CN117801967A - 一种培养冠突散囊菌的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵工程领域，尤其涉及一种培养冠突散囊菌的方法及应用，将桑叶茯茶作为冠突散囊菌的提取茶基，将普鲁兰多糖作为冠突散囊菌培养基成分之一，在传统培养基基础上，替换碳源葡萄糖，在优化菌种之前即可加快冠突散囊菌的培养速度，同时提高后续冠突散囊菌的纯度，降低了生产成本，培养冠突散囊菌的时间缩短至2‑3.5天。同时制备的桑叶茯茶成品中的冠突散囊菌远高于有关标准对冠状散囊菌的理化指标要求。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程领域，尤其涉及一种培养冠突散囊菌的方法及应用。
背景技术
冠突散囊菌俗称金花菌，是从安化黑茶茯砖茶内分离鉴定得到的一种真菌，是对人有益的酵素类菌，具有消食健胃、和胃润肠、通便利尿、降脂减肥、降压降糖、调节人体新陈代谢等保健和疾病预防作用，能分泌淀粉酶、氧化酶等胞外酶，催化茶叶中的蛋白质、淀粉、多酚类等营养物质的氧化、聚合、降解、转化，形成一系列对人体有益的功能成分。桑叶茯茶集桑叶的药用功能和茯茶的健康功能于一身，能够同时满足助消化、健脾胃、降糖降脂的要求。桑叶茯茶含有冠突散囊菌，使得茶汤红、浓、香、醇，制备过程中能够使桑叶固有的苦涩、腥味物质有效转化，利于芳香物质的积累。
茶树生长和茶叶采制有季节性，不同时间影响茶叶的品质，采摘后的茶叶能否第一时间进入制茶工艺环节也会影响后续成品茶的质量，桑叶茯茶除按照传统茶叶的制备方法外还需进行冠突散囊菌的发花阶段，发花成功与否是影响桑叶茯茶成品的关键因素，能否及时对桑叶茯茶进行发花处理尤为重要，要获得成品质量较好的桑叶茯茶，需及时对其接种冠突散囊菌菌种，在接种前，能否得到稳定的冠突散囊菌也成为了关键一环。
发明专利CN105368716B公开了一种冠突散囊菌菌株，改进或新增发花工序，所述的发花工序包括汽蒸增湿、接种发花和干燥，所述的接种发花以冠突散囊菌菌株进行单菌种发酵，至少6-7天才能获得冠突散囊菌。菌种是否稳定还需进一步检测。
发明专利CN102120963B公开了一种冠突散囊菌快速分离方法，其具体步骤为：1)成品茯砖茶的处理；2) 冠突散囊菌发酵液的制备；3) 冠突散囊菌快速分离培养基的制备；4) 冠突散囊菌的培养、纯化；5) 冠突散囊菌的保存。从成品茯砖茶中快速分离冠突散囊菌至少要4-5天。菌种是否稳定也需要进一步鉴定。
现有技术中冠突散囊菌菌种培育至少要4天，需在发花阶段提前至少4天准备好纯度较高的菌种，菌种是否稳定还要额外检测鉴定，由于菌种对环境的要求格外严格，最后获得的冠突散囊菌菌种经常不够稳定，进而影响后续发花质量。
普鲁兰多糖是由葡萄糖残基组成的直链状同型多聚糖，葡萄糖以α-1, 4-糖苷键连接成麦芽三糖，麦芽三糖由 α-1，6 -糖苷键连接形成高分子普鲁兰多糖。普鲁兰多糖具有水溶性、可食用性、成膜性、阻气性，广泛应用于医药工业、食品工业、化妆品、保健品领域，主要起增稠、成膜作用。现有技术中未有将其作为培养基原料的相关说明。
发明内容
为解决冠突散囊菌稳定培育和提纯时间长、影响桑叶茯茶品质的问题，本发明提供一种培养冠突散囊菌的方法及应用。
一种培养冠突散囊菌的方法，包括如下步骤：
步骤1、将桑叶茯茶研磨成茶粉，将茶粉和普鲁兰多糖溶于无菌水中，获得混合溶液，过滤后倒入温热后的马铃薯琼脂培养基中，进行若干组倒置培养试验；
其中，所述桑叶茯茶中冠突散囊菌≥20×104CFU/g；
步骤2、对步骤1中获得的菌落进行纯化，得到单菌落，对单菌落进行鉴定，鉴定合格的为冠突散囊菌。
进一步地，步骤1中所述茶粉的粒径为80-100目，所述茶粉和普鲁兰多糖的质量比为（10-30）：（0.02-0.07），所述混合溶液中普鲁兰多糖的浓度为30-50mg/mL。
进一步地，步骤1中使用0.2-0.6μm过滤膜进行过滤。
进一步地，步骤1中温热的温度为18-40℃。
进一步地，步骤1中所述马铃薯琼脂培养基为固体培养基，其制备方法为：
（1）制备马铃薯粉末：将马铃薯洗净、去皮、挖去芽眼，切块，隔水蒸30-50min，结束后将马铃薯块取出，研磨成马铃薯泥浆，将马铃薯泥浆压薄，所述马铃薯泥浆的厚度为1-3cm，在35-40℃的温度下烘干3-6h，获得马铃薯粉末；
（2）制备马铃薯琼脂培养基：取马铃薯粉末和无菌水按照（15-20）：（50-100）的质量比混合，获得混合液，将所述混合液水热煮沸30min后过滤获得营养液，向所述营养液中加入琼脂，获得培养基溶液，将培养基溶液放入灭菌后的培养皿中，获得所述马铃薯琼脂培养基；
其中，所述琼脂占所述培养基溶液的质量百分数为2-4%。
进一步地，步骤1中所述马铃薯琼脂培养基的接种量为0.5-3%，即过滤后的混合溶液与温热的马铃薯琼脂培养基的体积比为（0.5-3）：100。
进一步地，步骤1中倒置培养的条件为25-37℃，培养的pH值为7-7.5，培养12-36h。
进一步地，步骤2中纯化的步骤为将步骤1的菌落划线接种至凝固后的所述马铃薯琼脂培养基上，在25-30℃环境中，培养36-48 h。
进一步地，步骤2的鉴定为真菌种属鉴定（ITS鉴定），鉴定为散囊菌属阳性且无杂菌，则确定单菌落为冠突散囊菌。
具体的，真菌种属鉴定是指对序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得待测真菌种属信息。
本发明还提供一种桑叶茯茶成品茶，桑叶茯茶成品茶以上述冠突散囊菌发花制备而成，所述桑叶茯茶成品茶中含有冠突散囊菌的数量为（34-55）×104CFU/g。
进一步地，所述桑叶茯茶成品茶的制备方法包括如下步骤：
步骤1、对桑叶进行前处理，获得桑叶原料茶；
步骤2、将桑叶原料茶与黑茶混合，进行再处理，获得茶堆；
步骤3、用上述冠突散囊菌对茶堆进行发花处理，获得所述桑叶茯茶成品茶。
进一步地，所述步骤1包括对新鲜采摘的桑叶进行清洗、切叶、蒸汽杀青、揉捻。
进一步地，步骤1中所述桑叶为每年4-10月采摘的第4片以下的鲜嫩片。
进一步地，所述切叶为将所述桑叶进行切条，获得桑叶条，所述桑叶条的宽度控制在0.2-0.5cm，长度控制在2-3cm。
进一步地，所述蒸汽杀青为将桑叶条用汽热杀青机进行蒸汽杀青2-3min，蒸汽温度为110-120℃。
在网筛上平摊，厚度为4-10cm，18-25℃干燥30-40min。
进一步地，所述揉捻为用揉捻机将蒸汽杀青后的桑叶条揉捻2-4min，获得桑叶原料茶。
进一步地，步骤2中桑叶原料茶和黑茶的质量比为（65-82）：（18-35）。
进一步地，步骤2中再处理的步骤为：先向混合后的桑叶原料茶与黑茶中加入复配溶液，搅拌均匀后，获得湿茶堆，再对湿茶堆进行干燥，获得茶堆，其中复配溶液和桑叶原料茶的质量比为（23-45）：（65-82）；
所述复配溶液由普鲁兰多糖和无菌水配置而成，其中普鲁兰多糖的质量浓度为0.02-0.07%；
所述干燥的温度为40-60℃，干燥时间为5-6h。
进一步地，步骤3中发花处理的步骤为：将上述制备的冠突散囊菌按照（2-4）×104CFU/g的接种量接入茶堆中，移入发花烘房发花处理5-8天，发花处理的条件为温度25-30℃，空气相对湿度60-70％，恒温恒湿发花，获得桑叶茯茶成品茶。
本发明的有益效果在于：
1、本发明将桑叶茯茶作为冠突散囊菌的提取茶基，将普鲁兰多糖作为冠突散囊菌培养基成分之一，在传统培养基的基础上，去除作为碳源的葡萄糖，在优化菌种前即可加快冠突散囊菌的培养速度，同时提高后续冠突散囊菌的纯度，降低了生产成本，相对于现有技术，培养冠突散囊菌的时间缩短至2-3.5天，同时普鲁兰多糖还可作为培养基中的稳定剂和保湿剂，为菌种提供稳定的生长环境；
2、本发明有针对性地选用桑叶茯茶作为冠突散囊菌的提取茶基，桑叶含有丰富的黄酮类化合物、氨基酸、桑叶多酚和三萜类化合物，黄酮类化合物分子中含有酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与冠状散囊菌培养时代谢生成的有机物中的酸性离子中和，及时纠正培养基pH值，而普鲁兰多糖替换葡萄糖作为碳源也需在中性pH值条件下才能稳定培养冠突散囊菌，因此桑叶茯茶和普鲁兰多糖可相辅相成，共同稳定支持冠状散囊菌的生长，为后续提纯和制备全新的桑叶茯茶成品茶提供保障；
3、冠突散囊菌是一种厌氧菌，普鲁兰多糖作为碳源的同时发挥其成膜作用，无需严格控制培养环境中的氧含量即可保证冠突散囊菌顺利培育和优化，降低了生产成本，利于普遍推广；
4、本发明制备的桑叶茯茶成品中的冠突散囊菌远高于《GBT9833.3-2013-紧压茶第3部分：茯砖茶》中对冠状散囊菌的理化指标要求，同时缩短了整个产茶周期。
附图说明
图1为本发明实施例1培养出的冠状散囊菌；
图2为本发明实施例5制备的桑叶茯茶成品茶。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种培养冠突散囊菌的方法，包括如下步骤：
步骤1、将桑叶茯茶研磨成茶粉，将茶粉和普鲁兰多糖溶于无菌水中，获得混合溶液，过滤后倒入温热后的马铃薯琼脂培养基中，进行若干组倒置培养试验；
其中，所述桑叶茯茶中冠突散囊菌为29×104CFU/g；
步骤2、对步骤1中获得的菌落进行纯化，得到单菌落，对单菌落进行鉴定，鉴定合格的为冠突散囊菌。
步骤1中所述茶粉的粒径为80目，所述茶粉和普鲁兰多糖的质量比为10：0.02，所述混合溶液中普鲁兰多糖的浓度为50mg/mL。
步骤1中使用0.2μm过滤膜进行过滤。
步骤1中温热的温度为18℃。
步骤1中所述马铃薯琼脂培养基为固体培养基，其制备方法为：
（1）制备马铃薯粉末：将马铃薯洗净、去皮、挖去芽眼，切块，隔水蒸30min，结束后将马铃薯块取出，研磨成马铃薯泥浆，将马铃薯泥浆压薄，所述马铃薯泥浆的厚度为1cm，在35℃的温度下烘干3h，获得马铃薯粉末；
（2）制备马铃薯琼脂培养基：取马铃薯粉末和无菌水按照15：50的质量比混合，获得混合液，将所述混合液水热煮沸30min后过滤获得营养液，向所述营养液中加入琼脂，获得培养基溶液，将培养基溶液放入灭菌后的培养皿中，获得所述马铃薯琼脂培养基；
其中，所述琼脂占所述培养基溶液的质量百分数为2%。
步骤1中所述马铃薯琼脂培养基的接种量为0.5%，即过滤后的混合溶液与温热的马铃薯琼脂培养基的体积比为3：100。
步骤1中倒置培养的条件为25℃，培养的pH值为7，培养12h。
步骤2中的纯化步骤为将步骤1的菌落划线接种至凝固后的所述马铃薯琼脂培养基上，在25℃环境中，培养36 h，培养结果如图1所示。
步骤2的鉴定为真菌种属鉴定（ITS鉴定），鉴定为散囊菌属阳性且无杂菌，在本实施例中，通过鉴定，可以确定单菌落为冠突散囊菌。
具体的，真菌种属鉴定是指对序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得待测真菌种属信息。
实施例2
本实施例提供一种培养冠突散囊菌的方法，包括如下步骤：
步骤1、将桑叶茯茶研磨成茶粉，将茶粉和普鲁兰多糖溶于无菌水中，获得混合溶液，过滤后倒入温热后的马铃薯琼脂培养基中，进行若干组倒置培养试验；
其中，所述桑叶茯茶中冠突散囊菌为23×104CFU/g；
步骤2、对步骤1中获得的菌落进行纯化，得到单菌落，对单菌落进行鉴定，鉴定合格的为冠突散囊菌。
步骤1中所述茶粉的粒径为100目，所述茶粉和普鲁兰多糖的质量比为30：0.07，所述混合溶液中普鲁兰多糖的浓度为30mg/mL。
步骤1中使用0.6μm过滤膜进行过滤。
步骤1中温热的温度为35℃。
步骤1中所述马铃薯琼脂培养基为固体培养基，其制备方法为：
（1）制备马铃薯粉末：将马铃薯洗净、去皮、挖去芽眼，切块，隔水蒸40min，结束后将马铃薯块取出，研磨成马铃薯泥浆，将马铃薯泥浆压薄，所述马铃薯泥浆的厚度为3cm，在40℃的温度下烘干6h，获得马铃薯粉末；
（2）制备马铃薯琼脂培养基：取马铃薯粉末和无菌水按照20：50的质量比混合，获得混合液，将所述混合液水热煮沸30min后过滤获得营养液，向所述营养液中加入琼脂，获得培养基溶液，将培养基溶液放入灭菌后的培养皿中，获得所述马铃薯琼脂培养基；
其中，所述琼脂占所述培养基溶液的质量百分数为3%。
步骤1中所述马铃薯琼脂培养基的接种量为2%，即过滤后的混合溶液与温热的马铃薯琼脂培养基的体积比为3：100。
步骤1中倒置培养的条件为37℃，培养的pH值为7.5，培养24 h。
步骤2中的纯化步骤为将步骤1的菌落划线接种至凝固后的所述马铃薯琼脂培养基上，在30℃环境中，培养48 h。
步骤2的鉴定为真菌种属鉴定（ITS鉴定），鉴定为散囊菌属阳性且无杂菌，在本实施例中，通过鉴定，可以确定单菌落为冠突散囊菌。
具体的，真菌种属鉴定是指对序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得待测真菌种属信息。
实施例3
本实施例提供一种培养冠突散囊菌的方法，包括如下步骤：
步骤1、将桑叶茯茶研磨成茶粉，将茶粉和普鲁兰多糖溶于无菌水中，获得混合溶液，过滤后倒入温热后的马铃薯琼脂培养基中，进行若干组倒置培养试验；
其中，所述桑叶茯茶中冠突散囊菌为21×104CFU/g；
步骤2、对步骤1中获得的菌落进行纯化，得到单菌落，对单菌落进行鉴定，鉴定合格的为冠突散囊菌。
步骤1中所述茶粉的粒径为80目，所述茶粉和普鲁兰多糖的质量比为20：0.07，所述混合溶液中普鲁兰多糖的浓度为40mg/mL。
步骤1中使用0.4μm过滤膜进行过滤。
步骤1中温热的温度为25℃。
步骤1中所述马铃薯琼脂培养基为固体培养基，其制备方法为：
（1）制备马铃薯粉末：将马铃薯洗净、去皮、挖去芽眼，切块，隔水蒸30min，结束后将马铃薯块取出，研磨成马铃薯泥浆，将马铃薯泥浆压薄，所述马铃薯泥浆的厚度为2cm，在40℃的温度下烘干5h，获得马铃薯粉末；
（2）制备马铃薯琼脂培养基：取马铃薯粉末和无菌水按照15：60的质量比混合，获得混合液，将所述混合液水热煮沸30min后过滤获得营养液，向所述营养液中加入琼脂，获得培养基溶液，将培养基溶液放入灭菌后的培养皿中，获得所述马铃薯琼脂培养基；
其中，所述琼脂占所述培养基溶液的质量百分数为3%。
步骤1中所述马铃薯琼脂培养基的接种量为2%，即过滤后的混合溶液与温热的马铃薯琼脂培养基的体积比为2.5：100。
步骤1中倒置培养的条件为25℃，培养的pH值为7.5，培养12h。
步骤2中的纯化步骤为将步骤1的菌落划线接种至凝固后的所述马铃薯琼脂培养基上，在25℃环境中，培养42 h。
步骤2的鉴定为真菌种属鉴定（ITS鉴定），鉴定为散囊菌属阳性且无杂菌，在本实施例中，通过鉴定，可以确定单菌落为冠突散囊菌。
具体的，真菌种属鉴定是指对序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得待测真菌种属信息。
实施例4
本实施例提供一种桑叶茯茶成品茶，桑叶茯茶成品茶以实施例1制备的冠突散囊菌进行发花制备而成，所述桑叶茯茶成品茶中含有冠突散囊菌的数量为35×104CFU/g。
所述桑叶茯茶成品茶的制备方法包括如下步骤：
步骤1、对桑叶进行前处理，获得桑叶原料茶；
步骤2、将桑叶原料茶与黑茶混合，进行再处理，获得茶堆；
步骤3、用上述冠突散囊菌对茶堆进行发花处理，获得所述桑叶茯茶成品茶。
所述步骤1包括对新鲜采摘的桑叶进行清洗、切叶、蒸汽杀青、揉捻。
步骤1中所述桑叶为每年4月采摘的第4片以下的鲜嫩片。
所述切叶为将所述桑叶进行切条，获得桑叶条，所述桑叶条的宽度范围控制在0.2-0.5cm，长度范围控制在2-3cm。
所述蒸汽杀青为将桑叶条用汽热杀青机进行蒸汽杀青2min，蒸汽温度为110℃。
在网筛上平摊，厚度为4cm，18℃条件下干燥30min。
所述揉捻为用揉捻机将蒸汽杀青后的桑叶条揉捻2min，获得桑叶原料茶。
步骤2中桑叶原料茶和黑茶的质量比为65：35。
步骤2中再处理的步骤为：先向混合后的桑叶原料茶与黑茶中加入复配溶液，搅拌均匀后，获得湿茶堆，再对湿茶堆进行干燥，获得茶堆，其中复配溶液和桑叶原料茶的质量比为23：82；
所述复配溶液由普鲁兰多糖和无菌水配置而成，其中普鲁兰多糖的质量浓度为0.07%；
所述干燥的温度为40℃，干燥时间为5h。
步骤3中发花处理的步骤为：将上述制备的冠突散囊菌按照2×104CFU/g接种量接入茶堆中，移入发花烘房发花处理8天，发花处理的条件为温度25℃，空气相对湿度60％，恒温恒湿发花，获得桑叶茯茶成品茶。
实施例5
本实施例提供一种桑叶茯茶成品茶，桑叶茯茶成品茶以实施例1制备的冠突散囊菌进行发花制备而成，所述桑叶茯茶成品茶中含有冠突散囊菌的数量为41×104CFU/g。
所述桑叶茯茶成品茶的制备方法包括如下步骤：
步骤1、对桑叶进行前处理，获得桑叶原料茶；
步骤2、将桑叶原料茶与黑茶混合，进行再处理，获得茶堆；
步骤3、用上述冠突散囊菌对茶堆进行发花处理，获得所述桑叶茯茶成品茶。
所述步骤1包括对新鲜采摘的桑叶进行清洗、切叶、蒸汽杀青、揉捻。
步骤1中所述桑叶为每年6月采摘的第4片以下的鲜嫩片。
所述切叶为将所述桑叶进行切条，获得桑叶条，所述桑叶条的宽度范围控制在0.2-0.5cm，长度范围控制在2-3cm。
所述蒸汽杀青为将桑叶条用汽热杀青机进行蒸汽杀青3min，蒸汽温度为120℃。
在网筛上平摊，厚度为6cm，25℃条件下干燥40min。
所述揉捻为用揉捻机将蒸汽杀青后的桑叶条揉捻4min，获得桑叶原料茶。
步骤2中桑叶原料茶和黑茶的质量比为82：25。
步骤2中再处理的步骤为：先向混合后的桑叶原料茶与黑茶中加入复配溶液，搅拌均匀后，获得湿茶堆，再对湿茶堆进行干燥，获得茶堆，其中复配溶液和桑叶原料茶的质量比为45：65；
所述复配溶液由普鲁兰多糖和无菌水配置而成，其中普鲁兰多糖的质量浓度为0.05%；
所述干燥的温度为60℃，干燥时间为6h。
步骤3中发花处理的步骤为：将上述制备的冠突散囊菌按照3×104CFU/g接种量接入茶堆中，移入发花烘房发花处理7天，发花处理的条件为温度30℃，空气相对湿度70％，恒温恒湿发花，获得桑叶茯茶成品茶，成品图如图2所示。
实施例6
本实施例提供一种桑叶茯茶成品茶，桑叶茯茶成品茶是以实施例3制备的冠突散囊菌进行发花制备而成，所述桑叶茯茶成品茶中含有冠突散囊菌的数量为55×104CFU/g。
所述桑叶茯茶成品茶的制备方法包括如下步骤：
步骤1、对桑叶进行前处理，获得桑叶原料茶；
步骤2、将桑叶原料茶与黑茶混合，进行再处理，获得茶堆；
步骤3、用上述冠突散囊菌对茶堆进行发花处理，获得所述桑叶茯茶成品茶。
所述步骤1包括对新鲜采摘的桑叶进行清洗、切叶、蒸汽杀青、揉捻。
步骤1中所述桑叶为每年10月采摘的第4片以下的鲜嫩片。
所述切叶为将所述桑叶进行切条，获得桑叶条，所述桑叶条的宽度范围控制在0.2-0.5cm，长度范围控制在2-3cm。
所述蒸汽杀青为将桑叶条用汽热杀青机进行蒸汽杀青3min，蒸汽温度为120℃。
在网筛上平摊，厚度为6cm，25℃条件下干燥40min。
所述揉捻为用揉捻机将蒸汽杀青后的桑叶条揉捻4min，获得桑叶原料茶。
步骤2中桑叶原料茶和黑茶的质量比为74：35。
步骤2中再处理的步骤为：先向混合后的桑叶原料茶与黑茶中加入复配溶液，搅拌均匀后，获得湿茶堆，再对湿茶堆进行干燥，获得茶堆，其中复配溶液和桑叶原料茶的质量比为60：82；
所述复配溶液由普鲁兰多糖和无菌水配置而成，其中普鲁兰多糖的质量浓度为0.02%；
所述干燥的温度为60℃，干燥时间为6h。
步骤3中发花处理的步骤为：将上述制备的冠突散囊菌按照4×104CFU/g接种量接入茶堆中，移入发花烘房发花处理7天，发花处理的条件为温度30℃，空气相对湿度为70％，恒温恒湿发花，获得桑叶茯茶成品茶。
对比例1
本对比例为实施例1中采购的桑叶茯茶，冠突散囊菌为29×104CFU/g。
对比例2
本对比例为实施例2中采购的桑叶茯茶，冠突散囊菌为23×104CFU/g。
对比例3
本对比例为实施例3中采购的桑叶茯茶，冠突散囊菌为21×104CFU/g。
测试例1
对实施例4-6和对比例1-3中的茶叶进行理化指标检测，检测标准为《GBT9833.3-2013-紧压茶第3部分：茯砖茶》，检测结果见表1：
表1 实施例4-6和对比例1-3中的茶叶理化指标检测对比
本发明将桑叶茯茶作为冠突散囊菌的提取茶基，将普鲁兰多糖作为冠突散囊菌培养基成分之一，在传统培养基基础上，去除作为碳源的葡萄糖，在优化菌种前即可加快冠突散囊菌的培养速度，同时提高后续冠突散囊菌的纯度。由以上对比可知，将本发明培养的冠状散囊菌用于制备新的桑叶茯茶，获得的成品茶各项理化指标均优于市售的桑叶茯茶。
Claims (10)
1.一种培养冠突散囊菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将桑叶茯茶研磨成茶粉，将茶粉和普鲁兰多糖溶于无菌水中，获得混合溶液，过滤后倒入温热后的马铃薯琼脂培养基中，进行若干组倒置培养试验；
其中，所述桑叶茯茶中冠突散囊菌≥20×104 CFU/g；
步骤2、对步骤1中获得的菌落进行纯化，得到单菌落，对单菌落进行鉴定，鉴定合格的为冠突散囊菌。
2.根据权利要求1所述培养冠突散囊菌的方法，其特征在于，步骤1中所述茶粉的粒径为80-100目，所述茶粉和普鲁兰多糖的质量比为（10-30）：（0.02-0.07），所述混合溶液中普鲁兰多糖的浓度为30-50mg/mL。
3.根据权利要求2所述培养冠突散囊菌的方法，其特征在于，步骤1中所述马铃薯琼脂培养基为固体培养基，其制备方法为：
（1）制备马铃薯粉末：将马铃薯洗净、去皮、挖去芽眼，切块，隔水蒸30-50min，结束后将马铃薯块取出，研磨成马铃薯泥浆，将马铃薯泥浆压薄，所述马铃薯泥浆的厚度为1-3cm，在35-40℃的温度下烘干3-6h，获得马铃薯粉末；
（2）制备马铃薯琼脂培养基：取马铃薯粉末和无菌水按照（15-20）：（50-100）的质量比混合，获得混合液，将所述混合液水热煮沸30min后过滤获得营养液，向所述营养液中加入琼脂，获得培养基溶液，将培养基溶液放入灭菌后的培养皿中，获得所述马铃薯琼脂培养基；
其中，所述琼脂占所述培养基溶液的质量百分数为2-4%。
4.根据权利要求3所述培养冠突散囊菌的方法，其特征在于，步骤1中所述马铃薯琼脂培养基的接种量为0.5-3%，即过滤后的混合溶液与温热的马铃薯琼脂培养基的体积比为（0.5-3）：100。
5.根据权利要求1所述培养冠突散囊菌的方法，其特征在于，步骤2中纯化的步骤为将步骤1筛选的菌落划线接种至固体马铃薯琼脂培养基上，在25-30℃环境中，培养36-48 h。
6.根据权利要求5所述培养冠突散囊菌的方法，其特征在于，步骤2的鉴定为真菌种属鉴定。
7.一种桑叶茯茶成品茶，其特征在于，桑叶茯茶成品茶以权利要求1-6任一项冠突散囊菌发花制备而成，所述桑叶茯茶成品茶中含有冠突散囊菌的数量为（34-55）×104 CFU/g。
8.根据权利要求7所述桑叶茯茶成品茶，其特征在于，所述桑叶茯茶成品茶的制备方法包括如下步骤：
步骤1、对桑叶进行前处理，获得桑叶原料茶；
步骤2、将桑叶原料茶与黑茶混合，进行再处理，获得茶堆；
步骤3、用上述冠突散囊菌对茶堆进行发花处理，获得所述桑叶茯茶成品茶。
9.根据权利要求8所述桑叶茯茶成品茶，其特征在于，所述步骤1包括对新鲜采摘的桑叶进行清洗、切叶、蒸汽杀青、揉捻；
步骤2中桑叶原料茶和黑茶的质量比为（65-82）：（18-35）；
步骤2中再处理的步骤为：先向混合后的桑叶原料茶与黑茶中加入复配溶液，搅拌均匀后，获得湿茶堆，再对湿茶堆进行干燥，获得茶堆，其中复配溶液和桑叶原料茶的质量比为（23-45）：（65-82）；
所述复配溶液由普鲁兰多糖和无菌水配置而成，其中普鲁兰多糖的质量浓度为0.02-0.07%；
所述干燥的温度为40-60℃，干燥时间为5-6h。
10.根据权利要求8所述桑叶茯茶成品茶，其特征在于，步骤3中发花处理的步骤为：将权利要求1-6任一项制备的冠突散囊菌按照（2-4）×104 CFU/g接种量接入茶堆中，移入发花烘房发花处理5-8天，发花处理的条件为温度25-30℃，空气相对湿度60-70％，恒温恒湿发花，获得桑叶茯茶成品茶。
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| GR01 | Patent grant | ||
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