSLFY10配合使用，两对引物在同一离心管中同时进行PCR扩增。
优选地，本发明所提供的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物在鉴定拉萨裂腹鱼时的应用。
优选地，本发明所提供的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物在进行拉萨裂腹鱼亲子鉴定时的应用。
优选地，本发明所提供的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物在对拉萨裂腹鱼放流效果评估时的应用。
一种基于如前所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物制备得到的检测试剂盒。
一种用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒，其特征在于：所述用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒包括10×PCRBuffer、2.5mmol/L dNTP、2mmol/L MgCl2、0.5U/μL Taq酶、超纯水和如前所记载的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物。
一种用于对拉萨裂腹鱼增殖放流效果进行评估的方法，其特征在于：所述用于对拉萨裂腹鱼增殖放流效果进行评估的方法包括以下步骤：
1)保存拉萨裂腹鱼人工繁殖亲本的DNA亲本；
2)将拉萨裂腹鱼人工繁殖子代放流；
3)捕捞拉萨裂腹鱼的野外群体；
4)提取捕捞到野外群体的拉萨裂腹鱼的DNA捕捞；
5)分别利用前述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物或前述的用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒对步骤1)所得到的DNA亲本以及步骤4)所得到的DNA捕捞进行PCR扩增，并将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
6)根据步骤5)的结果分析拉萨裂腹鱼亲本和野外捕捞到的拉萨裂腹鱼的亲子关系，得到捕捞到的拉萨裂腹鱼中拉萨裂腹鱼亲本的数量，根据数量评估放流效果。
优选地，本发明所采用的步骤5)的PCR扩增的反应体系是：25μL：10×PCRBuffer3μL，2.5mmol/LdNTP2μL，2mmol/L MgCl23μL，上下游引物各1μL，0.5U/μL Taq酶0.5μL，DNA模板2μL，超纯水10.5μL；
所述PCR扩增的程序是：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火温度复性30s，72℃延伸29s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
优选地，本发明所采用的步骤6)中亲子关系的鉴定方式是：根据电泳结果判断利用用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物或的用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒所扩增的等位基因是否全部来自拉萨裂腹鱼亲本中，若是，则野外捕捞的拉萨裂腹鱼个体与步骤2)中的拉萨裂腹鱼具有亲子关系；如否，则不具有亲子关系。
本发明具有以下的优点：
本发明能够百分百准确鉴定野外拉萨裂腹鱼是否为被放流拉萨裂腹鱼个体。本发明进行放流效果评估操作简单，只需要保存亲本个体的DNA样本即可。本发明不需要对放流个体进行取样或者挂牌，避免了被放流个体在野外环境下的游泳困难的难题。
附图说明
图1是LSLFY1和LSLFY2引物在48个子代中的胶图。
具体实施方式
实施例1获取拉萨裂腹鱼的DNA
1)取拉萨裂腹鱼父本和母本，以及他们的子代共计一百尾鳍条，保存于95％的酒精中。从95％的酒精中取出每条鱼的鳍条样本，减下约50mg，在两个装满去离子水的500ml的烧杯中洗两遍，然后放入1.5ml的离心管中，用记号笔给离心管编号；
2)在装有冲洗过鳍条组织的1.5ml的离心管中加入500ml的TE抽提缓冲液，然后开始剪碎组织，知道离心管中没有大块组织；
3)组织剪碎后加入50ul10％SDS溶液以及5ul的蛋白酶K，混匀后，放入56℃水浴锅中，水浴3-4个小时，直到离心管中澄清为止；
4)水浴过程中，每半个小时摇动离心管一次，使之充分混合，充分反应；
5)待离心管澄清之后从水浴锅中取出，在通风橱中进行以下操作，向离心管中加入500ul的酚/氯仿/异戊醇混合溶液(25：24：1)，需要注意的是，酚/氯仿/异戊醇溶液上层是保护液，溶液下层才是实验需要的液体，移液枪的枪头一定要从下层吸取液体。反复摇晃8分钟(动作尽量轻)，然后放入低温高速离心机中，离心条件设置为4℃，12000r/min离心10分钟；
6)离心结束后，使用l00ul的移液枪，取上清液，然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合溶液，反复摇晃8分钟，放入低温高速离心机中，条件设置为4℃，12000r/min离心10分钟：
7)离心结束后，取出离心管，使用100ul的移液枪，取上清液然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，摇8分钟，然后4℃，12000r/min离心10分钟；
8)取上清液，加入1/25体积的5MNaCl溶液，再加入2倍体积的冰冻的无水乙醇，摇匀，放入-20℃的冰箱中，静置30分钟；
9)取出离心管，手摇晃出沉淀，然后4℃，12000r/min离心10分钟；
10)弃上清，加入500ul的70％酒精，静置l0分钟，然后4℃，12000r/min离心10分钟；
11)弃去上清液，把装有DNA沉淀的离心管放入通风橱中自然干燥；
12)在1.5ml离心管中加入100ul的TE溶解模板。
13)静置一段时间，检测DNA浓度之后，放入4℃冰箱中备用。
实施例2拉萨裂腹鱼微卫星标记应用于亲子鉴定分析
以上述提取的DNA为模板，用本发明微卫星标记组合进行PCR扩增(引物序列如下表所示)，PCR扩增反应体系为：25μL：10×PCRBuffer3μL，2.5mmol/LdNTP2μL，2mmol/LMgCl23μL，上下游引物各1μL，0.5U/μL Taq酶0.5μL，DNA模板2μL，超纯水10.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火温度复性30s，72℃延伸29s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
PCR产物放入10％聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，对电泳显示的条带结果进行分析，检测是否每一个子代的条带，即等位基因，是否均来自亲本，实验结果如下表所示。图1为LSLFY1和LSLFY2引物在48个子代中的胶图，从图1可知，这两对引物在48个个体中扩增出来的条带清晰，多态性高，是优良的位点，能够应用于拉萨裂腹鱼亲子鉴定分析。
由上表可知，利用本专利微卫星标记可以准确进行拉萨裂腹鱼亲子鉴定，准确率100％。
实施例3流放效果评估
2023年4月，在拉萨裂腹鱼养殖场繁殖拉萨裂腹鱼子代3万余尾，保存好亲本的DNA信息。在拉萨裂腹鱼放流点进行放流拉萨裂腹鱼子代3万尾。放流半年后，在当地河流捕捞拉萨裂腹鱼430尾。提取每一条捕捞到的拉萨裂腹鱼DNA，利用本亲子鉴定方法对亲本DNA和捕捞到的拉萨裂腹鱼DNA进行亲子关系鉴定分析，具体方法为：
利用用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物或用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒对步骤1)所得到的亲本的DNA以及捕捞到的拉萨裂腹鱼DNA进行PCR扩增，并将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中，PCR扩增的反应体系是：25μL：10×PCR Buffer 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，2mmol/L MgCl2 3μL，上下游引物各1μL，0.5U/μL Taq酶0.5μL，DNA模板2μL，超纯水10.5μL；PCR扩增的程序是：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火温度复性30s，72℃延伸29s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
根据电泳结果判断捕捞到的拉萨裂腹鱼DNA所扩增的等位基因是否全部来自养殖场拉萨裂腹鱼亲本中，若是，则野外捕捞的拉萨裂腹鱼个体与养殖场拉萨裂腹鱼亲本具有亲子关系；如否，则不具有亲子关系。
根据实验结果分析拉萨裂腹鱼亲本和野外捕捞到的拉萨裂腹鱼的亲子关系，实验结果显示捕捞到的430为拉萨裂腹鱼中，其中放流拉萨裂腹鱼子代的数量为56尾，放流拉萨裂腹鱼数量占当地拉萨裂腹鱼数量的13％，表明该次放流拉萨裂腹鱼效果良好。
本发明可以应用于拉萨裂腹鱼放流效果评估。
Claims (10)
1.一种用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物，其特征在于：所述用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物包括10对引物，10对引物的序列及退火温度分别是：
2.根据权利要求1所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物，其特征在于：所述用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物中，引物LSLFY1与引物LSLFY2配合使用；引物LSLFY3与引物LSLFY4配合使用；引物LSLFY5与引物LSLFY6配合使用；引物LSLFY7与引物LSLFY8配合使用；引物LSLFY9与引物LSLFY10配合使用。
3.基于如权利要求1或2所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物在鉴定拉萨裂腹鱼时的应用。
4.基于如权利要求1或2所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物在进行拉萨裂腹鱼亲子鉴定时的应用。
5.基于如权利要求1或2所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物在对拉萨裂腹鱼放流效果评估时的应用。
6.一种基于如权利要求1或2所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物制备得到的检测试剂盒。
7.一种用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒，其特征在于：所述用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒包括10×PCRBuffer、2.5mmol/L dNTP、2mmol/L MgCl2、0.5U/μL Taq酶、超纯水以及如权利要求1或2所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物。
8.一种用于对拉萨裂腹鱼增殖放流效果进行评估的方法，其特征在于：所述用于对拉萨裂腹鱼增殖放流效果进行评估的方法包括以下步骤：
1)保存拉萨裂腹鱼人工繁殖亲本的DNA亲本；
2)将拉萨裂腹鱼人工繁殖子代放流；
3)捕捞拉萨裂腹鱼的野外群体；
4)提取捕捞到野外群体的拉萨裂腹鱼的DNA捕捞；
5)分别利用权利要求1所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物或权利要求7所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒对步骤1)所得到的DNA亲本以及步骤4)所得到的DNA捕捞进行PCR扩增，并将PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
6)根据步骤5)的结果分析拉萨裂腹鱼亲本和野外捕捞到的拉萨裂腹鱼的亲子关系，得到捕捞到的拉萨裂腹鱼中拉萨裂腹鱼亲本的数量，根据数量评估放流效果。
9.根据权利要求8所述的用于对拉萨裂腹鱼增殖放流效果进行评估的方法，其特征在于：所述步骤5)的PCR扩增的反应体系是：25μL：10×PCRBuffer3μL，2.5mmol/LdNTP2μL，2mmol/LMgCl23μL，上下游引物各1μL，0.5U/μL Taq酶0.5μL，DNA模板2μL，超纯水10.5μL；
所述PCR扩增的程序是：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火温度复性30s，72℃延伸29s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
10.根据权利要求8或9所述的用于对拉萨裂腹鱼增殖放流效果进行评估的方法，其特征在于：所述步骤6)中亲子关系的鉴定方式是：根据电泳结果判断利用权利要求1所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物或权利要求7所述的用于鉴定拉萨裂腹鱼的检测试剂盒所扩增的等位基因是否全部来自拉萨裂腹鱼亲本中，若是，则野外捕捞的拉萨裂腹鱼个体与步骤2)中的拉萨裂腹鱼具有亲子关系；如否，则不具有亲子关系。
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| CN202311859744.4A Pending CN117821610A (zh) | 2023-12-30 | 2023-12-30 | 用于鉴定拉萨裂腹鱼增殖放流个体的引物、试剂盒及鉴别方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117821610A (zh) |
-
2023
- 2023-12-30 CN CN202311859744.4A patent/CN117821610A/zh active Pending
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