CN117820470B - 人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117820470B CN117820470B CN202410239020.8A CN202410239020A CN117820470B CN 117820470 B CN117820470 B CN 117820470B CN 202410239020 A CN202410239020 A CN 202410239020A CN 117820470 B CN117820470 B CN 117820470B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- variable region
- spastin
- chain variable
- heavy chain
- light chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 102000004880 Spastin Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090001068 Spastin Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 5
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 26
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 abstract description 3
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 208000008675 hereditary spastic paraplegia Diseases 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 101000664527 Homo sapiens Spastin Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000000701 chemical imaging Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000029955 Nervous System Heredodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 101150055520 SPG4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102100038829 Spastin Human genes 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013135 deep learning Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 210000003520 dendritic spine Anatomy 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 102000056978 human SPAST Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000030309 inherited neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003988 neural development Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 description 1
- 238000000455 protein structure prediction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000002804 pyramidal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用。本发明利用Rosetta设计了三种抗Spastin抗体得到原始蛋白序列，并基于该原始蛋白序列通过密码子优化，得到轻链和重链可变区序列，以此进行了重组Spastin抗体载体的构建，并转染至人源真核293FT细胞中，成功表达和纯化了人源性抗Spastin单克隆抗体。所述人源性抗Spastin单克隆抗体具有优异的Spastin蛋白结合活性，灵敏度高，特异性良好，且相对于其他异种来源的抗体安全性更高，有效避免HAMA等反应的发生，为脊髓损伤等神经性疾病的诊断和治疗提供了新的功能性试剂。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用。
背景技术
抗体是免疫系统的主要效应分子，作为生物治疗药物已取得巨大成功。抗体也是作为一种特殊的蛋白质，在检测和破坏病原体方面发挥着至关重要的作用。由于抗体具有高特异性、模块化和适应性强的结构、可预测的生物利用度和药代动力学以及标准化制造平台的可用性，它已经发展成为一类成熟且用途广泛的治疗剂，用于治疗多种人类疾病。目前抗体药物研发已成为医药行业可行性最高的生物制药领域之一；特别是单克隆抗体已成为全球医药市场上最重要的治疗性重组抗体之一。抗体的结合和特异性很大程度上取决于互补决定区（CDR），其由轻链中的三个环和重链中的三个环组成。结构多样性很大程度上是由重链中的第三个环实现的，它决定了许多抗原结合特性。
目前，市场上的大多数抗体都是主要是使用昂贵且耗时的体外噬菌体和酵母展示技术以及动物免疫平台技术等开发的。并且，由于抗原很难靶向，对于许多靶点，这些方法可能无法产生具有理想特性的抗体。随着基因组时代的到来，传统免疫学已被一种更快速、更有效的计算机主导的蛋白质抗原（Ag）选择方法所取代，称为反向疫苗学 （RV）。它利用原子级三维信息来设计具有改进的免疫学和/或生化特性的Ag。各种计算方法，包括合理的、基于结构的设计、蛋白质设计算法和抗体特异性建模技术，都可以帮助抗体的设计。
Rosetta是一种精度预测和设计大分子结构的软件。Rosetta包含用于蛋白质结构预测和设计的软件包和框架，能够根据蛋白质的氨基酸序列有效预测蛋白质的结构，并且可以从头设计各种类型的全新蛋白质。随着基于结构的抗体设计领域在过去几年中迅速发展，在过去十年中，Rosetta系列算法的蛋白设计在创新蛋白药物、抗体、疫苗、新型合成生物学元件及纳米药物等生物大分子研究领域中被广泛使用。如今，计算机深度学习开发和设计这些分子的计算方法越来越多地用于补充传统的实验室流程，与治疗性抗体开发相关的时间和成本预计会减少。这有望使免疫疗法对患者来说更加负担得起，并扩大其对更多疾病的适用性。
SPG4是编码Spastin的基因，是与各种细胞活动相关的AAA（ATPase associatedwith various cellular activities）结构域。Spastin蛋白在神经系统的发育中高度表达，大量研究表明Spastin在神经发育、轴突再生、树突棘成熟以及轴突运输发挥着关键作用。Spastin最早在遗传性痉挛性截瘫（HSP）中报道，在约40%的常染色体显性遗传性痉挛性截瘫（AD-HSP）病例中发生突变。遗传性痉挛性截瘫（HSP）是一种遗传性的神经退行性疾病，这组神经退行性疾病的特征是进行性痉挛和下肢无力，伴有皮质脊髓束和背柱中末端轴突的变性。在大多数人群中的患病率为1.8/100000。目前的研究表明，编码 Spastin的SPG4基因的致病性突变会导致遗传性痉挛性截瘫（HSP）的发生。此外，近期有研究成果表明Spastin在脊髓损伤的修复过程中也发挥着重要功能和作用。针对Spastin的研究一直是研究关注的热点。目前市面上针对Spastin的抗体，仍是通过传统的动物免疫平台技术开发的，通过抗原免疫动物以引发免疫应答而产生的。该方法研发周期长、成本较高且抗体制备灵活性低。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明通过设计针对Spastin抗原表位的人源性重组抗体，并提供了其制备方法和应用，所得到的抗Spastin抗体具有优异的Spastin蛋白结合活性，灵敏度高，特异性良好。为后续开发针对Spastin相关的靶向治疗抗体的开发提供理论基础。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了一种抗Spastin抗体，包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3中的任意一种，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中的任意一种。
作为优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本发明第二方面提供了一种编码上述抗Spastin抗体的核苷酸分子，所述核苷酸分子中，编码重链可变区的核苷酸序列选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9中一种或多种；编码轻链可变区的核苷酸序列选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12中一种或多种。
作为优选地，所述编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，且编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；或，所述编码重链可变区的核苷酸序列如SEQID NO：8所示，且编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；或，所述编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，且编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
本发明第三方面提供了一种重组表达载体，包括上述编码抗Spastin抗体的核苷酸分子。
作为优选地，所述重组表达的载体选自质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体中的一种或多种。
本发明第四方面提供了一种重组细胞，包括上述重组表达载体。
作为优选地，所述重组细胞选自S2细胞、CHO细胞、NSO细胞、COS细胞、BHK细胞、BL21细胞、sf9细胞、sf21细胞、DH5α细胞、293FT、Hela细胞中的一种或多种。
本发明第四方面提供了上述抗Spastin抗体的制备方法，包括如下步骤：
（1）以重链可变区序列和轻链可变区序列作为模板序列进行特异性引物设计，并使用特异性引物PCR对模板序列进行扩增获得重链片段和轻链片段；
（2）分别在载体中酶切插入经步骤（1）PCR扩增获得的重链片段和轻链片段，并转化至大肠杆菌中，筛选阳性单克隆菌落并扩增，分别提取得到重链表达质粒和轻链表达质粒；
（3）将得到的重链表达质粒和轻链表达质粒克隆至载体中获得重组质粒；
（4）将步骤（3）得到的重组质粒转染至细胞中得到重组细胞，将重组细胞培养50-200h后离心去除细胞和细胞碎片，再进行过滤即得。
作为优选地，步骤（2）于载体中酶切插入重链片段时的酶切位点为EcoRI和NheI；插入轻链片段时的酶切位点为EcoRI和BsiWI。
作为优选地，步骤（2）中所述大肠杆菌选自DH5α。
作为优选地，步骤（4）中所述细胞选自293FT细胞。
本发明第五方面提供了上述抗Spastin抗体在制备检测Spastin蛋白表达水平的产品中的应用。
应理解的是，在无特别说明的情况下，本发明上下文中所述的“抗体”是指一类能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体以一个或者多个Y字形单体存在，每个Y字形单体由4条多肽链组成，包含两条相同的重链和两条相同的轻链，轻链和重链是根据他们的分子量大小来命名的。Y字形结构的顶端是可变区，为抗原特异性结合部位。每个重链包含恒定区和可变区，所有同一类型的抗体其恒定区都是相同的，不同类型的抗体之间则存在差异。每条轻链也有两个前后相连的结构域，即恒定区和可变区。所述的“载体”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒，本领域技术人员可根据实验需求自行通过市售途径购买，并按照产品说明书进行使用，也可以自行设计和合成。所述的“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、293FT细胞等人或动物细胞。
本发明利用Rosetta设计了三种抗Spastin抗体得到原始蛋白序列，并基于该原始蛋白序列通过密码子优化，得到轻链和重链可变区序列，以此进行了重组Spastin抗体载体的构建，并转染至人源真核293FT细胞中，成功表达和纯化了人源性抗Spastin单克隆抗体。所述人源性抗Spastin单克隆抗体具有优异的Spastin蛋白结合活性，灵敏度高，特异性良好，且相对于其他异种来源的抗体安全性更高，有效避免HAMA等反应的发生，为脊髓损伤等神经性疾病的诊断和治疗提供了新的功能性试剂。
附图说明
图1为轻链和重链可变区PCR扩增产物以及酶切后的pFUSE2ss-CLIg-hk轻链载体示意图；其中A为轻链和重链可变区PCR扩增产物示意图，M为Marker，1、2分别为抗体1片段的轻链或重链，3、4分别为抗体2片段的轻链或重链，5、6分别为抗体3片段的轻链或重链；B为酶切后的pFUSE2ss-CLIg-hk轻链载体示意图，1表示pFUSE2ss-CLIg-hk轻链载体，2表示酶切后的pFUSE2ss-CLIg-hk轻链载体，3表示pFUSEss-CHIg-hG1重链载体，4表示酶切处理后的pFUSEss-CHIg-hG1重链载体。
图2为Spastin重组抗体轻链和重链表达载体示意图。
图3为所构建的3种Spastin抗体轻链及重链表达情况结果示意图。
图4为利用所构建的3种Spastin抗体检测过表达Spastin条带结果示意图。
图5为利用ELISA实验检测构建的3种Spastin抗体与Human-Spastin蛋白的亲和能力结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括293FT等细胞系均按照现有技术进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海Biothrive Sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。本发明所使用的实验方法，例如引物设计、载体构建、细胞转染、蛋白表达和纯化、蛋白电泳、Western blot、ELISA等均为本领域的常规方法和技术。所有实验至少重复三次。
实施例1重组表达载体的构建
利用Rosetta设计三种抗Spastin抗体得到原始蛋白序列，其中抗Spastin抗体1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；抗Spastin抗体2重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；抗Spastin抗体3重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
将三种抗Spastin抗体蛋白序列通过密码子优化，得到轻链和重链可变区序列，其中编码抗Spastin抗体1重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；编码抗Spastin抗体2重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；编码抗Spastin抗体3重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
将得到序列进行合成（北京擎科生物）作为模板序列。根据轻链可变区和重链可变区序列分别设计特异性引物（如下表1所示）。使用引物PCR扩增各自的模板序列，扩增反应条件如下：95℃预变形3min，95℃变性15s，67℃退火15s，72℃延伸1min，共进行34个循环，72℃彻底延伸5min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。选择pFUSE2ss-CLIg-hk载体（InvivoGen，cat.no.#pfuse2ss-hclk）以EcoRI（NEB，cat.no.#R3101S）和BsiWI（NEB，cat.no.#R3553S）作为酶切位点插入PCR扩增的轻链片段。选择pFUSEss-CHIg-hG1载体（InvivoGen，cat.no.#pfusess-hchg1）以EcoRI和NheI（NEB，cat.no.#R3131S）为酶切位点插入PCR扩增的重链片段。使用ExnaseⅡ连接酶连接载体和目的片段，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中，将连接得到的重链或轻链涂分别布于含博来霉素或灭瘟素S的LB平板上，37℃培养14h，筛选阳性单克隆菌落并扩增，分别提取得到pFUSEss-CHIg-hG1重链表达质粒和pFUSE2ss-CLIg-hk轻链表达质粒。GFP-Spastin质粒序列如SEQ ID NO：13所示。所有的质粒均通过测序验证。
表1 轻链及重链可变区引物
从模板质粒扩增轻链可变区序列和重链可变区序列，轻链可变区通过内切酶EcoRI和BsiWI消化，并将它连接到pFUSE2ss-CLIg-hk载体。重链可变区通过内切酶Eco RI和Nhe I消化，随后将它连接到pFUSEss-CHIg-hG1载体。从模板质粒中扩增出完整的轻链可变区序列和重链可变区序列（参见图1A）。轻链可变区序列和重链可变区序列片段大小分别约为330bp和366bp（参见图1A），结果与预期大小一致。pFUSE2ss-CLIg-hk和 pFUSEss-CHIg-hG1载体质粒经过内切酶线性化处理（参见图1B）。将获得的轻链可变区序列和重链可变区序列片段克隆到pFUSE2ss-CLIg-hk和pFUSEss-CHIg-hG1载体中（参见图2），完成质粒重组。重组载体均进行了测序以核实序列准确性。
实施例2人源性Spastin重组抗体的表达和验证
（1）将处于对数生长期的293FT细胞按照3×105个/孔的密度接种到10cm培养皿中。
（2）当细胞生长至30-40%汇合度时分别加入实施例1制备得到的轻链及重链重组表达载体进行转染；转染所使用的试剂为Lipofectamine 2000（Invitrogen，cat.no.#11668019），按照试剂盒说明书进行操作，其中pFUSEss-CHIg-hG1重链表达质粒和pFUSE2ss-CLIg-hk轻链表达质粒的摩尔比为1：1.5。
（3）培养120h后，收集培养液，1000rpm离心5min去除细胞。
（4）于4℃、12000rpm下离心30min去除细胞碎片，再利用0.22μm过滤器进行过滤，即得人源性抗Spastin重组抗体，并置于-20℃保存。
随后，取上述制备得到的3种人源性抗Spastin重组抗体，利用SDS-PAGE和Westernblot进行检测，具体步骤如下：
（1）将上述制备得到的3种人源性抗Spastin重组抗体制备成蛋白电泳样品并上样进行SDS-PAGE蛋白电泳。
（2）电泳结束后转膜至PVDF（聚偏二氟乙烯膜）上，随后在含有5%脱脂牛奶（BDDifco，cat.no.#232100-500G）的TBST缓冲液中室温封闭1h。
（3）采用一抗（Anti-GFP [Abcam，cat.no.#ab290]，1：1000）于4℃下摇床过夜孵育。
（4）一抗孵育结束后采用1×TBST缓冲液室温下洗膜3次，每次15min。
（5）将PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（Anti-Human IgG（H+L）[Abclonal，cat.no.#AS002，1：5000]、Anti-Human IgG1（Fc）[Abclonal，cat.no.#AS092]，1：5000）于室温下孵育2小时；孵育结束后采用ECL试剂进行化学成像分析。
检测结果如图3所示。SDS-PAGE检测结果显示，在55kDa和25kDa位置均能检测到表达程度一致条带，三种抗体的轻链和重链均能成功表达，这表明三种Spastin抗体表达载体均构建成功（图中1-3分别代表本发明制备得到的3种抗Spastin抗体anti-Spastin-1，anti-Spastin-2，anti-Spastin-3）。
实施例3抗体活性检测
首先采用Western blot检测上述制备得到的3种抗Spastin抗体对Spastin蛋白的结合能力，具体步骤如下：
（1）采用Lipo2000将GFP-Spastin质粒转染至293FT细胞中。
（2）48h后，弃培养基，采用胰酶消化细胞，用PBS清洗两遍后加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解1h。
（3）于4℃、15000g离心15min，取上清备用。
（4）采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，并加入细胞裂解液调整样品浓度后加入loading buffer，95℃水浴5min，备用。
（5）取步骤（4）得到的蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳。
（6）电泳结束后转膜至PVDF上，随后在含有5%脱脂牛奶（BD Difco，cat.no.#232100-500G）的TBST缓冲液中室温封闭1h。
（7）分别采用上述方法制备得到的3种抗Spastin抗体（anti-Spastin-1，anti-Spastin-2，anti-Spastin-3），于4℃下摇床过夜孵育。
（8）一抗孵育结束后采用1×TBST缓冲液室温下洗膜3次，每次15min。
（9）将PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（ HRP Rabbit anti-HumanIgG1（Fc））于室温下孵育2小时；孵育结束后采用ECL试剂进行化学成像分析。
结果如图4所示。结果显示，在70-95kDa之间均有条带（参见图4A）。这与人源性GFP-Spastin过表达载体位置一致（参见图4B）。由此可见，以本发明制备得到的3种抗Spastin抗体作为一抗，能够成功与Spastin蛋白进行特异性结合，表明本发明的抗Spastin抗体具有特异性识别Spastin蛋白的能力（图中1-3分别代表本发明制备得到的3种抗Spastin抗体anti-Spastin-1，anti-Spastin-2,anti-Spastin-3），其中anti-Spastin-2的特异性更强。
随后，利用ELISA实验对本发明3种抗Spastin抗体的亲和能力进行检测，具体步骤如下：
（1）于大肠杆菌系统中构建并表达人源His-Spastin纯蛋白，并稀释至0.2μg/mL。
（2）将上述蛋白加入至96孔ELISA板中，每孔100μL，4℃包被过夜。
（3）采用1% BSA封闭液封闭1h，随后采用PBST洗板3次。
（4）将纯化得到的抗体（anti-Spastin-1，anti-Spastin-2，anti-Spastin-3）分别用0.5% BSA样品稀释液稀释至10μg/mL，以此为起始浓度，进行3倍梯度稀释，共设置11个梯度，并设置无关抗体（赫赛汀）作为阴性对照。
（5）每孔加入100μL抗体，于37℃孵育1h。
（6）采用PBST洗板3次，将HRP标记的山羊抗人IgG Fc用样品稀释液按照1：20000的比例进行稀释，每孔加入100μL，室温孵育1h。
（7）采用PBST洗板4次，每孔加入100μL TMB底物，室温避光孵育10min，随后每孔加入100μL 1M HCl溶液终止显色反应，于多功能酶标仪上测定96孔板中各孔的吸光值（检测波长450nm，参比波长570nm），每孔吸光值（OD）＝OD450nm-OD570nm。
（8）将抗体的浓度取对数后作为横坐标，测得的每孔吸光值为纵坐标，选用Sigmoidal dose-response（Variable Slope）方式进行非线性回归，得到目标抗体与Spastin蛋白的结合曲线。
检测结果如图5所示。结果显示，本发明制备得到的3种重组人源性抗Spastin抗体亲和力良好，在多浓度范围下均可与Spastin蛋白进行结合，灵敏度高，特异性良好。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1. 一种抗Spastin抗体，包含重链可变区和轻链可变区；其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示；或，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2. 一种编码根据权利要求1所述的抗Spastin抗体的核苷酸分子，包含编码重链可变区的核苷酸和编码轻链可变区的核苷酸；其特征在于，所述编码重链可变区的核苷酸的序列如SEQ ID NO：7所示，且编码轻链可变区的核苷酸的序列如SEQ ID NO：10所示；或，所述编码重链可变区的核苷酸的序列如SEQ ID NO：8所示，且编码轻链可变区的核苷酸的序列如SEQ ID NO：11所示；或，所述编码重链可变区的核苷酸的序列如SEQ ID NO：9所示，且编码轻链可变区的核苷酸的序列如SEQ ID NO：12所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括根据权利要求2所述的核苷酸分子。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达的载体选自质粒、噬菌粒、人工染色体中的一种或多种。
5.一种重组细胞，其特征在于，包括根据权利要求3或4所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞选自S2细胞、CHO细胞、NSO细胞、COS细胞、BHK细胞、BL21细胞、sf9细胞、sf21细胞、DH5α细胞、293FT、Hela细胞中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的抗Spastin抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以重链可变区序列和轻链可变区序列作为模板序列进行特异性引物设计，并使用特异性引物PCR对模板序列进行扩增获得重链片段和轻链片段；
（2）分别在载体中酶切插入经步骤（1）PCR扩增获得的重链片段和轻链片段，并转化至大肠杆菌中，筛选阳性单克隆菌落并扩增，分别提取得到重链表达质粒和轻链表达质粒；
（3）将得到的重链表达质粒和轻链表达质粒克隆至载体中获得重组质粒；
（4）将步骤（3）得到的重组质粒转染至细胞中得到重组细胞，将重组细胞培养50-200h后离心去除细胞和细胞碎片，再进行过滤即得。
8.根据权利要求1所述的抗Spastin抗体在制备检测Spastin蛋白表达水平的产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410239020.8A CN117820470B (zh) | 2024-03-04 | 2024-03-04 | 人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410239020.8A CN117820470B (zh) | 2024-03-04 | 2024-03-04 | 人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117820470A CN117820470A (zh) | 2024-04-05 |
| CN117820470B true CN117820470B (zh) | 2024-05-31 |
Family
ID=90519264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410239020.8A Active CN117820470B (zh) | 2024-03-04 | 2024-03-04 | 人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117820470B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001029266A2 (en) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Mcgill University | Identification of arsacs mutations and methods of use therefor |
| US6924126B1 (en) * | 1999-09-03 | 2005-08-02 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Cloning, expression and characterization of the SPG4 gene responsible for the most frequent form of autosomal spastic paraplegia |
| CN107787331A (zh) * | 2015-06-17 | 2018-03-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗her2抗体和使用方法 |
| CN112546229A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-03-26 | 暨南大学 | 一种包含Spastin泛素化修饰抑制剂的药物组合物及其应用 |
| CN115501326A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-12-23 | 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） | 14-3-3蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用 |
-
2024
- 2024-03-04 CN CN202410239020.8A patent/CN117820470B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6924126B1 (en) * | 1999-09-03 | 2005-08-02 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Cloning, expression and characterization of the SPG4 gene responsible for the most frequent form of autosomal spastic paraplegia |
| WO2001029266A2 (en) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Mcgill University | Identification of arsacs mutations and methods of use therefor |
| CN107787331A (zh) * | 2015-06-17 | 2018-03-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 抗her2抗体和使用方法 |
| CN112546229A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-03-26 | 暨南大学 | 一种包含Spastin泛素化修饰抑制剂的药物组合物及其应用 |
| CN115501326A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-12-23 | 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） | 14-3-3蛋白在制备治疗脊髓损伤修复的药物中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Structural basis of microtubule severing by the hereditary spastic paraplegia protein spastin;Antonina Roll-Mecak等;《Nature》;20080117;第451卷(第7176期);第363-367页 * |
| Subcellular localization of spastin: implications for the pathogenesis of hereditary spastic paraplegia;Ingrid K. Svenson等;《Neurogenetics》;20050513;第6卷;第135-141页 * |
| 干扰海马spastin表达通过抑制突触传递介导小鼠认知功能障碍;李志坤等;《中国病理生理杂志》;20210525;第37卷(第05期);第779-788页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117820470A (zh) | 2024-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7289562B2 (ja) | 抗ｂｃｍａ単一ドメイン抗体及びその適用 | |
| CN111978395A (zh) | 抗新型冠状病毒rbd结构域抗原的单克隆抗体 | |
| CN110003335B (zh) | Cd47单域抗体、核酸及试剂盒 | |
| JP2008019276A (ja) | 特異的結合特性を有するβシートタンパク質の設計 | |
| CN110003336B (zh) | Pd-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒 | |
| US20210301000A1 (en) | NS1-Binding Protein and Uses Thereof | |
| CN111138533B (zh) | 针对甲型肝炎病毒的单域抗体及其衍生蛋白 | |
| US20230374115A1 (en) | Novel coronavirus rbd specific monoclonal antibody and linear epitope and application thereof | |
| CN108659124B (zh) | 一种抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体及其应用 | |
| CN108059676B (zh) | 一种抗人神经生长因子scFv抗体及制备方法 | |
| CN117126280B (zh) | 具有亲水性氨基酸残基的抗人bcma纳米抗体及car-t和应用 | |
| CN111138532B (zh) | 针对甲型肝炎病毒的单域抗体的应用 | |
| CN117820470B (zh) | 人源性重组抗Spastin抗体及其制备方法和应用 | |
| WO2010105446A1 (zh) | 抗人肿瘤坏死因子受体α单抗及其应用 | |
| CN108484770B (zh) | 重组大鼠抗小鼠cd4单克隆抗体，制备方法和应用 | |
| CN115925904B (zh) | 一种新冠病毒单克隆中和抗体及其应用 | |
| CN115925947B (zh) | 一种亲和力成熟方法及抗人pd-l1单域抗体的亲和力成熟 | |
| CN116253800B (zh) | 一种抗cldn18.2的重链抗体、相关产品和用途 | |
| CN114605555B (zh) | 一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的双特异中和抗体及其应用 | |
| CN113912729B (zh) | 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
| CN112062849B (zh) | Cd47拮抗剂及其用途 | |
| CN114560930B (zh) | 抗新型冠状病毒的广谱中和抗体及其应用 | |
| CN110003334B (zh) | 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 | |
| CN115724973B (zh) | 抗人ror1高亲和力兔单克隆抗体及其应用 | |
| US8332159B2 (en) | Method for enhancing efficacy of preparation of monoclonal antibody |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |