CN117802204A

CN117802204A - 一种突变位点富集式叠瓦探针、试剂盒、设计方法及应用

Info

Publication number: CN117802204A
Application number: CN202410006700.5A
Authority: CN
Inventors: 李彬; 郭琼钰; 何彬; 周雪; 王蓉; 李拼; 范渊; 曹现涛; 魏光; 陆亚平
Original assignee: Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd; Sinopharm Medical Laboratory Wuhan Co Ltd; Sinopharm Genomics Technology Co Ltd
Current assignee: Sinopharm Wuhan Precision Medical Technology Co ltd; Sinopharm Medical Laboratory Wuhan Co Ltd; Sinopharm Genomics Technology Co Ltd
Priority date: 2024-01-03
Filing date: 2024-01-03
Publication date: 2024-04-02

Abstract

本申请提供了一种突变位点富集式叠瓦探针、试剂盒、设计方法及应用，突变位点富集式叠瓦探针的设计方法包括以下步骤：设计针对待检测基因的多个探针；将多个探针交错摆放，实现对所有待检测基因区域的2X覆盖；针对突变位点，将探针序列设计为突变位点的互补序列；对于难捕获的位点，增加一层探针，使得难捕获的位点达到3X覆盖。本申请的一种突变位点富集式叠瓦探针可以使得临床有意义的突变位点能达到3X的覆盖，提高了突变频率低的位点在样本中的富集率及检出率。本申请的一种包括该突变位点富集式叠瓦探针试剂盒应用在检测EGFR基因中，在实现EGFR基因检测的同时，显著提高突变位点捕获效率及检出率。

Description

一种突变位点富集式叠瓦探针、试剂盒、设计方法及应用

技术领域

本申请属于基因检测技术领域，更具体地说，是涉及一种突变位点富集式叠瓦探针、试剂盒、设计方法及应用。

背景技术

肿瘤二代测序基因检测中，需要对靶向基因区域进行富集。靶向富集主要实现方式有两种，一是通过多重PCR直接扩增靶区域，二是通过寡核苷酸探针，对预文库杂交捕获实现。由于多重PCR存在交叉扩增和扩增效率不均一等原因，适用场景有限。基于探针(Probe&Panel)的杂交富集方式，既兼容多种变异类型检测，也易于优化，获得较佳的测序均一性，因而得到了广泛应用。针对通用需求，已有多家公司提供目录化Panel及杂交捕获方案，例如全外显子和泛癌种应用。直接购买商品化Panel比从头设计更加值得推荐，因为这些Panel通常已经过验证和优化。但当某些实验或者检测需要针对特定基因、固定疾病或者特殊信号通路时，则需要定制Panel的设计合成。定制Panel设计需要考虑到靶区域的选择、探针位置和方式，这些因素都与捕获效果直接相关。

EGFR G719S位点在结直肠癌、肺癌中经常出现，临床对应的推荐用药是西妥昔单抗、厄洛替尼、吉非替尼，在NSCLC少见EGFR突变中，G719X突变(包括G719S、G719A、G719C和G719D)是仅次于外显子20插入突变的较常见突变之一，约占NSCLC所有EGFR突变的1.53％，比例较低，如何准确检出该位点，为临床提供辅助诊断及治疗建议尤其重要。

针对EGFR基因突变位点的检测，一般探针放置的位置会有三种：叠瓦式、头尾相连、间隔式，叠瓦式的捕获均一性会更好，也是现在厂家通常使用的放置方式。一般肿瘤样本中，针对临床有意义的位点突变频率并非100％，有的突变频率低的只有1％，也就意味着需要在100条野生型DNA中捕获到其中1条突变型的DNA，如果使用常规的叠瓦式探针，会倾向捕获野生型DNA，即其对于像EGFR基因这种临床有意义难捕获的突变位点的捕获效果及检出率不理想，因此，常规叠瓦式设计的探针的富集效果仍然有待提高。

发明内容

本申请的目的在于提供一种突变位点富集式叠瓦探针、试剂盒、设计方法及应用，以解决现有技术中的常规叠瓦式设计的探针对于像EGFR基因这种临床有意义难捕获的突变位点的捕获效果及检出率不理想的技术问题。

为实现上述目的，本申请的第一方面，提供了了一种突变位点富集式叠瓦探针的设计方法，包括以下步骤：

设计针对待检测基因的多个探针；

将所述多个探针交错摆放，实现对所有待检测基因区域的2X覆盖；

针对突变位点，将探针序列设计为所述突变位点的互补序列；

对于难捕获的位点，增加一层探针，使得难捕获的位点达到3X覆盖。

本申请的第二方面，提供了一种突变位点富集式叠瓦探针，采用上述所述的设计方法得到。

本申请的第三方面，提供了一种试剂盒，包括上述所述的一种突变位点富集式叠瓦探针。

本申请的第四方面，提供了一种突变位点富集式叠瓦探针在检测EGFR基因中的应用。

进一步地，采用的叠瓦探针的序列如SEQ ID NO:1～56所示。

本申请的第五方面，提供了一种试剂盒在检测EGFR基因中的应用。

进一步地，采用的叠瓦探针的序列如SEQ ID NO:1～56所示。

进一步地，检测过程包含如下步骤：准备DNA样本库、DNA文库的构建、检测探针与DNA文库杂交并基于下一代测序技术进行检测、生信分析识别突变、突变解读并根据解读结果出具报告。

与现有技术相比，本申请具有以下的技术效果：

常规的叠瓦式探针会倾向捕获野生型DNA，而本申请的突变位点富集式叠瓦探针可以有效富集突变型DNA，抑制野生型DNA的结合，提高肿瘤临床有意义位点的捕获效率及检出率。本申请的一种突变位点富集式叠瓦探针可以使得临床有意义的突变位点能达到3X的覆盖，提高了突变频率低的位点在样本中的富集率(捕获率)及检出率。

本申请的一种包括该突变位点富集式叠瓦探针试剂盒应用在检测EGFR基因中，在实现EGFR基因检测的同时，显著提高突变位点捕获效率及检出率。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本申请实施例1提供的常规头尾相连的探针的设计示意图；图1B为本申请实施例1提供的常规叠瓦式探针的设计示意图；图1C为本申请实施例1提供的采用本发明的突变位点富集式叠瓦探针的设计示意图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

实施例1

本申请实施例1提供一种突变位点富集式叠瓦探针的设计方法，包括以下步骤：

(1)设计针对待检测基因的多个探针；

(2)将多个探针交错摆放，实现对所有待检测基因区域的2X覆盖；

(3)针对突变位点，将探针序列设计为突变位点的互补序列；

(4)对于难捕获的位点，增加一层探针，使得难捕获的位点达到3X覆盖。

具体地，以待检测基因EGFR G719S c.2155位点为例进行说明，野生型该位点为G碱基，如果按照常规叠瓦式探针设计，会将该位点的碱基设为C，如图1B，而且常规的叠瓦式探针是逐层往上叠加，在某些区域如图中虚线范围内，实际覆盖只有1X；而采用本发明的突变位点富集式叠瓦探针设计，如图1C，将探针交错摆放，实现所有区域均为2X的覆盖，而且针对突变位点，将探针序列设计为突变位点的互补序列T，对于难捕获的位点，会针对性加一层探针，使得临床有意义的位点能达到3X的覆盖，这样可提高突变频率低的位点在样本中的富集率(捕获率)及检出率。

将采用常规头尾相连的探针设计得到的探针组记作A组，采用常规叠瓦式探针设计得到的探针组记作B组，采用本发明的新的叠瓦式设计得到的突变位点富集式叠瓦探针组记作C组，三种探针的设计如图1。

实施例2

本申请实施例2提供一种突变位点富集式叠瓦探针在检测EGFR基因中的应用，该检测过程主要包含如下步骤：准备DNA样本库、DNA文库的构建、检测探针与DNA文库杂交并基于下一代测序技术进行检测、生信分析识别突变、突变解读并根据解读结果出具报告。

针对EGFR基因，设计出了包括如SEQ ID NO:1～56所示序列的探针。

具体检测过程包括以下步骤：

1、样本制备

对于标准品，无需提取，直接按下步所需取量，对于石蜡包埋组织样本，使用QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，血液样本使用诺唯赞DC112手动提取试剂盒，严格按照说明书步骤进行操作。所提DNA需要进行定量检测，提取后的DNA使用dsDNAHS Assay Kit及配套仪器进行检测，提取总量应不少于50ng。

2、DNA文库构建及杂交捕获

分别使用常规头尾相连的探针(A组)、常规式叠瓦探针(B组)及本发明的突变位点富集式叠瓦探针(C组)进行杂交捕获。

DNA文库构建具体过程为：

2.1基因组DNA片段化，末端修复、3’端加“A”

2.1.1将试剂Fragment&ERA Enzyme Mix、Fragment&ERA Buffer置于冰盒上融化，按如下表格配置反应体系：

2.1.2涡旋仪调成Touch模式，振荡8次，低速离心3秒，重复上述操作一次。

2.1.3运行PCR程序，设置PCR仪参数如下，当程序运行至4℃后将PCR管从冰盒上拿出放置PCR仪中继续运行程序：热盖温度85℃，4℃for 1min，37℃for 18min(全血样本：18min，FFPE：8min)，65℃for 30min，4℃hold。

2.1.4程序运行完成后立即进行下步连接反应。

2.2接头连接

2.2.1在上述反应的PCR管中，按照下表在冰盒上配制反应体系：

2.2.2使用移液器吸打混匀(避免剧烈震荡混匀)，短暂离心。

2.2.3运行PCR仪程序(关闭热盖)，设置PCR仪参数如下：关闭热盖，体积设置100ul；22℃for 15min；4℃for∞。

2.3连接后纯化

2.3.1将Agencourt AMPure XP磁珠从4℃冰箱取出至室温，涡旋震荡混匀后备用。

2.3.2在Step2的连接产物中，加入0.8倍体积的磁珠(88μL)，涡旋震荡混匀或吸打混匀，室温静置5min。

2.3.3短暂离心，并将PCR管置于磁力架上3min待溶液澄清。

2.3.4保持PCR管在磁力架上，移除上清，向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s。

2.3.5保持PCR管在磁力架上，移除上清，再次向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(可使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液)。

2.3.6室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。

2.3.7加入22μL的Nuclease-free Water，将PCR管从磁力架取下，涡旋震荡混匀或吸打混匀，室温静置2min。

2.3.8短暂离心，将PCR管置于磁力架上2min待溶液澄清。

2.3.9用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)，做好标记，准备下一步反应。

2.4Pre-PCR反应

2.4.1从-20℃冰箱中取出PCR MasterMix、UDIPrimer，置于冰盒上溶解，混匀后置于冰上待用。

2.4.2按照对应体系在冰盒上进行配制PCR反应体系：

2.4.3涡旋震荡混匀或吸打混匀，然后短暂离心。

2.4.4将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：热盖温度105℃，体积设置50ul；98℃for 2min；98℃for 20s，60℃for 30s，72℃for 30s，6cycles；72℃for 1min；4℃hold。

2.5PCR扩增后纯化

2.5.1将Agencourt AMPure XP磁珠从4℃冰箱取出至室温，涡旋震荡混匀后备用。

2.5.2在上述PCR产物中，加入1倍体积的磁珠(50μL)，涡旋震荡混匀或吸打混匀，室温静置5min。

2.5.3短暂离心，并将PCR管置于磁力架上3min待溶液澄清。

2.5.4保持PCR管在磁力架上，移除上清，向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s。

2.5.5保持PCR管在磁力架上，移除上清，再次向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(可使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液)。

2.5.6室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。

2.5.7加入30μL的Nuclease-free Water，将PCR管从磁力架取下，涡旋震荡混匀或吸打混匀，室温静置2min。

2.5.8短暂离心，将PCR管置于磁力架上2min待溶液澄清。

2.5.9用移液器吸取28μL上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)，做好标记。

2.6Qseq100检测文库片段分布

2.6.1按仪器操作流程检测文库片段大小主峰在270-350bp为合格。

2.7文库混合封闭与浓缩

2.7.1预先从-20℃冰箱取出Un-Blocker，Human Cot-1 DNA，放于冰盒上融化，融化后混匀置于冰上或4℃待用。

2.7.2取1000ng文库加入PCR管中，做好标记。多个文库混合杂交时，每个文库加入500ng。

2.7.3按下表向PCR管中加入杂交反应体系：

2.7.4涡旋震荡，充分混匀上述反应体系，瞬时离心，将所有组分收集到管底。

2.7.5将PCR管(8联排管)置于真空旋转蒸发仪中，55-60℃真空旋转，1500rpm，将反应液蒸干。

2.8文库杂交捕获

2.8.1从-20℃或4℃取出HYB-Buffer，Enhancer，Panel Probe；HYB-Buffer振荡混匀。

2.8.2预先启动PCR程序Hybrid 2。

2.8.3向上述蒸干的PCR管(8联排管)中加入以下试剂：

2.8.4用涡旋振荡器振荡混匀，室温放置5-10min，再次振荡均匀，瞬时离心。

2.8.5在PCR仪上进行循环孵化，程序如下(Hybrid 1)：热盖温度105℃，体积设置20μL；9℃for 5min。

2.8.6振荡混匀，瞬时离心。

2.8.7立即放置于PCR仪器中进行65℃过夜杂交,(Hybrid 2)：热盖温度75℃，体积设置20μL；65℃hold。

2.9准备洗脱液

2.9.1按照N个杂交反应数配置足量洗脱液：

2.9.2将以下试剂在PCR仪或金属浴65℃放置至少15min。

S-W：将S-W置于65℃金属浴预热；或每PCR管加入150μL预热。

W1：取杂交反应同等数量，置于EP管中于金属浴加热，或每PCR管中加入120μL预热。

2.9.3将以下试剂放置在室温：

WⅠ：上述配置的，150μL/rxns，室温放置；

WⅡ：上述配置的，150μL/rxns，室温放置；

WⅢ：上述配置的，150μL/rxns，室温放置。

2.10准备链霉亲和素磁珠

2.10.1按N个杂交反应加入N*50μL ProbeCap SA Beads，转入PCR管或EP管中。

2.10.2将上步骤含磁珠的PCR管或者EP管放置在的磁力架上，待溶液与磁珠分离。

2.10.3弃上清，保留磁珠。

2.10.4按N个杂交反应加90*NμL的1X BWB，涡旋震荡10sec。

2.10.5将上步骤含磁珠的PCR管或者EP管放置在的磁力架上，待溶液与磁珠分离。

2.10.6弃上清，保留磁珠。

2.10.7重复步骤2.10.4-2.10.6一次，共洗涤磁珠两次。

2.10.8按照N个杂交反应加入50*NμL的1X BWB，充分振荡混匀备用。

2.10.9将磁珠混合液按每个杂交反应50μL分装至新的PCR管(8联排管)中。

2.11文库与链霉亲和素磁珠结合

2.11.1将上步的PCR管(8联排管)放置在磁力架上，待溶液与磁珠分离，弃上清保留磁珠；马上进行下个步骤，避免磁珠在空气中过度暴露。

2.11.2将上步含磁珠的PCR管(8联排管)放于65℃PCR仪中。

2.11.3将上述步骤中的过夜杂交后的反应液16μL全部转移至含SA磁珠的PCR管(8联排管)中，立即涡旋震荡混匀。

2.11.4在65℃杂交PCR仪器(Hybrid 2)中继续反应30-45min。

2.11.5每10-12min取出振荡5sec，立即放入PCR仪器中进行反应，直至满足总反应时间。

2.1265℃热洗脱去除未结合的DNA

2.12.1向上步骤反应完毕的PCR管(8联排管)中加入120μL 65℃预热的1X WⅠ洗液,快速涡旋震荡混匀或快速用移液器吸打混匀。

2.12.2在65℃PCR仪上温浴10-20sec，迅速放回磁力架上，尽快吸弃上清。

2.12.3向上步PCR管(8联排管)中加入150μL 65℃预热的S-W，涡旋震荡混匀。

2.12.4将PCR管(8联排管)放置于PCR仪上进行65℃温浴，并准确及时5min。

2.12.5将PCR管(8联排管)放置于磁力架上，待溶液与磁珠分离，迅速吸弃上清。

2.12.6重复步骤2.12.3-2.12.5一次，S-W共清洗磁珠两次。

2.13室温洗脱

2.13.1在上步PCR管(8联排管)中加入140μL室温的1X WⅠ洗液。

2.13.2每次涡旋30sec，间隔4次，共振荡2min，充分悬浮磁珠。

2.13.3将PCR管(8联排管)置于磁力架上，待溶液与磁珠分离，弃上清。

2.13.4在上步PCR管(8联排管)中加入140μL室温的1X WⅡ洗液。

2.13.5每次涡旋30sec，间隔2次，共振荡1min，充分悬浮磁珠。

2.13.6将PCR管(8联排管)置于磁力架上，待溶液与磁珠分离，弃上清。

2.13.7在上步PCR管(8联排管)中加入140μL室温的1X WⅢ洗液。

2.13.7涡旋震荡混匀，将混合液转移至新的PCR管(8联排管)中。

2.13.8将PCR管(8联排管)置于磁力架上，待溶液与磁珠分离，弃上清。

2.13.9在PCR管(8联排管)中加入23μL Nuclease-free water。

2.14捕获文库PCR富集与文库纯化

2.14.1捕获后需要对DNA文库进行PCR扩增，根据下表配制反应体系：

2.14.2简短涡旋震荡，瞬时离心。

2.14.3运行PCR仪程序(Post PCR)：热盖温度105℃；98℃for45 s；98℃for 15s，57℃for 30s，72℃for 30s(该步骤12*cycles)；72℃for 1min；4℃hold。

2.14.4PCR结束后向样品加入50μL Agencourt AMPure XP磁珠，涡旋震荡混匀或吸打混匀，室温静置5min。

2.14.5短暂离心，并将PCR管置于磁力架上3min待溶液澄清。

2.14.6保持PCR管在磁力架上，移除上清，向PCR管内加入200μL 80％乙醇溶液，静置30s。

2.14.7保持PCR管在磁力架上，移除上清，再次向PCR管内加入200μL80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(可使用10μL移液器移除底部残留乙醇溶液)。

2.14.9室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。

2.14.9加入25μL的Nuclease-free water，将PCR管从磁力架取下，震荡混匀或吸打混匀10次，室温静置2min。

2.14.10短暂离心，将PCR管置于磁力架上2min待溶液澄清。

2.14.11用移液器吸取23μL上清液转移到1.5mL离心管，标记样品信息。

2.14.12取1μL文库使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度在1-20ng/μL为合格。

2.14.13取1μL样品使用Qsep100按照2.6步骤进行片段长度测定，文库主峰长度约在270bp-500bp间为合格。

2.14.14进行文库质检，合格后上机测序。

3、对测序结果进行生物信息学分析，获得检测样本的突变结果

使用illuminaNovaseq6000测序仪测序，测序后，软件生成FASTQ文件，其中包含每个样品的序列和质量分数。然后将FASTQ文件与参考基因组对齐，生成BAM文件，处理不同改变类型(SNV、小插入或缺失、扩增、易位和MSI)的变体calling。

比对测试的三种数据结果，如表1所示，三组探针的数据质控，可以看到本发明的探针捕获效率(TargetRate)能达到90.95％，其他两种只能达到近80％的捕获效率。大于30X的覆盖度(均一性)也是本发明的效果最好。

表1

表2-4对比了三组探针对于标准品位点的检出性能，可以看到在位点检出方面，本发明探针能全部检出，但是常规式叠瓦探针在低频突变中漏检了2个，常规头尾相连探针更是漏检了3个，其中常见的临床有意义的位点EGFR G719S均未检出，但是本发明探针对于EGFR G719S位点能准确检出并与参考值相同。

表2

表3

表4

使用临床样本按照本实施例中的步骤提取，建库，测序，分析。可以看到临床样本中虽然捕获率较标准品中整体偏低，但是本发明的探针仍然表现的最好(表5)，而且在位点检出中，突变频率更接近真实值(表6-8)。

表5临床样本质控结果

表6临床样本检出结果

表7临床样本检出结果

表8临床样本检出结果

以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种突变位点富集式叠瓦探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

设计针对待检测基因的多个探针；

2.一种突变位点富集式叠瓦探针，其特征在于，采用权利要求1所述的设计方法得到。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的一种突变位点富集式叠瓦探针。

4.如权利要求2所述的一种突变位点富集式叠瓦探针在检测EGFR基因中的应用。

5.如权利要求4所述的一种突变位点富集式叠瓦探针在检测EGFR基因中的应用，其特征在于，采用的叠瓦探针的序列如SEQ ID NO:1～56所示。

6.如权利要求3所述的一种试剂盒在检测EGFR基因中的应用。

7.如权利要求6所述的一种试剂盒在检测EGFR基因中的应用，其特征在于，采用的叠瓦探针的序列如SEQ ID NO:1～56所示。

8.如权利要求6所述的一种试剂盒在检测EGFR基因中的应用，其特征在于，检测过程包含如下步骤：准备DNA样本库、DNA文库的构建、检测探针与DNA文库杂交并基于下一代测序技术进行检测、生信分析识别突变、突变解读并根据解读结果出具报告。