CN117801118A - 一种用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本申请实施例提供了用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白、核酸、载体和试剂盒及其用途。该融合蛋白包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中，所述第一结构域包含用于将所述融合蛋白定位至细胞核的定位多肽或与所述定位多肽的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体；所述第二结构域包含m6A结合蛋白或与所述m6A结合蛋白的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体；并且所述第三结构域包含荧光蛋白或与所述荧光蛋白的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体。本申请实施例提供的融合蛋白能够实现被病毒侵染后宿主细胞中RNA的m6A水平变化的实时监测，成功为病毒侵染机制研究以及抗病毒药物的筛选提供了新的工具。
Description
技术领域
本申请涉及分子检测领域，具体涉及用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白、核酸、载体和试剂盒及其用途。
背景技术
所有生命的RNA分子都有各种转录后的化学修饰即表观转录组。N6-甲基腺苷(m6A)是发生在腺苷N6位置的甲基化，是真核信使RNA和非编码RNA中最普遍和最具代表性的RNA修饰。细胞m6A修饰是一个动态过程，会受病毒(例如SARS-CoV-2)、细菌、真菌等病原体入侵的干扰。因此，实时监控受到病原体感染的细胞中的m6A修饰对于解析细胞免疫过程及抗病毒方法研究具有重要意义。
目前可以准确量化RNA m6A的细胞表观转录组研究方法都依赖于液相色谱、层析色谱、质谱和毛细管电泳等大型实验室设备，因此难以动态监控病毒等外源病原体的入侵过程和宿主细胞中RNA m6A甲基化的生物学动态特征，限制了对于病毒致病机制的研究和相应疫苗的开发。
由此，亟待提出一种能够实时监控细胞表观转录的成像方法，以提高对于病毒等外源病原体的致病机制研究和疫苗开发的效率。
发明内容
本申请至少从以下方面解决了相关技术的问题之一。
为此，本申请第一方面实施例提供了用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白，包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中，
所述第一结构域包含用于将所述融合蛋白定位至细胞核的定位多肽或与所述定位多肽的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体；
所述第二结构域包含m6A结合蛋白或与所述m6A结合蛋白的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体；并且
所述第三结构域包含荧光蛋白或与所述荧光蛋白的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体。
在一些实施例中，所述定位多肽包含核定位信号。
在一些实施例中，所述定位多肽包含1至4个核定位信号。
在一些实施例中，所述定位多肽包含2个核定位信号。
在一些实施例中，所述核定位信号为病毒SV40的T抗原。在一些实施例中，其中所述m6A结合蛋白为YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2或YTHDF3。
在一些实施例中，其中所述荧光蛋白为mCherry荧光蛋白、GFP荧光蛋白、ECFP荧光蛋白或YPet荧光蛋白。
在一些实施例中，所述GFP荧光蛋白为EGFP荧光蛋白。
在一些实施例中，编码所述定位多肽的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施例中，其中编码所述m6A结合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施例中，所述定位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些实施例中，所述m6A结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施例中，其中编码所述融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示。
本申请第二方面实施例提供了编码上述第一方面实施例所述融合蛋白的核酸。
本申请第三方面的实施例提供了包含上述第二方面实施例所述核酸的载体。
本申请第四方面的实施例提供了包含上述第一方面实施例所述融合蛋白、上述第二方面实施例所述核酸或上述第三方面实施例所述载体的试剂盒。
本申请第五方面的实施例提供了上述第一方面实施例所述融合蛋白、上述第二方面实施例所述核酸、上述第三方面实施例所述载体或上述第四方面实施例所述试剂盒在实时监控待测细胞表观转录中的用途。
本申请的实施例实现了如下有益效果：
本申请实施例提供的融合蛋白能够实现待测细胞在各种情况下(例如被病毒等外源病原体侵入的情况下)RNA的m6A水平变化的实时监测，实现了待测细胞在各种情况下表观转录信息的动态变化研究，成功为病毒侵染机制研究以及抗病毒药物的筛选提供了新的工具。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提出的融合蛋白的作用原理示意图。
图2是本申请实施例1中实验组(EGFP-YTH-NLS)、对照组1(EGFP-YTHmut-NLS)和对照组2(METTL3-KO)的成像及细胞质荧光统计图。
图3是本申请实施例1的对照组2宿主细胞的m6A水平随着用于敲除宿主细胞中METTL3的敲除质粒的用量而变化的结果。
图4是本申请实施例2中SARS-CoV-2侵染过程中宿主细胞m6A水平实时监测和相关性图。
图5是本申请实施例3中SARS-CoV-2及其奥密克戎变体侵染后宿主m6A水平差异图，其中C/T表示细胞质中融合蛋白的荧光信号占比FCmCherry/FTmCherry。
图6是高效液相色谱测定本申请实施例1对照组2中宿主细胞m6A水平的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，并非限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
本申请是基于发明人的以下认识做出的：
所有生命的RNA分子都有各种转录后的化学修饰即表观转录组。N6-甲基腺苷(m6A)是发生在腺苷N6位置的甲基化，是真核信使RNA和非编码RNA中最普遍和最具代表性的RNA修饰。细胞m6A修饰是一个动态过程，会受病毒(例如SARS-CoV-2)、细菌、真菌等病原体入侵的干扰。因此，实时监控受到病原体感染的细胞中的m6A修饰对于解析细胞免疫过程及抗病毒方法研究具有重要意义。
例如，严重的急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是一种单链的RNA病毒，曾导致世界流行疾病，引起了全球卫生和生态危机。SARS-CoV-2的感染可能会改变宿主细胞甲基转移酶和去甲基化酶等m6A等相关蛋白的表达，干扰细胞RNA m6A修饰的水平，因此研究包括SARS-CoV-2感染过程中宿主细胞的表观转录修饰对解析细胞免疫过程及抗病毒方法研究具有重要意义。
近年来，逆转录酶聚合酶链反应、化学标记、测序技术、特征分析技术得以发展。自2012年起，RNA m6A甲基化的RNA免疫沉淀测序(MeRIP-Sep)得到广泛使用，可以鉴定总RNA中的m6A，使得m6A得基因定位成为可能。然而，在以上方法中细胞总RNA被提取并消化为核苷或核苷酸，并依赖于色谱方法进行分析。也就是说，现有技术中可以准确量化RNA m6A的细胞表观转录组研究方法都依赖于液相色谱、层析色谱、质谱和毛细管电泳等大型实验室设备，难以动态监控病毒等外源病原体的入侵过程和宿主细胞中RNA m6A甲基化的生物学动态特征，也无法指示细胞间的信息差异，限制了对于病毒致病机制的研究和相应疫苗的开发。
对此，本申请第一方面实施例提供了一种用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白，其原理如图1所示，其中用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白，包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中，第一结构域包含用于将融合蛋白定位至细胞核的定位多肽或与定位多肽的氨基酸序列具有至少85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的变体；第二结构域包含m6A结合蛋白或与m6A结合蛋白的氨基酸序列具有至少85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的变体；第三结构域包含荧光蛋白或与荧光蛋白的氨基酸序列具有至少85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的变体。
本申请实施例提供的用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白通过其中的定位多肽或与定位多肽的氨基酸序列具有至少85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的变体定位至细胞核中，这也就是说，该定位多肽能够使在待测细胞中异源表达的融合蛋白聚集在待测细胞的细胞核中。进一步地，聚集在待测细胞细胞核中的融合蛋白通过其中的m6A结合蛋白与m6A甲基化RNA结合，并且被m6A甲基化RNA从细胞核转移至细胞质中，因此通过荧光成像方法即可实时检测细胞核和细胞质中的荧光强度的变化，从而实现待测细胞表观转录信息的动态变化研究。
在一些实施例中，其中定位多肽包含核定位信号(nuclear localizationsignals,NLS)。
在一些实施例中，定位多肽包含1至4个核定位信号。
在一些实施例中，定位多肽包含2个核定位信号。
在一些实施例中，核定位信号为病毒SV40的T抗原。
在一些实施例中，其中m6A结合蛋白为YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2或YTHDF3。
在一些实施例中，其中荧光蛋白为mCherry荧光蛋白、GFP荧光蛋白、ECFP荧光蛋白或YPet荧光蛋白。
在一些实施例中，其中GFP荧光蛋白为EGFP荧光蛋白。
在一些实施例中，其中编码定位多肽的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施例中，其中编码m6A结合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施例中，其中定位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一些实施例中，其中m6A结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施例中，其中编码融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
本申请第二方面的实施例提供了一种编码上述第一方面实施例的融合蛋白的核酸。
本申请第三方面的实施例提供了一种包含上述第二方面实施例的核酸的载体。
本申请第四方面的实施例提供了一种包含上述第一方面的实施例的融合蛋白、上述第二方面实施例的核酸或上述第三方面实施例的载体的试剂盒。
本申请第五方面的实施例提供了上述第一方面的实施例的融合蛋白、上述第二方面实施例的核酸、上述第三方面实施例的载体或上述第四方面的试剂盒在实时监控待测细胞表观转录中的用途。
下表1中示出了与本申请实施例提供的融合蛋白相关的核酸及氨基酸序列，其中SEQ ID NO.1是编码包含融合蛋白(包含EGFP-YTHDC2-NLS)的共表达质粒的核酸序列；SEQID NO.2是编码融合蛋白(包含mCherry-YTHDC2-NLS)的共表达质粒的核酸序列；SEQ IDNO.3是编码定位多肽的核酸序列(包含两个NLS和两者之间的linker)；SEQ ID NO.4是编码m6A结合蛋白的核酸序列；SEQ ID NO.5是核定位信号的氨基酸序列；SEQ ID NO.6是m6A结合蛋白的氨基酸序列；SEQ ID NO.7是编码融合蛋白(包含EGFP-YTHDC2-NLS)的核酸序列；SEQID NO.8编码融合蛋白(包含mCherry-YTHDC2-NLS)的核酸序列。
表1
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本申请中，术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
术语“序列同一性”表示：如果两个或更多个序列具有相同长度和顺序的核苷酸或氨基酸，则它们是相同的。同一性的百分比通常描述两个序列相同的程度，即它通常描述在其序列位置上对应于参考序列的相同核苷酸的核苷酸的百分比。为了确定同一性的程度，待比较的序列被认为具有相同的长度，即待比较的序列的最长序列的长度。这意味着由8个核苷酸/氨基酸组成的第一序列与由包含第一序列的10个核苷酸/氨基酸组成的第二序列具有80％的同一性。换句话说，在本发明的上下文中，序列的同一性优选地涉及在具有相同长度的两个或更多个序列中具有相同位置的序列的核苷酸/氨基酸的百分比。帽子通常被认为是不相同的位置，不管它们在比对中的实际位置。
术语“载体”是指核酸分子，优选指人工核酸分子。本发明上下文中的载体适用于并入或携带所需的核酸序列，例如包含开放阅读框的核酸序列。这样的载体可以是储存载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。储存载体是允许方便地储存核酸分子(例如mRNA分子)的载体。因此，载体可以包含对应于例如所需的mRNA序列或其部分的序列，例如对应于mRNA的开放阅读框和3'-UTR的序列。表达载体可以用于产生表达产物如RNA，例如mRNA，或肽、多肽或蛋白质。例如，表达载体可以包含转录载体序列片段所需的序列，例如启动子序列，例如RNA聚合酶启动子序列。克隆载体通常是含有克隆位点的载体，克隆位点可以用于将核酸序列并入载体中。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合于将核酸分子转移到细胞或生物体中的载体，例如病毒载体。本发明上下文中的载体可以是例如RNA载体或DNA载体。优选地，载体是DNA分子。优选地，本申请意义上的载体包含克隆位点、选择标记物(例如抗生素抗性因子)和适合于载体增殖的序列，例如复制起点。优选地，本申请上下文中的载体是质粒载体。
质粒DNA：术语“质粒DNA”是指环状核酸分子，优选为人工的核酸分子。本发明上下文中的质粒DNA适用于并入或携带所需的核酸序列，例如包含RNA编码序列和/或编码至少一种肽或多肽的开放阅读框的核酸序列。这样的质粒DNA构建体可以是存储载体、表达载体、克隆载体、转移载体等。存储载体是允许方便地存储核酸分子(例如RNA分子)的载体。因此，质粒DNA可以包含对应于(编码)例如靶标RNA序列或其部分序列(诸如对应于mRNA的开放阅读框和5'和/或3'UTR的序列)的序列。表达载体可用于在称为体外转录的过程中产生表达产物，例如RNA，诸如mRNA。例如，表达载体可以包含对载体的序列片段进行体外转录所需的序列，例如启动子序列，例如RNA启动子序列，优选T3、T7或SP6 RNA启动子序列。克隆载体通常是含有可以用于将核酸序列并入(插入)载体中的克隆位点的载体。克隆载体可以是例如质粒载体或噬菌体载体。转移载体可以是适合于将核酸分子转移到细胞或生物体中的载体，例如病毒载体。优选地，本发明含义内的质粒DNA载体包含多克隆位点、RNA启动子序列、任选的选择标记物例如抗生素抗性因子、以及适合于载体复制的序列，例如复制起点。形成待体外转录的RNA模板的DNA可以作为可以在细菌中复制的质粒的部分通过发酵增殖和随后的分离来制备。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
如无特殊说明，以下实施例中的定量分析试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
一种细胞表观转录标记成像方法，包括如下步骤(a)至(d)。
(a)基于pcDNA3.1载体，构建核定位多肽(包含NLS-linker-NLS)、m6A结合蛋白YTHDC2和EGFP荧光蛋白的共表达质粒，制得EGFP-YTH-NLS质粒作为实验组(标记为EGFP-YTH-NLS组)，其核酸序列如表1中SEQ ID NO.8所示。
(b)将步骤(a)构建的共表达质粒EGFP-YTH-NLS转染进过表达血管紧张素Ace2的HEK293T细胞(hAce2-HEK293T)内表达包含NLS、EGFP和YTHDC2的融合蛋白，其中包括如下步骤(b1)至(b4)。
(b1)将hAce2-HEK293T细胞使用添加有10％胎牛血清的DMEM培养基铺板于35-20mm玻璃底共聚焦皿，在5％的CO2，37℃培养16h，使得转染时的细胞密度为80％；
(b2)分别使用50μL无血清DMEM培养基稀释200ng共表达质粒EGFP-YTH-NLS和4μL脂质体核酸转染试剂，并且在20℃孵育5min；
(b3)混合稀释的质粒和转染试剂，在20℃孵育20min；
(b4)将步骤(b3)制得的混合物加入步骤(b1)中铺有hAce2-HEK293T细胞的共聚焦皿中，在5％的CO2，37℃培养24h。
在hAce2-HEK293T细胞中异源表达融合蛋白后，定位多肽使在该融合蛋白聚集在hAce2-HEK293T细胞的细胞核中，然后m6A甲基化RNA通过YTHDC2识别并结合在融合蛋白上，将融合蛋白从细胞核转移至细胞质。
(c)准备对照组1和2，其中：
对照组1：在EGFP-YTH-NLS质粒的基础上，使YTHDC2中识别RNA m6A的区域突变，得到EGFP-YTHmut-NLS质粒，按照步骤(b)进行试验，标记为EGFP-YTHmut-NLS组。
对照组2：采用上述步骤(a)制得的EGFP-YTH-NLS质粒，按照步骤(b)进行试验，并将步骤(b)中的hAce2-HEK293T细胞替换为使用CRISPR-Cas9技术敲除了m6A甲基化编辑酶METTL3的hAce2-HEK293T细胞，标记为METTL3-KO组。
(d)通过激光共聚焦成像方法实时监测上述实验组、对照组1和对照组2中hAce2-HEK293T细胞的细胞核和细胞质的荧光信号，使用细胞质荧光占比指示胞内RNA的m6A甲基化程度，在成像前使用赫斯特荧光染料33342(hoechst33342)染细胞核，并使用Leica激光共聚焦荧光显微镜采集荧光信号。
结果如图2所示，只有实验组中的融合蛋白可以识别m6A甲基化，从而被m6A甲基化RNA从细胞核转移至细胞质，导致细胞质荧光占比上升，荧光信号向细胞质分布；对照组1中融合蛋白中识别RNA m6A的区域突变，无法与m6A甲基化RNA结合，因此滞留在细胞核内；对照组2中，通过敲除质粒将宿主细胞的m6A甲基化编辑酶METTL3敲除，胞内m6A水平下降无法结合融合蛋白，使其滞留在细胞核内，细胞质荧光占比下降(图3)，随着敲除质粒的用量从0ng提高至100ng，细胞质荧光占比从60％左右下降至趋近于0％。
实施例2
实时监控被病毒侵染的宿主细胞(hAce2-HEK293T细胞)的表观转录，包括以下步骤(1)至(3)。
(1)将实施例1中EGFP-YTH-NLS质粒中的EGFP荧光蛋白替换为mCherry荧光蛋白，构建mCherry-YTH-NLS质粒，其核酸序列如表1中SEQ ID NO.9所示，并按照实施例1中的步骤(b)，将mCherry-YTH-NLS质粒转染进hAce2-HEK293T细胞内，随后使用GFP荧光蛋白标记的假病毒SARS-CoV-2(购买自吉满生物科技(上海)有限公司)侵染hAce2-HEK293T细胞，其中使用GFP荧光蛋白标记的假病毒SARS-CoV-2侵染HEK293T细胞包括以下步骤(1-1)至(1-3)。
(1-1)移除细胞培养基，用Hank’s缓冲溶液清洗包含mCherry-YTH-NLS质粒的细胞3次；
(1-2)使用Hank’s缓冲溶液稀释GFP荧光标记的假病毒，以病毒:细胞＝0.01的比例将病毒加入培养皿，在5％的CO2，37℃孵育30min；
(1-3)移除缓冲溶液，添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养0-40h。
(2)使用Leica激光共聚焦成像方法实时监测病毒侵染后细胞中的mCherry荧光信号和GFP荧光信号。
(3)分析细胞核和细胞质中的mCherry荧光信号(融合蛋白荧光信号)和GFP荧光信号(病毒荧光信号)的关系，从而表征病毒侵染后宿主m6A甲基化水平和病毒侵染细胞的程度，具体包括以下步骤(3-1)至(3-4)。
(3-1)利用Image J软件定位整体细胞和细胞核记为T和N；将病毒荧光信号记为FGFP，将融合蛋白的荧光信号记录为FmCherry。
(3-2)统计整体细胞和细胞核中融合蛋白的荧光信号，分别记为FTmCherry和FNmCherry。
(3-3)定义细胞质中融合蛋白的荧光信号FCmCherry＝FTmCherry-FNmCherry，并计算细胞质荧光占比FCmCherry/FTmCherry。
(3-4)分析细胞病毒荧光信号FGFP和细胞质中融合蛋白的荧光信号占比FCmCherry/FTmCherry的相关性，以表征病毒侵染后宿主细胞总RNA m6A修饰的水平。
结果发现，如图4所示，病毒侵染后GFP荧光信号(FGFP)逐渐加强，宿主细胞细胞质中融合蛋白的荧光占比(FCmCherry/FTmCherry)逐渐上升，在侵染40h后稳定，可知病毒侵染40h内会促进宿主RNA m6A水平。
实施例3
使用GFP标记的野生型SARS-CoV-2及其奥密克戎变体(购买自吉满生物科技(上海)有限公司)，按照实施例2中的方案侵染转染了mCherry-YTHDC2-NLS质粒的hAce2-HEK293T细胞，并解析病毒入侵后细胞RNA m6A甲基化水平。
实验结果如图5所示，发现被野生型SARS-CoV-2侵染的细胞的GFP的荧光信号低于被奥密克戎变体侵染的细胞的GFP的荧光信号，但是被野生型SARS-CoV-2侵染的细胞的细胞质荧光占比高于被奥密克戎变体侵染的细胞的细胞质荧光占比，揭示了奥密克戎变体的侵染能力强但对宿主RNA m6A甲基化的影响弱。
综合以上实施例1至3，证明了本申请实施例提供的融合蛋白可以成功用于病毒侵染后宿主表观转录的动态解析。
对比例1
相比本申请实施例采用的方法，本对比例运用传统的液相色谱法，通过提取实施例1对照组2经CRISPR-Cas9技术敲除了m6A甲基化编辑酶METTL3的hAce2-HEK293T细胞的总RNA，将其消化为核苷，色谱分析定量细胞总RNA的m6A水平。结果如图6所示，液相色谱定量细胞总体RNA的m6A水平，但是操作繁琐，且无法获取甲基化修饰的原位信息，无法解析单个细胞内表观转录修饰水平，无法获取细胞的异质性信息。
因此，本申请实施例提供的融合蛋白和通过该融合蛋白实现细胞表观转录标记成像方法能够成功用于SARS-CoV-2病毒及其奥密克戎变体侵染细胞后的宿主表观转录组原位解析，且与现有细胞转录修饰分析方法相比具有明显的优势。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.用于实时监控细胞表观转录的融合蛋白，包含第一结构域、第二结构域和第三结构域，其中，
所述第一结构域包含用于将所述融合蛋白定位至细胞核的定位多肽或与所述定位多肽的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体；
所述第二结构域包含m6A结合蛋白或与所述m6A结合蛋白的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体；并且
所述第三结构域包含荧光蛋白或与所述荧光蛋白的氨基酸序列具有至少85％同一性的变体。
2.根据权利要求1所述融合蛋白，其中所述定位多肽包含1至4个，优选为2个核定位信号；优选地，所述核定位信号为病毒SV40的T抗原。
3.根据权利要求1所述融合蛋白，其中所述m6A结合蛋白为YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2或YTHDF3。
4.根据权利要求1所述融合蛋白，其中所述荧光蛋白为mCherry荧光蛋白、GFP荧光蛋白、ECFP荧光蛋白或YPet荧光蛋白；优选地，所述GFP荧光蛋白为EGFP荧光蛋白。
5.根据权利要求1所述融合蛋白，编码所述定位多肽的核酸序列如SEQ ID NO.3所示；
可选地，其中编码所述m6A结合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；
可选地，其中所述定位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
可选地，其中所述m6A结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求1所述融合蛋白，其中编码所述融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
7.编码根据权利要求1至6中任一项所述融合蛋白的核酸。
8.包含根据权利要求7所述核酸的载体。
9.包含根据权利要求1至6中任一项所述融合蛋白、根据权利要求7所述核酸或根据权利要求8所述载体的试剂盒。
10.根据权利要求1至6中任一项所述融合蛋白、根据权利要求7所述核酸、根据权利要求8所述载体或根据权利要求9所述试剂盒在实时监控待测细胞表观转录中的用途。
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