CN117802027A

CN117802027A - 盐单胞菌j9u及其衍生菌的构建方法、pha制备方法与应用

Info

Publication number: CN117802027A
Application number: CN202410041341.7A
Authority: CN
Inventors: 刘瑞华; 杨超; 王思琪
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2024-01-11
Filing date: 2024-01-11
Publication date: 2024-04-02

Abstract

本发明提供了一种盐单胞菌J9U及其衍生菌的构建方法、PHA制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明将upp基因的上下游同源臂序列与自杀质粒pK18mobsacB连接，得到打靶载体pK18Δupp，将其转入到渴望盐单胞菌J9中，发生两次同源重组，即得J9U，该构建方法同源重组效率极高，高达100％。J9UΔxylD‑P8xylA菌株利用木糖为唯一碳源发酵生产PHA的最高产量为2.81g/L，且该菌株在木糖和葡萄糖共利用方面是一株优势的底盘菌株，在木质纤维素生物转化方面具有优越的生长和PHA产量优势，极大地降低了生产成本。

Description

盐单胞菌J9U及其衍生菌的构建方法、PHA制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种盐单胞菌J9U及其衍生菌的构建方法、PHA制备方法与应用。

背景技术

工业生物技术是指通过微生物发酵或无细胞生物催化，在温和的条件下将原材料转化为所需的化学物质、材料和能源的技术，它可以有效缓解环境污染问题，实现可持续发展。但现有工业生物技术存在许多缺点：易发生微生物污染，对生物反应器、操作人员、发酵条件和发酵程序要求十分严格，微生物生长缓慢，原材料价格昂贵，底物到产物的转化率低，生产过程难以连续，产品分离纯化困难，消耗大量淡水和能源等。这些缺点导致工业生物技术生产成本较高，无法与以低廉的石油为基础的传统化学工业竞争。下一代工业生物技术，是一种低成本生物加工技术，其核心是利用生长在特殊环境中的极端微生物，盐单胞菌(Halomonas spp.)在高盐和碱性环境中能够快速生长，这为限制杂菌生长提供了双重保证。以盐单胞菌为基础开发的下一代工业生物技术可以有效节约淡水和能源、降低发酵过程的复杂性和生产成本。

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate，PHA)是一类在微生物体内广泛存在且呈颗粒状的高分子生物材料。PHA是由不同R型羟基脂肪酸单体通过酯键聚合而成的聚酯，但都含有相同的结构通式，依据单体的侧链组成可以分为两类：若单体是由3～5个碳原子组成的称为短链PHA，若单体是由6～14个碳原子以上组成的称为长链PHA，还有一些是由中长链和短链共同组成的混合类型PHA，如聚羟基丁酸羟基乙酸酯，及3HB和其他超过6个碳原子的3-羟基脂肪酸组成的共聚物。其中均聚物3-羟基丁酸酯(PHB)是微生物中常见的PHA均聚物。

目前，研究人员已开发了适用于盐单胞菌的多种基因编辑工具和调控元件，以快速获得优良的目标性状。盐单胞菌Halomonas bluephagenesis是清华大学陈国强团队从新疆艾丁湖中分离出来的，该菌株可在不灭菌条件下，在海水中生长数周至数月不被污染。H.bluephagenesis TD01是以葡萄糖为主要碳源生产PHA和其他高价值化合物的下一代工业生物技术开发的理想底盘生物。Fu等建立了质粒接合转化到嗜盐菌中的方法，并利用自杀载体pRE1126I-SceI建立了无标记的基因敲除技术。这是一种兼具同源重组与位点特异性重组特点的重组系统—Ⅰ-SceⅠ基因敲除系统。Ⅰ-SceⅠ是在S.cerevisiae中发现的一种非固定内含子编码的核酸内切酶。同Flp/FRT和Cre/loxP一样，这种酶也能识别一个大小为18bp的特异性识别位点，但与上述二者不同的是，该种内切酶发挥作用时，会引起识别位点处的DNA分子双链断裂，从而诱导菌株基因组自身的SOS应急修复系统，实现基因的无痕敲除。但目前该方法耗时长且效率低，无法敲除基因组大片段，限制了它的应用范围，迫切需要一种高效的基因编辑方法。

寻找廉价碳源作为PHA发酵的底物能够有效降低PHAs的生产成本，提高PHAs的市场竞争力，同时能实现一些废弃资源的回收再利用从而解决一系列环境污染问题，如木质纤维素。目前，木质纤维素作为地球上最丰富以及最便宜的可再生生物质资源，其广泛存在于林木、农业废弃物如小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆等，能够有效利用这些废弃生物质资源转化生产高附加值化学品PHAs，可以大大降低PHAs的底物生产成本。通常木质纤维素包括40～50％的纤维素、20～50％的半纤维素和20～30％的木质素，以木质纤维素作为底物之前需要首先将其用酸或碱进行预处理，破坏木质纤维素的结构后再通过纤维素酶和半纤维素酶酶解的方式获得木质纤维素水解液，最后微生物便能够利用这些发酵糖生产PHAs。

木质纤维素水解后的产物除葡萄糖外，木糖是木质纤维素水解物中最丰富的戊糖，纤维二糖同样也是木质纤维素水解物中丰富的二糖，能够同时有效利用葡萄糖、木糖或纤维二糖生产PHA，对于木质纤维素水解液发酵生产是至关重要的。目前，Tan等人利用盐单胞菌H.bluephagenesis进行木糖代谢途径改造，由于其不能天然利用木糖，首先引入了四种不同的木糖特异性转运蛋白，但木糖只能转运而不被消耗，来自大肠杆菌的木糖异构酶xylA的进一步表达使细胞能够利用木糖积累0.39g/L的聚-3-羟基丁酸酯(PHB)，木酮糖激酶的额外过表达以将碳通量引导到磷酸戊糖途径中降低了PHB的产生。随后又通过引入D-塔格糖-3-差向异构酶、岩藻激酶和岩藻糖磷酸醛缩酶来构建核酮糖-1-磷酸途径，重组菌株的PHB产量为0.87g/L，细胞干重达到2.09g/L。最后，通过过量表达外源性磷酸酮酶引入了另一种碳高效磷酸酮酶途径，该途径将细胞干重和PHB滴度分别提高到1.88g/L和1.2g/L，这是第一篇关于H.bluephagenesis利用木糖的报道，将为利用木糖生产工业聚羟基烷酸酯提供有益的工程策略，但该改造过后细胞干重仍然较低，且在10g/L葡萄糖和10g/L木糖的混合糖发酵培养基中，葡萄糖的存在会抑制木糖的利用，因此在木质纤维素水解液发酵方面仍然受到极大的限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种盐单胞菌J9U及其衍生菌的构建方法、PHA制备方法与应用，所述盐单胞菌J9U衍生菌能够利用木糖生产聚羟基脂肪酸酯，且得到的聚羟基脂肪酸酯产量高。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种盐单胞菌J9U的构建方法，包括以下步骤：

酶切自杀质粒pK18mobsacB，得到线性化质粒pK18mobsacB；

将upp基因的上下游同源臂序列与线性化质粒pK18mobsacB连接，得到打靶载体pK18Δupp；

将含有打靶载体pK18Δupp的宿主细胞转入渴望盐单胞菌J9中，得到重组菌，重组菌经过两次同源重组，得到盐单胞菌J9U。

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli S17-1λpir；

所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后将双层条带的菌株进行第二次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括重组菌培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；

所述高盐培养基包括60LB培养基，所述60LB培养基的配制方法：25.0g/L LB Mix和60.0g/LNaCl混合即得；所述硫酸卡那霉素的浓度为100μg/mL以上；所述5-氟尿嘧啶的浓度为100μg/mL以上。

本发明还提供了一种盐单胞菌J9U衍生菌，所述盐单胞菌J9U衍生菌基因组中的xylD基因失活，所述盐单胞菌J9U衍生菌包括xylA基因；所述盐单胞菌J9U衍生菌出发菌株为上述构建方法得到的盐单胞菌J9U。

优选的，所述xylD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，所述xylA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；在所述xylA基因上游插入上调xylA基因的启动子，所述启动子为P8启动子，所述P8启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。

本发明还提供了一种上述盐单胞菌J9U衍生菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将upp基因与上述线性化质粒pK18mobsacB连接，得到重组质粒pKJU；

酶切重组质粒pKJU，得到线性化质粒pKJU；

将xylD基因的上下游同源臂序列与线性化质粒pKJU连接，得到打靶载体pKJU-ΔxylD；

将含有上下游同源臂的P8xylA基因序列与线性化质粒pKJU连接，得到打靶载体pKJU-P8xylA；

将打靶载体pKJU-ΔxylD转入上述构建方法得到的盐单胞菌J9U中，得到重组菌J9U，经过两次同源重组后，得到重组菌J9UΔxylD；

将打靶载体pKJU-P8xylA转入重组菌J9UΔxylD中，得到含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD，经过两次同源重组后，得到盐单胞菌J9U衍生菌。

优选的，所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌J9U或含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后将双层条带的菌株进行第二次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括重组菌J9U或含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；

所述高盐培养基包括60LB培养基，所述60LB培养基的配制方法：25.0g/L LB Mix和60.0g/LNaCl混合即得；所述硫酸卡那霉素的浓度为100μg/mL以上；所述5-氟尿嘧啶的浓度为100μg/mL以上；

优选的，所述upp基因为含有启动子的upp基因，所述含有启动子的upp基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.35所示；所述P8xylA的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。

本发明还提供了一种上述盐单胞菌J9U衍生菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。

本发明还提供了一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，将上述盐单胞菌J9U衍生菌在含有木糖的发酵培养基中培养，得到聚羟基脂肪酸酯。

优选的，所述发酵培养基还包括葡萄糖；优选的，所述发酵培养基还包括NH₄Cl；优选的所述发酵培养基还包括葡萄糖和NH₄Cl；

优选的，所述木糖的浓度为10～30g/L；

优选的，所述葡萄糖的浓度为8～12g/L；

优选的，所述NH₄Cl的浓度为10～20g/L；

优选的，所述培养为开放式发酵培养。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种盐单胞菌J9U及其衍生菌的构建方法、PHA制备方法与应用，本发明利用融合PCR技术，构建upp基因的上下游同源臂序列，并与自杀质粒pK18mobsacB连接，构建的打靶载体pK18Δupp，将其插入到渴望盐单胞菌J9中，通过两次同源重组，获得盐单胞菌J9U，该构建方法同源重组效率极高，高达100％。本发明盐单胞菌J9U衍生菌利用木糖为唯一碳源时发酵生产PHA的最高产量为2.81g/L。而且盐单胞菌J9U衍生菌在木糖和葡萄糖共利用方面也展现出更加优越的特性，木糖的不断消耗会促进葡萄糖的共利用，木糖消耗从9.5g/L提高至17g/L，葡萄糖消耗也提高了4g/L，OD₆₀₀在72h能达到20.0左右，约是野生型的2.5倍。盐单胞菌J9U衍生菌在木糖和葡萄糖共利用方面是一株优势的底盘菌株，并且在木质纤维素生物转化方面展现了更加优越的生长优势和PHA产量优势，极大地降低了生产成本。

附图说明

图1为upp基因敲除过程示意图；

图2为野生型H.cupida J9对5-FU抗性的验证结果；

图3为upp敲除载体pK18Δupp构建的PCR验证电泳图，泳道M为MarkerIII，泳道1～6分别为含有质粒pK18Δupp的大肠杆菌DH5α的阳性克隆子；

图4为J9U构建时，单交换菌株PCR验证电泳图，泳道M为MarkerIII；泳道1～24分别为挑取的转化子；泳道25为野生型J9；

图5为底盘菌株J9U构建的双交换PCR验证电泳图，泳道M为MarkerIII；泳道1～15为挑取的克隆子；泳道16为野生型J9；

图6为野生型H.cupida J9和H.cupida J9U对5-FU抗性的验证结果；

图7为打靶载体pKJU的构建图谱；

图8为H.cupida J9U利用反向筛选标记upp结合自杀质粒(pKJU)进行基因敲除原理图；

图9为H.cupida J9U利用反向筛选标记upp结合自杀质粒(pKJU)进行基因插入原理图；

图10为J9UΔxylD-P8xylA工程菌株构建的PCR验证电泳图，泳道：M，Marker；1～2分别为工程菌株J9UΔxylD-P8xylA和野生菌J9U；

图11为RT-PCR检测工程菌株J9UΔxylD-P8xylA中外源基因xylA的转录，泳道：M，Marker；1、基因组DNA为PCR模板；2、cDNA为PCR模板；3、mRNA为PCR模板；4、dH₂O为PCR模板；

图12为工程菌株J9UΔxylD-P8xylA在不同浓度木糖发酵培养基中的生物质积累情况；

图13为不同的工程菌株的生长曲线和木糖消耗曲线，A为不同木糖工程菌株在含有30g/L木糖的木糖发酵培养基中的生长曲线；B为不同的工程菌株在含有30g/L木糖的木糖发酵培养基中的木糖消耗曲线；

图14为野生型J9U、工程菌株J9U-P8xylA以及J9UΔxylD-P8xylA的摇瓶发酵结果；

图15为GC-MS分析工程菌株J9UΔxylD-P8xylA利用木糖发酵生产PHA的单体组成，A为J9UΔxylD-P8xylA木糖发酵产物中所有PHA单体的总离子色谱图(TIC)；B为3-羟基丁酸甲酯的提取离子色谱图(EI)；C为3-羟基月桂酸甲酯的提取离子色谱图(EI)；

图16为木糖工程菌株在添加过量氮源时的生长曲线和摇瓶发酵结果，A为J9U-P8xylA和J9UΔxylD-P8xylA在过氮木糖发酵培养基中的生长曲线，B为J9UΔxylD-P8xylA在过氮木糖发酵培养基中的摇瓶发酵结果；

图17为木糖工程菌株J9UΔxylD-P8xylA在不同浓度氮源的木糖发酵培养基中的生长曲线和木糖消耗曲线，A为J9UΔxylD-P8xylA在NH₄Cl浓度分别为2、5、10、15、20、30g/L的木糖发酵培养基(30g/L木糖)中的生长曲线；B为J9UΔxylD-P8xylA在NH₄Cl浓度分别为2、5、10、15、20、30g/L的木糖发酵培养基(30g/L木糖)中的木糖消耗曲线；

图18为野生型和工程菌株在混合糖发酵培养基中的生长曲线和单糖消耗曲线，A为J9U在含有20g/L木糖和10g/L葡萄糖的混合糖发酵培养基中的生长曲线和单糖消耗曲线；B为J9UΔxylD-P8xylA在含有20g/L木糖和10g/L葡萄糖的混合糖发酵培养基中的生长曲线和单糖消耗曲线；

图19为木糖工程菌株J9UΔxylD-P8xylA在混合糖发酵培养基以及混合糖过氮发酵培养基中的发酵结果；

图20为木糖工程菌株J9UΔxylD-P8xylA在玉米秸秆水解液中的发酵结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明提供了一种盐单胞菌J9U的构建方法，包括以下步骤：

酶切自杀质粒pK18mobsacB，得到线性化质粒pK18mobsacB；

在本发明中，酶切自杀质粒pK18mobsacB，得到线性化质粒pK18mobsacB，所述酶切的限制性内切酶为EcoRⅠ。得到线性化质粒pK18mobsacB后，将upp基因的上下游同源臂序列与线性化质粒pK18mobsacB连接，得到打靶载体pK18Δupp，所述连接采用同源重组的方式连接，其中upp基因的上游同源臂序列通过以渴望盐单胞菌J9的基因组DNA为模板，利用Δupp-UF/UR进行PCR扩增得到；upp基因的下游同源臂序列通过以渴望盐单胞菌J9的基因组DNA为模板，利用Δupp-DF/DR进行PCR扩增得到，所述upp基因的上下游同源臂序列通过融合PCR技术，将上述上游同源臂序列和上述下游同源臂序列进行PCR扩增得到。得到打靶载体pK18Δupp后，将含有打靶载体pK18Δupp的宿主细胞转入渴望盐单胞菌J9中，得到重组菌，重组菌经过两次同源重组，得到盐单胞菌J9U，所述宿主细胞优选为大肠杆菌E.coliS17-1λpir；所述转入的方式采用接合转移的方式。所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后将双层条带的菌株进行第二次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括重组菌培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；

本发明还提供了一种根据上述构建方法得到的盐单胞菌J9U。

在本发明中，所述xylD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，所述xylA基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.33所示；在所述xylA基因上游插入上调xylA基因的启动子，所述启动子为P8启动子，所述P8启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。

酶切重组质粒pKJU，得到线性化质粒pKJU；

在本发明中，将upp基因与上述线性化质粒pK18mobsacB连接，得到重组质粒pKJU，所述upp基因优选为含有启动子的upp基因，所述含有启动子的upp基因的核苷酸序列如SEQID No.35所示。所述连接的位点为EcoRⅠ位点。酶切重组质粒pKJU，得到线性化质粒pKJU，所述酶切的限制性内切酶为EcoRⅠ。

在本发明中，将xylD基因的上下游同源臂序列与线性化质粒pKJU连接，得到打靶载体pKJU-ΔxylD，所述连接采用同源重组的方式连接，其中xylD基因的上游同源臂序列通过以上述盐单胞菌J9U的基因组DNA为模板，利用ΔxylD-UF/UR(SEQ ID No.13～14)进行PCR扩增得到；ΔxylD基因的下游同源臂序列通过以盐单胞菌J9U的基因组DNA为模板，利用ΔxylD-DF/DR(SEQ ID No.15～16)进行PCR扩增得到，所述upp基因的上下游同源臂序列通过融合PCR技术，将上述上游同源臂序列和上述下游同源臂序列进行PCR扩增得到。

在本发明中，将含有上下游同源臂的P8xylA基因序列与线性化质粒pKJU连接，得到打靶载体pKJU-P8xylA，所述连接采用同源重组的方式连接，其中P8xylA基因的上游同源臂序列通过以上述盐单胞菌J9U的基因组DNA为模板，利用P8xylA-UF/UR(SEQ ID No.19～20)进行PCR扩增得到；P8xylA基因的下游同源臂序列通过以盐单胞菌J9U的基因组DNA为模板，利用P8xylA-DF/DR(SEQ ID No.25～26)进行PCR扩增得到；所述P8基因的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。所述P8xylA的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。所述xylA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。所述含有上下游同源臂P8xylA基因序列通过融合PCR技术，将上述上游同源臂序列、P8基因的核苷酸序列、xylA基因的核苷酸序列和下游同源臂序列进行PCR扩增得到。

在本发明中，将打靶载体pKJU-ΔxylD转入上述构建方法得到的盐单胞菌J9U中，得到重组菌J9U，经过两次同源重组后，得到重组菌J9UΔxylD，所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌J9U进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后双交换菌株的筛选双层条带的菌株进行第两次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括重组菌J9U培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；

在本发明中，得到重组菌J9UΔxylD后，将打靶载体pKJU-P8xylA转入重组菌J9UΔxylD中，得到含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD，经过两次同源重组后，得到盐单胞菌J9U衍生菌，所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后双交换菌株的筛选双层条带的菌株进行第二次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；

本发明还提供了一种根据上述构建方法得到的盐单胞菌J9U衍生菌。

在本发明中，所述木糖的浓度优选为10～30g/L。所述发酵培养基还包括葡萄糖，所述葡萄糖的浓度优选为8～12g/L；优选的，所述发酵培养基还包括NH₄Cl，所述NH₄Cl的浓度优选为10～20g/L；优选的所述发酵培养基还优选的包括葡萄糖和NH₄Cl；所述培养优选地采用开放式发酵培养。所述培养的温度优选为35～40℃。

在本发明中，上述盐单胞菌J9U衍生菌能够利用木糖发酵生产PHA，也能同时利用木糖和葡萄糖生产PHA，且得到的PHA的产量高，极大地降低了生产成本。

在以下实施例中，所述Escherichia coli DH5α购自南京诺唯赞生物科技有限公司，货号C502。所述Escherichia coli S17-1λpir购自贝尔格莱科技天津有限公司，货号DL2010S。所述pK18mobsacB购自上海百风生物公司。所述LB Mix购自美国BD公司。所述木糖购自北京鼎国生物工程公司，所述纤维二糖购自北京鼎国生物工程公司，所述木糖标准液购自山东省科学院生物研究所。

实施例1一种构建盐单胞菌J9U的方法

1.1.1引物序列信息

本实施例所用到引物序列信息见表1。

表1引物及序列信息

1.1.2培养基及溶液

1.1.2.1培养基

Luria-Bertani(LB)培养基：称取25.0g LB Mix，溶于蒸馏水后定容至1L。若需配制固体培养基，可在此基础上加入1.8％～2％(w/v)的琼脂粉。高压蒸汽灭菌条件为：121℃，20min。置于室温环境。

含盐60LB培养基：称取25.0g LB Mix，60.0g NaCl，蒸馏水定容至1L，使用NaOH调节至pH 9.0。若需配制固体培养基，可在此基础上加入1.8％～2％(w/v)的琼脂粉。高压蒸汽灭菌条件为：121℃，20min。室温储存。

1.1.2.2溶液

50×TAE电泳缓冲液：称取242.0g Tris，37.2g Na₂EDTA·2H₂O，再加入5.71％(v/v)冰醋酸，最后加入去离子水定容至1L，pH 8.2，室温保存，备用。在进行琼脂糖凝胶电泳时，稀释50倍至1×TAE电泳缓冲液使用。

抗生素母液及使用浓度：

(1)硫酸卡那霉素(Kan)：母液浓度为50mg/mL，取称0.5g硫酸卡那霉素粉末于10mL去离子水中，待其充分溶解后用0.22μm水系滤膜过滤除菌，-20℃避光保存备用。用于大肠杆菌筛选的工作浓度为50μg/mL；用于盐单胞菌Halomonas cupida J9筛选的工作浓度为50μg/mL。

(2)5-氟尿嘧啶(5-FU)：母液浓度为40mg/mL，称取0.4g 5-氟尿嘧啶粉末于10mL二甲基亚砜中，待其充分溶解后于-20℃避光保存备用。工作浓度为100μg/mL。

1.2实验方法

1.2.1野生型Halomonas cupida J9对于5-FU敏感性测试

将保存于-80℃甘油管中的Halomonas cupida J9划线于60LB固体培养基，37℃培养过夜。从固体平板上挑，取单菌落，分别接种于含有20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL 5-氟尿嘧啶的5mL 60LB液体培养基中，置于37℃，180rpm摇床中，振荡培养过夜后测定OD₆₀₀。

经过全基因组测序分析，J9含有单拷贝upp基因(编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶)，它可以催化一种常作为抗肿瘤药物使用的毒性抗代谢物质5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)与尿苷酸发生反应，生成5-氟-UMP(5-fluoro-UMP)，5-氟-UMP则可以通过微生物自身的代谢，转化成为5-氟-dUMP。5-氟-dUMP是一种胸苷酸合成酶的抑制剂，可以阻碍胸苷酸的生成。而胸苷酸则是微生物DNA合成所必需的一种腺嘧啶脱氧核，缺少这种脱氧核将会影响DNA的合成，最终导致细胞死亡。

野生型Halomonas cupida J9菌株在含有不同浓度5-FU的60LB试管中过夜后的生长情况如图2表明，野生型Halomonas cupida J9对于低浓度的5-FU敏感度较低，具有一定的抗性，但是随着5-FU浓度的不断增加，J9的存活率也逐渐降低，特别是当5-FU浓度100μg/mL以上时，J9基本不具备生长能力。该实验为后续双交换筛选中5-FU的使用浓度提供了参考值：加入100μg/mL的5-FU即可起到筛选的目的。

1.2.2野生型Halomonas cupida J9(H.cupida J9或渴望盐单胞菌J9)基因组的提取

1.依照Vazyme公司的试剂盒说明书对H.cupida J9的基因组进行提取。使用Vazyme公司的细菌基因组DNA快速分离试剂盒，提取H.cupida J9的基因组DNA。

1.2.3DNA片段的扩增与纯化

使用Vazyme高保真聚合酶分别利用Δupp-UF/UR与Δupp-DF/DR(详见表1)进行PCR扩增upp基因的上下游同源臂，各为600bp左右，分别得到片段1和片段2。

PCR扩增体系见表2：

表2PCR扩增upp基因上下游同源臂的体系

融合PCR反应体系见表3：

表3融合PCR反应体系

PCR反应条件见表4：

表4PCR反应条件

将PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶(琼脂糖含量0.8％～1.0％)电泳，以Marker III作为衡量DNA分子量大小的工具。DNA片段回收使用Vazyme的产物纯化试剂盒，具体的提取信息可参考说明书，得到上下游同源臂。

1.2.4pK18mobsacB-Δupp敲除质粒(pK18Δupp)的构建

将融合PCR得到的上下游同源臂，整合到自杀质粒pK18mobsacB的EcoRⅠ位点，如图1所示。先用限制性内切酶EcoRⅠ对质粒pK18mobsacB进行酶切，得到线性化质粒。

酶切体系表5：

表5酶切体系

上述的酶切体系吹打混匀后放置37℃水浴45min。

目的DNA片段与线性化质粒的连接采用的是同源重组连接法，使用Vazyme公司的无缝克隆试剂盒进行载体构建。

重组连接体系见表6：

表6重组连接体系

将上述重组连接体系吹打混匀，放置在37℃反应30min，将连接产物(含有上下游同源臂的pK18mobsacB质粒，即pK18Δupp)化转至E.coli DH5α感受态中，通过菌落PCR对阳性克隆子进行验证。

2.2.4质粒DNA化学转化与阳性克隆子的鉴定

1.将储存于-80℃的E.coliDH5α和S17-1λpir感受态放置冰上融化；

2.在无菌条件下取10μL连接产物(pK18Δupp)轻柔地加到刚融化E.coli感受态细胞中，冰浴30min；

3.将上步体系放入42℃金属浴中热激30s，取出后立即冰浴2min；

4.无菌条件下在上部体系中加入1mL LB液体培养基，37℃，180r/min复苏1h；

5.复苏好的产物4℃，5000r/min离心5min，在无菌条件下弃去上清，保留菌体，留约100μL上清液将菌体重悬，涂布于含有50μg/mLkan的LB平板上，37℃恒温培养箱中过夜培养；

6.在平板上挑取单菌落于含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃，180r/min复苏3h后利用质粒pK18mobsacB的检测引物pK-JF/JR(见表1)进行菌液PCR鉴定阳性克隆转化子。

菌落PCR体系见表7：

表7菌落PCR体系

菌落PCR反应条件见表8：

表8菌落PCR反应条件

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来检测PCR条带大小，将条带大小正确的阳性克隆子转接到含相应抗性的5mL LB液体培养基中，37℃，180r/min过夜培养。

1.2.5质粒DNA提取

使用Vazyme公司的FastPure PlasmidMini Kit试剂盒进行提取。将提取的质粒测序比对无误后，利用1.2.4的化学转化方法转化到大肠杆菌E.coli S17-1λpir中。

利用质粒pK18mobsacB的检测引物pK-JF/JR进行菌落PCR，分别验证含有质粒pK18Δupp的大肠杆菌DH5α和S17-1λpir的电泳图如图3所示，扩增条带约为1400bp，证明打靶载体pK18Δupp构建成功。

1.2.6接合转移

接合转移是一种将质粒转入H.cupida J9的有效方法。具体转化方法如下：

1.将-80℃保存的H.cupida J9菌株及含有不同载体的E.coli S17-1λpir菌株分别在LB平板上划线活化；

2.分别挑取含有目标质粒的大肠杆菌E.coli S17-1λpir和H.cupida J9及其衍生菌株至5mL LB和60LB液体培养基中，37℃，180r/min培养12h；

3.各取步骤2中经过过夜培养的菌液，以2％的比例分别转接至50mL含相关抗生素的LB和60LB液体培养基中，37℃，180r/min培养6～8h，使OD₆₀₀达到1.5～2.0；

4.各取1mL步骤3中经过培养的菌液，置于无菌1.5mL EP管中，5000r/min，离心5min，弃尽上清；

5.向EP管中加入与菌液等体积的LB和60LB溶液，轻柔地重悬菌体以洗脱抗生素，5000r/min，离心5min，弃尽上清；

6.重复步骤5；

7.分别加入60μL的LB和60LB液体，轻柔地吹吸以重悬菌体，将E.coli S17-1λpir和H.cupida J9及其衍生菌株的菌液以1:1、2:1和3:1的比例轻柔混合滴加于附着在60LB固体平板的0.22μm滤膜上，过夜培养；

8.挑取滤膜溶于1ml 60LB液体培养基中，充分振荡2min，吸取100μL涂布于含有100μg/mLKan的60LB平板上，37℃静置培养36h，对长出的菌落进行菌落PCR，以筛选正确的转化子。

1.2.7upp基因缺失突变菌株J9U的筛选

1.2.7.1单交换菌株的筛选

本实施例用的自杀质粒pK18mobsacB是一种具有卡那霉素抗性的穿梭型自杀质粒，这种质粒可以在商品化大肠杆菌中自由复制，但当宿主菌为盐单胞菌时，则不具备独立复制的能力，只能定点整合插入到宿主菌的染色体中，否则将被宿主菌株作为外源片段切割与降解。当Halomonas cupida J9自身基因组中的upp基因被成功敲除后，突变菌株具有了5-FU抗性。因此，可以利用上述这种反向筛选标记，对接合子进行筛选，从而得到upp基因缺失的Halomonas cupida J9。原理如图1所示。操作步骤如下所述：

1.将upp基因打靶载体pK18Δupp通过接合转移的方法转化进入H.cupida J9菌株，并涂布于含有100μg/mLKan抗性60LB培养基平板上，37℃，培养36h；

2.无菌条件下，在平板上挑取单菌落于含有100μg/mLKan抗性的60LB液体培养基中进行过夜培养，使用引物Δupp-UF/DR通过菌液PCR的方法验证单交换，得到双层条带的菌株。

但由于H.cupida J9作为中度嗜盐菌，为了抵御高盐环境，其细胞膜脂质双层中的粘性表面区域异常厚且均匀因此细胞难以裂解。在菌落PCR之前需使用Vazyme公司的快速室温裂解试剂盒对菌液进行预处理。具体操作步骤如下：

(1)取2μL菌液，加入10μLLysis Buffer中，短暂离心混匀，室温静置孵育3min，使细胞充分裂解；

(2)向上述混合液中加入与Lysis Buffer等体积的StablizingBuffer，短暂离心混匀，以消除裂解样本中的抑制因子对下游PCR反应的抑制作用，使裂解后的DNA溶液得以长期稳定储存；

(3)以上步所得细胞裂解溶液为模板，使用相应引物，按照2.2.4中所述的PCR体系和反应条件进行菌落PCR。

构建好的pK18Δupp敲除载体可以利用接合转移的方式，通过供体菌大肠杆菌S17-1λpir所具有的菌毛转导进入受体菌株野生型Halomonas cupida J9中。与此同时，由于pK18Δupp敲除载体中具有upp基因两侧的上下游同源臂序列，因此可以激发宿主菌株自身的RecA同源重组系统，使其定点插入到Halomonas cupida J9的染色体中并且以线性化的DNA片段存在，即发生第一次同源重组(详见图1)，这也使得原本对高浓度卡那霉素敏感的Halomonas cupida J9具备了卡那霉素的抗性。同时，J9本身可以耐高盐生长，因此可以利用上述原理筛选既耐盐又具有卡那抗性的单交换菌株。

因为打靶载体pK18Δupp以线性化的形式插入到Halomonas cupida J9中，使用引物Δupp-UF/DR(见表1)进行菌液PCR的扩增时，发生单交换的菌株将得到两条扩增目的条带：一条大小约为1.9kb，另一条是长度约为1.2kb的目的条带，在含Kan抗性的60LB平板上挑取了24个转化子，70％以上的菌株都发生了第一次同源重组(见图4)。

1.2.7.2双交换菌株的筛选

1.将验证为双层条带的菌株转接至无抗性的60LB试管中，37℃，180r/min培养24h促进双交换的发生，在没有抗性筛选压力的条件下使自杀质粒丢失，得到培养后的菌液；

2.取培养后的菌液100μL，用60LB液体培养基稀释100倍后再涂布于含有100μg/mL5-Fu抗性的60LB固体培养基中进行培养，使用基因组上的检测引物Δupp-JF/JR、J9-F和J9-R(见表1)通过1.2.4中菌液PCR的方法验证双交换，将双交换菌株的PCR产物进行测序；

3.将测序正确的敲除菌株保存于-80℃的甘油管中，得到盐单胞菌J9U。

由于发生第一次同源重组后，自杀质粒定点整合入宿主菌株的染色体中，使得单交换菌株的基因组中存在两对DNA同源片段。因此，单交换菌株会自发的发生第两次交换，从而实现upp基因的敲除(详见图1)。而原本对5-FU敏感的Halomonas cupida J9，由于upp基因的缺失得到upp基因缺失突变菌株J9U具有对5-FU的抗性，J9U可以在含有5-FU的高盐培养基中生长，从而利用含有5-FU的60LB平板进行目的菌株Halomonas cupida J9Δupp(J9U)筛选。使用基因组上的检测引物Δupp-JF/JR进行菌液PCR扩增时，发生两次重组且upp基因成功敲除的菌株，将可以扩增得到约为1.4kb左右的目标条带，而在没有发生upp基因缺失的菌株中，条带大小约为2.2kb。J9U双交换菌液PCR验证结果如图5所示，总共挑取了16个具有5-FU抗性的转化子，经验证全部为upp敲除菌株，说明J9的同源重组效率极高，高达100％。同时利用J9基因组中的特异性检测引物J9-F和J9-R(见表1)进行PCR扩增，验证成功发生双交换的upp敲除菌株均是盐单胞菌Halomonas cupida J9U。

1.2.8upp基因缺失突变菌株J9Δupp(J9U)的5-氟尿嘧啶敏感性测试

将划线活化后的J9U和对照菌株J9分别划线于含100μg/mL5-氟尿嘧啶的60LB平板上，对构建完成的upp基因缺失型菌株进行5-FU敏感性的验证。

结果如图6所示，野生型J9完全不生长，而敲除upp基因后的J9U在含100μg/mL 5-FU的平板上生长良好，对5-FU具有很稳定的抗性，能够作为后续改造的出发菌株。

实施例2

2.1.1引物序列信息

本实施例所用到的引物序列信息见表9。

表9引物序列信息

2.1.2培养基及溶液

2.1.2.1培养基

发酵培养基：KH₂PO₄1.5 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 9.65g/L，酵母提取物1.0g/L，NaCl80.0g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NH₄Cl 2g/L，微量元素母液I10mL/L，微量元素母液II 1mL/L，蒸馏水余量，使用NaOH将pH调节至9.0；

木糖发酵培养基：在上述发酵培养基的基础上添加木糖，所述木糖的终浓度为10～30g/L。

混合糖发酵培养基：在上述发酵培养基的基础上添加葡萄糖的终浓度为10g/L和木糖终浓度为20g/L。

混合糖过氮发酵培养基：在上述发酵培养基的基础上添加葡萄糖终浓度为10g/L和木糖终浓度为20g/L，同时将发酵培养基中的NH₄Cl 2g/L替换为20g/L。

过氮木糖发酵培养基：与上述木糖发酵培养基的不同之处在于，过氮木糖发酵培养基的NH₄Cl 5～30g，其他成分及其含量与上述木糖发酵培养基相同。

2.1.2.2溶液

木糖母液：母液浓度为500g/L，称取50.0g木糖，加入蒸馏水定容至100mL，115℃高压蒸汽灭菌20min，保存于4℃，备用。工作浓度为10～30g/L。

葡萄糖母液：母液浓度为500g/L，称取50.0g葡萄糖，使用蒸馏水定容至100mL。高压蒸汽灭菌条件为：115℃，30min。4℃储存。工作浓度为10～30g/L。

微量元素液I：称取5.0g柠檬酸铁铵盐，2.0g CaCl₂，使用1M HCl溶解并定容至1L。0.22μm过滤除菌，4℃储存。工作浓度为10μL/mL。

微量元素液II：称取100mg ZnSO₄·7H₂O，30mgMnCl₂·4H₂O，300mg H₃BO₄，200mgCoCl₂·6H₂O，10mg CuSO₄·5H₂O，20mgNiCl₂·6H₂O，30mgNaMoO₄·2H₂O，使用1M HCl溶解并定容至1L。0.22μm过滤除菌，4℃储存。工作浓度为1μL/mL。

MgSO₄母液：母液浓度为20g/L,称取2.0gMgSO₄，使用蒸馏水定容至100mL。高压蒸汽灭菌条件为：121℃，20min。4℃储存。工作浓度为0.2g/L。

NH₄Cl母液：母液浓度为200g/L,称取20.0gNH₄Cl，使用蒸馏水定容至100mL。高压蒸汽灭菌条件为：121℃，20min。4℃储存。工作浓度为2g/L。

酯化液：称取0.1g苯甲酸，加入97mL色谱纯甲醇和3mL硫酸定容至100mL，保存于4℃，备用。

本实施例所用其他培养基及溶液同实施例1中的1.1.2。

2.2.1盐单胞菌J9U衍生菌的构建

为了实现盐单胞菌J9U利用木糖发酵生产PHA，首先敲除木糖代谢分支木糖脱氢酶xylD(xylD核苷酸序列如SEQ ID No.31所示)，并补偿J9U缺少的xylA(来自E.coliMG1655)，调整木糖代谢网络中的木糖代谢分流，使碳源流向PHA生产。

染色体型表达木糖代谢基因相较于质粒型表达，虽然稳定但表达水平较低，外源启动子P8能够增强J9U内源基因的表达，因此利用P8来进一步增强其表达水平，其中外源启动子P8的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。将xylA序列通过PCR从E.coli MG1655基因组中进行扩增，得到的xylA的基因序列如SEQ ID No.33所示，并在xylA上游添加RBS(TAAGGAGGTTTTCTA，SEQ ID No.34)序列。本实施例成功构建木糖代谢基因的插入载体pKJU-P8xylA和木糖代谢分支的敲除载体pKJU-ΔxylD，将插入和敲除载体先后通过接合转移转化至H.cupida J9U中。

2.2.1.1基因敲除/插入载体的构建

打靶载体pKJU的构建：以Halomonas cupida J9基因组为模板，根据基因组序列设计引物Pupp-F/Pupp-R(详见表1，SEQ ID No.7～8)，扩增J9的upp基因以及自身的启动子，得到含有启动子的upp基因(SEQ IDNo.35)。按照1.2.3的条件和程序进行PCR扩增与纯化，将得到的片段与限制性内切酶EcoRⅠ酶切后的质粒pK18mobsacB连接(如图7所示)，随后转入大肠杆菌E.coliDH5α进行复制扩增，得到重组质粒pKJU，用作后续基因敲除或插入的打靶载体，利用质粒pK18mobsacB的检测引物pK-JF/JR对重组质粒进行电泳验证，扩增条带大约为800bp，表明成功扩增得到了打靶载体pKJU。

在构建基因片段敲除载体时，首先按照实施例1的1.2.2的方法提取盐单胞菌J9U基因组，然后按照实施例1的1.2.3的方法用引物ΔxylD-UF/UR及ΔxylD-DF/DR扩增并纯化J9基因组中待敲基因的上下游同源臂UP和DN(同源臂长度大小由基因长度决定)，融合PCR后接着通过实施例1中的1.2.3中同源重组的方法将融合好的上下游同源臂整合到打靶载体pKJU的EcoRI位点，构建得到基因敲除载体pKJU-ΔxylD。其中，敲除的基因X是xylD，基因片段敲除载体构建示意图见图8。

在构建基因片段插入载体时，分别用引物P8xylA-UF/UR、P8xylA-DF/DR、P8xylA-P8F/P8R及P8xylA-AF/AR(见表2)，分别以J9U提取的基因组DNA、J9U提取的基因组DNA、恶臭假单胞菌KT2440提取的基因组DNA和E.coli MG1655提取的基因组DNA为模板，扩增出基因组插入位点上下游同源臂UP、DN以及插入片段启动子P8和基因xylA，融合PCR后接着通过实施例1的1.2.3中同源重组的方法，以上述扩增的四个片段为模板，通过P8xylA-UF和P8xylA-DR进行PCR扩增，将含有上下游同源臂P8xylA整合到打靶载体pKJU的EcoR I位点，构建得到基因片段插入载体pKJU-P8xylA。其中，所插入的片段是P8xylA，基因片段插入载体构建示意图见图9。所述P8xylA的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。

质粒连接好后按照实施例1的1.2.4的方法先转化进入大肠杆菌E.coli DH5α进行复制扩增，菌落PCR验证和测序后证明重组质粒构建成功，然后提取重组质粒再转化进入大肠杆菌E.coli S17-1λpir。

2.2.1.2盐单胞菌J9U衍生菌的构建

S1、单交换菌株的筛选

1.将含有pKJU-ΔxylD的通过接合转移的方法转化进入实施例1制备的盐单胞菌J9U中，并涂布于含有100μg/mLKan抗性60LB培养基平板上，37℃，培养36h；

2.无菌条件下，在平板上挑取单菌落于含有100μg/mLKan抗性的60LB液体培养基中进行过夜培养，使用引物通过菌液PCR的方法验证单交换，得到双层条带的单交换菌株即重组菌J9UΔxylD。

S2、双交换菌株的筛选

1.将验证为双层条带的单交换菌株在37℃，180r/min培养24h促进双交换的发生，在没有抗性筛选压力的条件下使自杀质粒丢失，得到培养后的菌液；

2.取培养后的菌液100μL，用60LB液体培养基稀释100倍后再涂布于含有100μg/mL5-Fu抗性的60LB固体培养基中进行培养，使用基因组上的检测引物验证双交换，将双交换菌株的PCR产物进行测序；

3.将测序正确的菌株保存于-80℃的甘油管中，得到盐单胞菌J9U衍生菌(又称工程菌J9UΔxylD-P8xylA)。

结果如图10所示，对照菌株为J9U，PCR检测结果表明成功构建了重组菌株J9UΔxylD-P8xylA菌株。测序结果比对均为100％。

为了验证盐单胞菌J9U衍生菌(J9UΔxylD-P8xylA)中引入的外源基因xylA在外源启动子P8的启动下转录情况，采用RT-qPCR的方法检测xylA基因的转录情况。

图11结果表明，以J9UΔxylD-P8xylA的基因组DNA和cDNA为模板获得的特异性PCR条带大小与导入的外源基因大小吻合。而以阴性对照mRNA和ddH₂O为模板时，未产生PCR目的条带。这表明，整合到J9U基因组上的xylA外源基因成功转录。

为了检测盐单胞菌J9U衍生菌在木糖发酵培养基中的生长曲线和木糖消耗曲线，以J9U作为对照，将构建好的工程菌J9UΔxylD-P8xylA的种子液转接到分别含有10g/L、20g/L和30g/L木糖的木糖发酵培养基中，37℃，180r/min振荡培养72h，测定其生物质积累情况。

由图12结果表明，与J9U相反，工程菌J9UΔxylD-P8xylA随着木糖浓度的升高，细胞干重显著上升，此现象说明，这两步遗传改造可能成功调整了J9的木糖代谢流。

为了探究木糖工程菌J9UΔxylD-P8xylA产生PHA的原因，将中间单敲菌株J9UΔxylD和单插菌株J9U-P8xylA接入含30g/L木糖的发酵培养基中，37℃，180r/min振荡培养60h，每12h取1mL样品分别测定OD₆₀₀和残糖，以野生型J9U为对照，观察其生长情况。

其中，木糖消耗曲线的测定方法如下：

木糖工程菌株以木糖作为底物生产PHA，通过生物传感分析仪检测底物消耗情况。SBA-40D生物传感分析仪利用酶促反应进行定量分析，通过更换木糖酶膜，手动进样后，整个测定过程由微电脑控制，自动完成，每个样品的测定周期为一分钟左右。

培养基中木糖的测定：在培养过程中及培养结束后，取培养液1mL，12000r/min离心10min，取上清至新的EP管中，稀释50倍，待测。

生物传感分析仪检测木糖：打开生物传感分析仪，待仪器稳定之后，缓冲剂冲洗木糖酶膜及管道，随后用100mg/dL木糖标准液定标，定标通过之后即可测准备好的木糖样品。

结果如图13所示，单敲xylD会影响J9U的生长，说明产木糖酸的这条旁支最终会走向TCA，但依然能利用木糖为唯一碳源进行微弱的生长(无酵母粉也长)，说明存在其他的木糖代谢途径有待挖掘；单插P8xylA对J9的生长无影响，证明ΔxylD和P8xylA综合作用才会使J9U合成PHA，可能因为使更多的木糖碳源流向PHB合成途径，而不是木糖酸代谢。

为了检测木糖发酵工程菌的发酵结果，以野生型J9U为对照、木糖工程菌株J9U-P8xylA以及J9UΔxylD-P8xylA分别在30g/L木糖、2g/LNH₄Cl的木糖发酵培养基中37℃，180r/min振荡培养发酵72h；CDW为细胞干重；wt％定义为PHA占细胞干重的比例；数值为三次独立重复实验的平均值±SD，**和****分别表示P<0.01和P<0.0001，用Student’s t-test进行检测。分别将酯化处理发酵后的细胞样品，利用上述GC-MS分析PHA的含量和单体组成。

摇瓶发酵具体操作步骤如下：

1.取-80℃保存的H.cupida J9菌株分别在8％LB平板上活化；

2.挑取单菌落接种于相应的5mL 8％LB液体中，振荡培养过夜；

3.转接1mL上步菌液至100mL相应的8％LB液体培养基中，振荡培养过夜，获得种子液；

4.以5％(v/v)的接种量将种子液接种于100mL相应的液体发酵培养基中，振荡培养48～60h。

5.待发酵结束，收集全部菌液，4℃，7000rpm离心20min，弃培养基，将全部菌体转移至干净玻璃培养皿中，标注好样品后用带有小孔的锡纸封口，样品置于-80℃冰箱冷冻2h后，将平板置于冷冻干燥机，干燥过夜；

收集冻干后的菌体，进行称重，记录细胞干重，常温下密封保存，备用。

使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定PHA的单体组成及含量，样品制备及定量的具体操作步骤如下：

1.发酵液离心收集细胞于冷冻干燥机中冻干24h，称取0.1g冻干细胞样品及PHA单体的标准品，放入提前用氯仿浸泡过夜的密闭耐高温酯化管中；

2.加入4mL酯化液，再加入等体积的氯仿，摇晃混匀；

3.将酯化管置于100℃的沸水浴中，酯化4h；

4.待酯化管冷却至室温，加入4mL ddH₂O充分振荡2min，静置2h至水相和有机相分层后，取1mL下层有机相过滤除菌后装入密闭棕色小瓶中；

5.将上步所得样品进行GC-MS检测，检测条件为：载气为氦气(流速1.0555mL/min)，进样口温度250℃，传输管温度230℃，自动进样量1μL，采用分流模式(分流比30：1)。柱温80℃开始，停留1min，然后以10℃/min的速率升温至250℃后，停留3min，并在50～280m/z的范围内扫描。柱压10psi开始，停留1.5min，然后以2.5psi/min升至20psi，停留1.5min；

6.使用NIST数据库分析并将保留时间与标准品进行比较来确定PHA单体组成，并使用内标法(苯甲酸甲酯)对PHA进行定量分析，公式如下：

PHA产量(g/L)＝PHA含量(wt％)×细胞干重(g/L)

发酵结果如图14所示，与野生型J9U相比，工程菌J9U-P8xylA的细胞干重没有提高，但是PHA的积累量实现了从0到1的突破，能够积累16.21wt％的PHA，而最终的工程菌株J9UΔxylD-P8xylA的OD₆₀₀和木糖消耗明显提高，细胞干重从2.1g/L提高到4.2g/L，木糖消耗量从10g/L提高到13.5g/L，并且可以利用木糖生产33.8wt％的PHA，PHA产量可达1.42g/L，木糖转化率从3.7％提高到10.5％，此外，该菌生产的PHA为短链-中长链共聚物，由31.49wt％的3-羟基丁酸(3HB)和2.31wt％的3-羟基月桂酸(3HDD)构成(见图15)，因此利用J9UΔxylD-P8xylA进行更多的提高PHA产量的探究性实验。

进一步研究了过量氮源对工程菌J9UΔxylD-P8xylA利用木糖生产PHA的影响：

虽然碳氮比失衡即氮源不足是通过限制细胞生长促进PHA生产的一个重要因素，但本实施例尝试添加20g/L的NH₄Cl作为过量氮源进行摇瓶发酵。

(1)以木糖发酵培养基(木糖浓度为30g/L)为对照，木糖工程菌株J9U-P8xylA和J9UΔxylD-P8xylA分别在NH₄Cl浓度为20g/L的过氮木糖发酵培养基中37℃，180r/min振荡培养60h，每12h取1mL样品测定OD₆₀₀，测定生长曲线。

(2)以木糖发酵培养基(木糖浓度为30g/L)为对照，木糖工程菌株J9UΔxylD-P8xylA在NH₄Cl浓度为20g/L的过氮木糖发酵培养基中37℃，180r/min振荡培养发酵72h；CDW为细胞干重；wt％定义为PHA占细胞干重的比例；数值为三次独立重复实验的平均值±SD(*和**分别表示P<0.05和P<0.01)，用Student’st-test进行检测，测定摇瓶发酵结果。

生长曲线和发酵结果如图16所示，结果表明，以J9U-P8xylA为对照，过量氮源添加20g/LNH₄Cl对其生长无影响，而对于这株已经能利用木糖生产PHA的菌株J9UΔxylD-P8xylA来说，添加过量氮源显著提高了其生物质的积累，同时木糖消耗提高到19g/L，细胞干重也从4.2g/L提高到了6.3g/L，经GC-MS测定，PHA含量从33.8wt％提高到了44.63wt％，底物转化率提高至14.8％，这是到目前为止，盐单胞菌属利用木糖为唯一碳源发酵生产PHA的最高产量，即2.81g/L。

本实施例测试了不同浓度NH₄Cl对工程菌J9UΔxylD-P8xylA利用木糖发酵生产PHA的影响，在含有30g/L木糖的木糖发酵培养基(对照，以2N表示)、含有30g/L木糖的木糖发酵培养基的NH₄Cl的终浓度为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L的NH₄Cl作为过氮木糖发酵培养基(分别以5N、10N、15N、20N、30N表示)分别进行摇瓶发酵，37℃，180r/min振荡培养84h，每12h取1mL样品分别测定OD₆₀₀和残糖，分别测定了生长曲线和木糖消耗曲线。

图17结果表明，含有30g/L的木糖发酵培养基中添加10～20g/LNH₄Cl有利于生物量的积累和木糖的消耗。

在木糖和葡萄糖共利用方面，葡萄糖可能与木糖转运蛋白结合导致木糖转运受抑制；另外，由于葡萄糖效应CCR，葡萄糖的分解代谢产物还可能会阻遏与木糖代谢相关的基因转录，从而抑制木糖的利用，因此对大多数微生物而言，葡萄糖的存在会抑制木糖的转运和利用。为了探究葡萄糖的存在是否会抑制木糖的转运利用，也为了更好地体现木糖途径改造的效果，本实施例以J9U为对照菌株，将构建好的工程菌J9UΔxylD-P8xylA转接入含有20g/L木糖和10g/L葡萄糖的混合糖发酵培养基中进行摇瓶发酵，37℃，180r/min振荡培养72h，每12h取1mL样品分别测定OD₆₀₀和残糖，来探究葡萄糖的存在是否会抑制木糖的转运利用，并且分别测定生长曲线和单糖消耗曲线。

图18结果表明，在发酵前期，对野生菌和工程菌来说，葡萄糖存在时，木糖仍然可以被转运利用，说明葡萄糖的存在不会抑制木糖的转运利用，且葡萄糖和木糖可以被同时利用；对工程菌来说，在发酵后期，木糖的不断消耗还会促进葡萄糖的共利用，木糖消耗从9.5g/L提高至17g/L，葡萄糖消耗也提高了4g/L，OD₆₀₀在72h能达到20.0左右，约是野生型的2.5倍。以上结果表明，工程菌J9UΔxylD-P8xylA在木糖和葡萄糖共利用方面是一株优势的底盘菌株。

为了研究工程菌株J9UΔxylD-P8xylA在混合糖发酵培养基以及混合糖过氮发酵培养基的发酵结果，以木糖发酵培养基(木糖浓度为30g/L)为对照，J9UΔxylD-P8xylA在木糖浓度为20g/L，葡萄糖浓度为10g/L，NH₄Cl浓度为2g/L(过氮时NH₄Cl浓度为20g/L)的混合糖发酵培养基中37℃，180r/min振荡培养发酵72h；CDW为细胞干重；wt％定义为PHA占细胞干重的比例；数值为三次独立重复实验的平均值±SD(*和**分别表示P<0.05和P<0.01)，用Student’s t-test进行检测。

图19结果表明，相比于纯木糖发酵培养基(以30X表示)，工程菌在混合糖发酵培养基(以20X+10G表示)中具有更明显的生长优势，细胞干重能达到6.6g/L，PHA含量提高至42.63wt％；在混合糖过氮发酵培养基(以20X+10G(20N)表示)中，细胞干重能达到7.3g/L，PHA含量进一步提高至49.58wt％。该结果进一步说明菌株J9UΔxylD-P8xylA是一株适用于木质纤维素水解液发酵生产PHA的优势菌株。

木质纤维素水解产物通常用于微生物PHA生产，由于玉米秸秆水解液中富含还原性糖和氨基类化合物，加热灭菌会发生美拉德反应(Maillard reaction)，严重影响菌株的生长。同时，嗜盐菌由于其抑制杂菌污染从而允许开放式、未经灭菌的发酵，适合作为木质纤维素生物质进行生物转化的底盘细胞。经过酸处理和酶解后的玉米秸秆水解液经测定含有28.5g/L木糖和10g/L葡萄糖，这种处理方式成本低廉，且造成木糖含量约是葡萄糖含量的3倍。本实施例进一步进行了玉米秸秆水解液作为生物质原料，利用木糖工程菌株J9UΔxylD-P8xylA进行PHA发酵的研究。

其中，玉米秸秆水解液的制备的方法如下：

1、将玉米秸秆(购买，研磨至40～50目)于烘箱中干燥至恒重；

2、使用2％H₂SO₄进行酸水解，液固比10：1，在水浴锅中100℃水解2h；

3、冷却至室温后，使用NaOH调PH至4.8～5.2；

4、按照30FPU/g-CS的比例加入纤维素酶Cellic CTec3 HS(Novozymes,Denmark)，50℃，150rpm酶解36h；

5、使用NaOH调PH至7.0，12000rpm离心20min；

6、随后，取上清液加入0.5％(w/v)的活性炭(100目,Aladdin Reagent Co.,Ltd,Shanghai,China)进行脱毒和脱色处理，50℃，150rpm处理60min；

7、将上一步水解液离心后进行离心20000rpm离心20min，然后过滤，彻底去除不溶性固体；

8、将预处理好的水解液不进行灭菌处理，直接作为开放式发酵培养基配制的基底液，测定葡萄糖和木糖含量后于4℃储存，得到玉米秸秆水解液；

以野生型J9U为对照，木糖工程菌J9UΔxylD-P8xylA在以玉米秸秆水解液为基底液的发酵培养基中37℃，180r/min振荡培养发酵72h；CDW为细胞干重；wt％定义为PHA占细胞干重的比例；数值为三次独立重复实验的平均值±SD(*和**分别表示P<0.05和P<0.01)，用Student’s t-test进行检测。

图20的结果表明，发酵结束后，野生型J9U的OD₆₀₀可以达到12.71，剩余木糖和葡萄糖的含量分别为8.5g/L和4g/L；工程菌J9UΔxylD-P8xylA的OD₆₀₀可以达到18.01，剩余木糖和葡萄糖的含量分别为6g/L和2.5g/L。野生型J9U生产得到5.4g/L的CDW以及1.28g/L的PHA浓度。相比之下，工程菌J9UΔxylD-P8xylA生产得到7.0g/L的CDW以及2.45g/L的PHA浓度，约是野生型的两倍，并且工程菌具有更高的木糖葡萄糖消耗率和转化率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种盐单胞菌J9U的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

酶切自杀质粒pK18mobsacB，得到线性化质粒pK18mobsacB；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coliS17-1λpir；

3.一种盐单胞菌J9U衍生菌，其特征在于，所述盐单胞菌J9U衍生菌基因组中的xylD基因失活，所述盐单胞菌J9U衍生菌包括xylA基因；所述盐单胞菌J9U衍生菌出发菌株为权利要求1或2所述构建方法得到的盐单胞菌J9U。

4.根据权利要求3所述的盐单胞菌J9U衍生菌，其特征在于，所述xylD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，所述xylA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；在所述xylA基因上游插入上调xylA基因的启动子，所述启动子为P8启动子，所述P8启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示。

5.一种权利要求3或4所述盐单胞菌J9U衍生菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将upp基因与权利要求1所述线性化质粒pK18mobsacB连接，得到重组质粒pKJU；

酶切重组质粒pKJU，得到线性化质粒pKJU；

将打靶载体pKJU-ΔxylD转入权利要求1或2所述构建方法得到的盐单胞菌J9U中，得到重组菌J9U，经过两次同源重组后，得到重组菌J9UΔxylD；

将打靶载体pKJU-P8xylA转入重组菌J9UΔxylD中，得到含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD经过两次同源重组后，得到盐单胞菌J9U衍生菌。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述两次同源重组的方式包括采用单交换菌株的筛选所述重组菌J9U或含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD进行第一次同源重组，得到双层条带的菌株，然后将双层条带的菌株进行第二次同源重组；所述单交换菌株的筛选的方式包括重组菌J9U或含有打靶载体pKJU-P8xylA的重组菌J9UΔxylD培养在含有硫酸卡那霉素抗性的高盐培养基中；所述双交换菌株的筛选的方式包括将双层条带的菌株培养在含有5-氟尿嘧啶的高盐培养基中；

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述upp基因为含有启动子的upp基因，所述含有启动子的upp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；所述P8xylA的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。

8.根据权利要求5～7任意一项构建方法所述的盐单胞菌J9U衍生菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。

9.一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，将权利要求5～7任意一项构建方法所述的盐单胞菌J9U衍生菌在含有木糖的发酵培养基中培养，得到聚羟基脂肪酸酯。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括葡萄糖；优选的，所述发酵培养基还包括NH₄Cl；优选的所述发酵培养基还包括葡萄糖和NH₄Cl；

优选的，所述木糖的浓度为10～30g/L；

优选的，所述葡萄糖的浓度为8～12g/L；

优选的，所述NH₄Cl的浓度为10～20g/L；

优选的，所述培养为开放式发酵培养。