CN117778486A - 一种l-草铵膦的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种L‑草铵膦的生物合成方法。本发明方法以2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由单一的羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L‑草铵膦，不需要立体选择性高的羟基酸脱氢酶，并且实现了辅酶的自循环，无需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料就可完成2‑羟基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸的到L‑草铵膦的转化。本发明方法的最终产物中没有任何副产物的生成，从而极大地简化了L‑草铵膦的后续精制工艺，显著产品总收率。进一步地，本发明选定的酶组合催化活性好，底物转化率高，可在更短时间内获得更高的L‑草铵膦产率，更适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种L-草铵膦的生物合成方法。
背景技术
草铵膦，化学式为C5H15N2O4P，化学式量为198.16，是一种非选择性叶片喷施的有机磷除草剂英文通用名：glufosinate ammonium，化学名为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸或2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸铵，是一种广谱触杀型灭生性除草剂，具有低毒、活性高和环境友好等优点。普通草铵膦存在2种光学构型，但只有L-型具有除草活性，因此，L-草铵膦的生物活性是普通草铵膦的2倍，随着工艺技术的改进，L-草铵膦势必全面替代现有的普通草铵膦的市场，这符合国家的农药减量要求，降低了使用成本和减轻环境压力。
目前L-草铵膦的制备方法主要有三种：化学不对称氢化法、手性拆分法以及生物催化法，但是，现在主流采用生物催化法。例如US9834802B采用DAAO酶将D-草铵膦转化为PPO，然后在异丙胺转氨酶的作用下将PPO转化为L-草铵膦，该工艺采用了DAAO酶本身会产生双氧水，虽然加入过氧化氢酶破坏产生的双氧水以提高收率，但是存在收率10％以上的损失，以异丙胺为胺基供体的转氨酶对PPO转化不完全，收率低，异丙胺和丙酮分离困难等问题。CN105603015B采用L-丙氨酸为氨基供体的转氨酶制备L-草铵膦，虽然提高了转氨酶的活性，但反应底物PPO价格较高，且需要特定的氨基供体L-丙氨酸，导致L-草铵膦的生产成本较高。CN111019982B中公开了以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料制备L-草铵膦的方法，该方法需要同时加入L-选择性脱氢酶和D-选择性脱氢酶，并且脱氢酶的酶活不高，反应时间长，效率低。
因此，还需要寻找更多的L-草铵膦生物合成方法，以实现进一步提高生产效率、降低成本，更适合工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种效率更高、成本更低、更适合工业化生产的L-草铵膦制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种L-草铵膦的生物合成方法，以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，在辅酶和氨基供体存在下，经羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶共同催化制备L-草铵膦。
在一些实施例中，所述羟基酸脱氢酶选自来源于Schleiferilactobacillusharbinensis(WP_027828400.1)的2-脱氢泛酸还原酶、来源于Roseiflexus castenholzii(WP_012119261.1)的2-脱氢泛酸还原酶或来源于Truepera radiovictrix(WP_013177987.1)的2-脱氢泛酸还原酶，也可以是来源于Streptococcus(WP_000204727.1)的L-乳酸脱氢酶或来源于Levilactobacillus brevis ATCC 367(WP_011668914.1)的D-扁桃酸脱氢酶。
在本发明中，所述羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶既可以是离体酶，也可以是全细胞酶。
在本发明中，所述羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶既可以是游离的，也可以是固定化酶。
优选地，所述羟基酸脱氢酶为来源于Schleiferilactobacillus harbinensis的2-脱氢泛酸还原酶。
进一步优选地，所述羟基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述消旋酶为扁桃酸盐消旋酶。
进一步优选地，所述消旋酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步优选地，所述辅酶为NAD+和/或NADP+。
进一步优选地，所述氨基供体为NH4Cl和/或氨水。
根据一些具体实施方式，采用碱性物质调节2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液的pH值为8～9，然后加入辅酶、选择性地加入NH4Cl、加入羟基酸脱氢酶粗酶液、消旋酶粗酶液和氨基酸脱氢酶粗酶液后反应，反应时使用碱性物质控制pH值为8～9，反应体系中至少含有NH4Cl或氨水。
优选地，所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液的初始浓度为10～800mM，进一步优选为300～600mM。
优选地，所述辅酶的投料浓度为0.001～1.0mM，进一步优选为0.1～1.0mM，更进一步优选为0.4～0.6mM。
优选地，所述羟基酸脱氢酶粗酶液、消旋酶粗酶液和氨基酸脱氢酶粗酶液的投料体积分别独立地为所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液的投料体积的5％～20％，进一步优选为5％～15％，更进一步优选为8％～12％。
优选地，所述所述氨基供体与所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的摩尔比为(1～5):1。
优选地，所述反应的温度为20～40℃，进一步优选为35～37℃。
优选地，所述反应的时间为2～24h，进一步优选为8～15h，更优选为10～12h。
优选地，所述碱性物质为氨水、三乙胺、三甲胺、N,N-二异丙基乙胺、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾中的一种或多种。
本发明第二方面还提供一种羟基酸脱氢酶在制备L-草铵膦中的用途，所述的羟基酸脱氢酶为来源于harbinensis乳杆菌的2-脱氢泛酸还原酶，其具有NCBI登陆号为WP_027828400.1的氨基酸序列。本发明第三方面还提供一种酶组合物在L-草铵膦制备中的应用，所述酶组合物包括羟基酸脱氢酶、扁桃酸盐消旋酶和氨基酸脱氢酶，所述羟基酸脱氢酶具有NCBI登陆号为WP_027828400.1的氨基酸序列，所述扁桃酸盐消旋酶具有NCBI登陆号为AAC15504.1的氨基酸序列，所述氨基酸脱氢酶具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明方法以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由单一的羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L-草铵膦，不需要立体选择性高的羟基酸脱氢酶，并且实现了辅酶的自循环，无需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料就可完成2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的到L-草铵膦的转化。本发明方法的最终产物中没有任何副产物的生成，从而极大地简化了L-草铵膦的后续精制工艺，显著产品总收率。进一步地，本发明选定的酶组合催化活性好，底物转化率高，可在更短时间内获得更高的L-草铵膦产率，更适合工业化生产。
具体实施方式
为了进一步提高生物法合成L-草铵膦的效率并降低成本，本申请首次提出以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由单一的羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L-草铵膦，不需要立体选择性高的羟基酸脱氢酶，并且实现了辅酶的自循环，无需额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料就可完成2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸到L-草铵膦的催化合成。具体反应原理如下：
工业生产得到的L-草铵膦前体2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为L和D型外消旋混合物，二者均可通过氧化脱氢得到L-草铵膦进一步前体2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸PPO，后通过氨基酸脱氢酶还原胺化为L-草铵膦。羟基酸脱氢酶在消耗氧化型辅酶NAD+(或者NADP+)的同时、可将对应L或D构型原料2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸氧化为中间产物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，氧化型辅酶NAD+(或者NADP+)反应后转变为还原型辅酶NADH(或者NADPH)，剩余的D型或L型原料可通过消旋酶的消旋作用源源不断转换成酶的立体特异性底物而参与反应。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下实施例和对比例的催化反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。
HPLC分析方法为：色谱柱/AQ-C18；柱温/40℃；流速/1mL/min；检测波长/UV205nm；流动相:50mM(NH4)2HPO4，加入1％的10％四丁基氢氧化铵水溶液，用50％磷酸调pH至3.6，加入8％乙腈。
以柱前衍生化HPLC法测定产品的光学纯度，手性HPLC分析方法为色谱条件：色谱柱/Q S-C18；流动相/50mM乙酸钠溶液：乙腈＝8:0.5；检测波长/338nm；流速/0.85mL/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.03g邻苯二甲醛与0.1N-乙酰-L-半胱氨酸，用400μL乙醇助溶，再加入4mL 0.2mol/硼酸缓冲液(pH 9.8)，振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过4天)。衍生化反应与测定：取100μL样品加入150μL衍生化试剂，混匀后至于25℃保温5min，进样20μL进行分析。
以下实施例和对比例中，无特殊说明的原料、试剂均为市售产品。
以下实施例和对比例中涉及的羟基酸脱氢酶信息见表1。
表1
羟基酸脱氢酶的制备
将来源于Schleiferilactobacillus harbinensis(genbank：WP_027828400.1)、来源于Roseiflexus castenholzii(genbank：WP_012119261.1)、来源于Trueperaradiovictrix(genbank：WP_013177987.1)的羟基酸脱氢酶分别进行核酸序列优化及基因全合成(SEQ ID NO:1-3)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)完成。同时委托生工生物工程(上海)股份有限公司基因全合成CN111019982A中的L-乳酸脱氢酶(SEQ ID NO.4)和D-扁桃酸脱氢酶(NCBI登录号:NC_008497.1)。
采用本领域常规方法将上述合成的羟基酸脱氢酶基因分别连接到载体pET28a质粒，酶切位点NdeI、HindIII。将合成的质粒转染宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有羟基酸脱氢酶基因的工程菌株。
将含有羟基酸脱氢酶基因的工程菌株在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mLLB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1％(v/v)接种量转接至150mL含50μg/mL卡那霉素的新鲜TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，降温至25℃，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，诱导培养16h。培养结束，收集培养液于4℃4000rpm离心20min(离心机：Eppendorf Centrifuge 5810R)，弃上清，收菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
将上述收集到的菌体用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次后按照菌体：缓冲液＝1:10(g/mL)的质量体积比重悬于pH 7.0的磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到羟基酸脱氢酶粗酶液(Enz.1-5)。
LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。在使用前加入50μg/mL卡那霉素。
TB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉18g/L，甘油4mL/L，KH2PO4 2.31g/L、K2HPO4·2H2O 16.43g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。在使用前加入50μg/mL卡那霉素。
以下实施例和对比例中使用的消旋酶为来源于Pseudomonas putida(GenBank:AAC15504.1)的扁桃酸盐消旋酶(mandelate racemase)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司基因全合成扁桃酸盐消旋酶基因SEQ ID NO:5，参照上述羟基酸脱氢酶的制备方法制备扁桃酸盐消旋酶粗酶液。
以下实施例和对比例中使用的氨基酸脱氢酶为专利CN201810291900.4中的SEQID NO:34所示的氨基酸脱氢酶(在本发明序列表中的编号为SEQ ID NO:6)，同样委托生工生物工程(上海)股份有限公司基因全合成氨基酸脱氢酶基因SEQ ID NO:7，参照上述羟基酸脱氢酶的制备方法制备氨基酸脱氢酶粗酶液。
实施例1
本实施例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，具体如下：
将含有质量浓度10.0％的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(550mM)的溶液置于35℃恒温震荡金属浴中，用稀氨水调节溶液pH＝8.5，加入NAD+(0.5mM)，然后依次加入10％(v/v)羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1、10％(v/v)扁桃酸盐消旋酶粗酶液和10％(v/v)谷氨酸脱氢酶粗酶液，开始反应，用氨水控制pH＝8.5，反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为0mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为550mM。L-PPT产率为100％，ee值为99.9％。
对比例1
本对比例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，具体如下：
将含有质量浓度10.0％的2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(550mM)的溶液置于35℃恒温震荡金属浴中，用稀氨水调节溶液pH＝8.5，加入NAD+(0.5mM)，然后依次加入10％(v/v)羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1和10％(v/v)谷氨酸脱氢酶粗酶液，开始反应，用氨水控制pH＝8.5，反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为273mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为277mM。L-PPT产率为50.4％，ee值为99.9％。
实施例1在反应12小时后底物已经完全转化为L-草铵膦，效率显著提高。相比实施例1，对比例1未使用消旋酶，转化率为50.4％，与理论一致。
实施例2
本实施例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，基本同实施例1，区别仅是将羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1换成羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.2，同样在反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为488mM，PPO浓度为0mM。L-PPT浓度为62mM，L-PPT产率为11.3％，ee值为99.9％。
实施例2采用与实施例1相同的反应路线，同样可以制备L-草铵膦，但由于具体羟基酸脱氢酶与实施例1不同，因此在相同反应时长下的L-草铵膦产率存在差异。
实施例3
本实施例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，基本同实施例1，区别仅是将羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1换成羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.3，同样在反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为409mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为141mM。L-PPT产率为25.6％，ee值为99.9％。
实施例3采用与实施例1相同的反应路线，同样可以制备L-草铵膦，但由于具体羟基酸脱氢酶与实施例1不同，因此在相同反应时长下的L-草铵膦产率存在差异。
实施例4
本实施例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，基本同实施例1，区别仅是将羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1换成羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.4，同样在反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为451mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为99mM。L-PPT产率为18.0％，ee值为99.9％。
对比例2
本对比例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，基本同对比例1，区别仅是将羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1换成羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.4，同样在反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为519mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为31mM。L-PPT产率为5.6％，ee值为99.9％。
实施例4采用与实施例1相同的反应路线，同样可以制备L-草铵膦，但由于具体羟基酸脱氢酶与实施例1不同，因此在相同反应时长下的L-草铵膦产率存在差异。对比例2相比实施例4的区别仅是未使用消旋酶，L-PPT产率约为实施例4的33％。
实施例5
本实施例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，基本同实施例1，区别仅是将羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1换成羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.5，同样在反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为303mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为247mM。L-PPT产率为44.9％，ee值为99.9％。
对比例3
本对比例提供一种一锅法制备L-草铵膦的方法，基本同对比例1，区别仅是将羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.1换成羟基酸脱氢酶粗酶液Enz.5，同样在反应12小时，HPLC检测反应液，底物残余浓度为492mM，PPO浓度为0mM，L-PPT浓度为58mM。L-PPT产率为10.5％，ee值为99.9％。
实施例5采用与实施例1相同的反应路线，同样可以制备L-草铵膦，但由于具体羟基酸脱氢酶与实施例1不同，因此在相同反应时长下的L-草铵膦产率存在差异。对比例3相比实施例5的区别仅是未使用消旋酶，L-PPT产率约为实施例5的23％。
以上结果显示，以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经由单一的羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶组成的酶催化体系催化获得产物L-草铵膦，不需要同时含有L-选择性，和D-选择性羟基酸脱氢酶，并且实现了辅酶的自循环，无需要额外的辅酶再生系统以及辅酶再生原料就可完成2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸到L-草铵膦的100％转化。进一步地，通过选定的酶组合物，即核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的羟基酸脱氢酶、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的扁桃酸盐消旋酶和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的氨基酸脱氢酶，可在反应12小时，即将底物全部转化为L-草铵膦，L-草铵膦产率达到100％，反应效率显著提高。
上述实施例只是为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或者修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：以2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为原料，在辅酶和氨基供体存在下，经羟基酸脱氢酶、消旋酶和氨基酸脱氢酶共同催化制备L-草铵膦。
2.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：所述羟基酸脱氢酶为来源于Schleiferilactobacillus harbinensis的2-脱氢泛酸还原酶，其具有NCBI登陆号为WP_027828400.1的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：所述羟基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：所述消旋酶为扁桃酸盐消旋酶，其具有NCBI登陆号为AAC15504.1的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：所述消旋酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：所述氨基酸脱氢酶具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，和/或，编码所述氨基酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQID NO:7所示。
7.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：所述辅酶为NAD+和/或NADP+；
和/或，所述氨基供体为NH4Cl和/或氨水；
和/或，所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液的初始浓度为10～800mM；
和/或，所述辅酶的投料浓度为0.001～1.0mM；
和/或，所述羟基酸脱氢酶粗酶液、消旋酶粗酶液和氨基酸脱氢酶粗酶液的投料体积分别独立地为所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液的投料体积的5％～20％；
和/或，所述氨基供体与所述2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的摩尔比为(1～5):1；
和/或，所述反应的温度为20～40℃；
和/或，所述反应的时间为2～24h；
和/或，所述碱性物质为氨水、三乙胺、三甲胺、N,N-二异丙基乙胺、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于：采用碱性物质调节2-羟基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸溶液的pH值为8～9，然后加入辅酶、选择性地加入NH4Cl、加入羟基酸脱氢酶粗酶液、消旋酶粗酶液和氨基酸脱氢酶粗酶液后反应，反应时使用碱性物质控制pH值为8～9，反应体系中至少含有NH4Cl或氨水。
9.一种羟基酸脱氢酶在制备L-草铵膦中的用途，其特征在于，所述的羟基酸脱氢酶为来源于harbinensis乳杆菌的2-脱氢泛酸还原酶，其具有NCBI登陆号为WP_027828400.1的氨基酸序列。
10.一种酶组合物在L-草铵膦制备中的应用，其特征在于，所述酶组合物包括羟基酸脱氢酶、扁桃酸盐消旋酶和氨基酸脱氢酶，
所述羟基酸脱氢酶具有NCBI登陆号为WP_027828400.1的氨基酸序列，所述扁桃酸盐消旋酶具有NCBI登陆号为AAC15504.1的氨基酸序列，
所述氨基酸脱氢酶具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
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