CN117778462A - 卫星RNA系统表达siRNA的构建方法及应用 - Google Patents

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CN117778462A CN202311809853.5A CN202311809853A CN117778462A CN 117778462 A CN117778462 A CN 117778462A CN 202311809853 A CN202311809853 A CN 202311809853A CN 117778462 A CN117778462 A CN 117778462A
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Abstract

本发明属于RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术领域，主要涉及一种卫星RNA(satellite RNA,satRNA)与其辅助病毒组成的基因沉默系统及其应用。本发明公开了一种表达小干扰RNA的卫星RNA系统：卫星RNA系统包括一种带有长发夹结构的卫星RNA和一种表达少量2b蛋白的黄瓜花叶病毒突变体。卫星RNA为CMV satRNA strain T1和pKN‑sat两株卫星RNA的嵌合体。本发明提供的satRNA系统，能表达有效沉默植物内源性基因的siRNA，为研究植物基因功能提供一种新方法。

Description

卫星RNA系统表达siRNA的构建方法及应用
技术领域
本发明属于RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术领域，主要涉及一种卫星RNA(satellite RNA,satRNA)与其辅助病毒组成的基因沉默系统及其应用。
背景技术
RNAi技术最初发现于秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans,C.elegans)，研究发现在它体内产生一种特殊双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)，这种dsRNA会介导同源RNA降解。
通常这种dsRNA来源生物体外，一般是病毒基因组或是人工合成的基因片段，这些RNA片段进入生物体后，在RNA聚合酶的作用下形成dsRNA，dsRNA被细胞中的核酸内切酶切割成21～24碱基长度，然后与细胞中AGO蛋白家族(argonaute proteins,AGO)相互结合，形成沉默复制复合体(RNA induced silencing complex,RISC)，结合到RISC中的dsRNA可识别对应序列，同时RISC具有核酸酶的功能，会切割对应碱基序列，使对应序列降解，从而使外来的片段无法发挥作用。
近年来，RNAi技术常常应用于生物体基因功能检测，通过使用一些方法，在生物体中表达小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)。常用的表达siRNA的方法有，通过病毒介导的基因沉默(virus interfere gene silence,VIGS)、人工合成微小RNA(microRNA,miRNA)、人工合成siRNA、表达siRNA的转基因植物等等。
VIGS通过构建病毒载体，在载体中只留下供病毒复制、移动的部分，将其余的基因替换为实验所需的目基因片段，然后将病毒接种至生物体，使它在生物体内复制自身基因，同时产生大量目的片段。早在1995年，KUMAGAI等人通过研究烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus,TMV)基因组，将它的基因组构建到PSY表达载体，并增加靶向八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)的序列，由TMV外壳蛋白亚基因组的启动子控制，增加TMV全基因组，然后机械接种至本氏烟，植物叶出现白化表型，说明植物体内的PDS基因被沉默。常见的表达载体还有以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为骨架的表达载体，Hileman等人用VIGS处理罂粟植物，将罂粟的内源性PDS基因的cDNA插入TRV载体的RNA2中，将TRV载体真空渗透至罂粟，植株出现白化表型。VIGS的优势在于可以快速的产生大量siRNA，快速诱导植株产生表型，它的缺点在于诱导表型的时间随机，是一种暂时性的表型诱导方法，并且这种方法不能精确表达出siRNA，产生的siRNA具有随机性，诱导出的表型也存在随机性。
随研究发现植物进行新陈代谢时，会产生一种内源性的小RNA对自身代谢进行调控，这种RNA被称为miRNA。研究人员对其结构进行研究，最终发现miRNA带有标志性的发夹结构，从而设计人工合成miRNA，利用这一工具改变植物表型。Carbonell等人以拟南芥内源性miRNA为基础，将它克隆至含有35S启动子的载体。在miRNA的基础上，增加靶向镁螯合酶基因(Magnesium chelatase gene,CHLI)序列，接种至烟草。由于叶绿素生物合成缺陷和镁螯合酶的损失，出现叶片和子叶的白化表型。同样利用这一特点，也可以直接人工合成miRNA，Cisneros等人设计并合成一种21个碱基miRNA，用于沉默CHLI编码的SULFUR基因。在本氏烟草中瞬时表达miRNA，在上部系统叶中诱导明显黄化表型，说明SULFUR基因表达量下降。由于人工合成miRNA在转录水平上沉默目标基因，所以沉默效率较差，沉默时间较短。为了弥补这一缺点，后续研究设计带有miRNA的载体，转入植物愈伤组织中，得到表达miRNA的转基因植物。虽然转基因植物的性状稳定，但是耗时长、耗费多、性状单一易产生遗产病，若只是用于特定基因的功能研究，耗费巨大。
satRNA是植物中的最小RNA病原体之一，它完全依赖于辅助病毒进行复制、包被和移动。有研究表明，感染带有sat-Y的烟草会出现叶片黄化现象，研究人员发现烟草的叶绿素合成基因编码着与sat-Y序列具有同源性的24个碱基序列，后续实验说明烟草黄化现象是由于satRNA产生了siRNA，沉默了该基因产生的。这一研究说明satRNA中存在特定的区域可以产生siRNA，我们设想找到该区域，在该区域插入特定序列，可以精确表达大量siRNA。而由于satRNA需要依靠辅助病毒进行复制、移动，所以为了让satRNA在植物体内大量复制、移动，本发明选用了黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)与satRNA的组合来作为实验材料进行研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新型的satRNA系统表达siRNA的构建方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种表达siRNA的satRNA系统，satRNA系统包括一种带有长发夹结构的satRNA和一种表达少量2b蛋白的黄瓜花叶病毒突变体。
作为本发明的表达siRNA的satRNA系统的改进：satRNA为：satT1-KN的序列来自NCBI中Nucleotide部分CMV satRNA：pKN-sat(D28559)和CMV satRNA strain T1(DQ785472)，将pKN-sat第56～249位核苷酸替换掉CMV satRNA strain T1第56～181位核苷酸，得到嵌合卫星satT1-KN。将satT1-KN序列第90～109位替换为44个碱基的特定序列。该序列由两部分组成，分别为22碱基靶向PDS的基因序列，并且为了使该序列在satRNA的二级结构上形成长发夹结构，新增22碱基的序列。该段44碱基的序列可形成含有碱基错配的长发夹结构(所形成的二级结构预测图，见图6)。
satRNA系统中的辅助病毒Fny-CMV-2brds(即表达少量2b的CMV突变体)，它包含三种农杆菌，分别为农杆菌C1、F209-2brds、C3。这三种农杆菌中，分别带有载体pCB301-C1、pCB301-FnyRNA2-rds、pCB301-C3。
作为本发明表达siRNA的satRNA系统的进一步改进：构建satRNA的方法为定点突变PCR技术，利用该技术插入靶向植物内源PDS基因的siRNA序列，siRNA序列与PDS基因序列互补，得到突变体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3。将得到的突变体转化农杆菌GV3101，得到农杆菌KN-pds1和农杆菌KN-pds3。将之分别与Fny-CMV-2brds接种至本氏烟和番茄，接种KN-pds3与Fny-CMV-2brds的组别在接种14天后，出现白化表型。其中，插入pCB301-KN-pds3的siRNA序列为
AUUCCAACAUAGACUGAUUGGG。
作为本发明表达siRNA的satRNA系统的进一步改进：含有载体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3的农杆菌KN-pds1、KN-pds3的构建方法，包括以下步骤：
1)、设计引物KN-pds1-F/KN-pds1-R和KN-pds3-F/KN-pds3-R，通过定点突变PCR克隆技术，以pCB301-T1-KN为模板，得到突变载体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3；
2)、将satKN-pds1和satKN-pds3中siRNA序列的第10～12位的碱基突变为互补碱基，即根据预测的二级结构将该位点的碱基互换，得到两个突变载体pCB301-KN-mpds1和pCB301-KN-mpds3，使之产生没有作用的siRNA；
3)、通过DpnⅠ酶除去模板，凝胶电泳确定载体大小，转化大肠杆菌，提取载体。经测序后，确定突变体载体序列准确无误后，将载体转化农杆菌GV3101，得到农杆菌KN-pds1、KN-pds3、KN-mpds1、KN-mpds3；
4)、将农杆菌KN-pds1、KN-pds3、KN-mpds1、KN-mpds3分别与混合农杆菌Fny-CMV-2brds接种至本氏烟的第4片叶子和第5片叶子，另将空载体pCB301与混合农杆菌Fny-CMV-2brds混合接种本氏烟，作为阴性对照；
5)、接种KN-pds3与Fny-CMV-2brds 14天后，烟草出现白化表型，而其余对照组均无此症状，由此可推断PDS基因被沉默。
作为本发明表达siRNA的satRNA系统的进一步改进：与satRNA突变体共注射的混合农杆菌Fny-CMV-2brds，具体构建方法如下：
1)、选用载体pCB301-C1、pCB301-C2、pCB301-C3，其来自文献HeterologousReplicase from Cucumoviruses can Replicate Viral RNAs,but is Defective inTranscribing Subgenomic RNA4A or Facilitating Viral Movement，文中有说明带有这三个载体的农杆菌的侵染性克隆为C1、C2、C3；
2)、通过定点突变PCR技术，以pCB301-C2载体为骨架，在表达2b蛋白的开放阅读框后增加24个碱基的随机序列，添加的随机序列具体为GAGAGTGTGAGATACACGTGACGG，得到载体pCB301-FnyRNA2-rds，将该载体转化农杆菌GV3101，得到减少2b蛋白表达量的菌株F209-2brds；
3)、将农杆菌C1、F209-2brds、C3，按照1:1:1比例混合，得到减少2b蛋白表达量的混合农杆菌Fny-CMV-2brds。
作为本发明表达siRNA的satRNA系统的进一步改进：构建突变体satKN-pds1、satKN-pds3、satKN-mpds1、satKN-mpds3的模板pCB301-T1-KN的来源如下：
satT1-KN的序列来源在前文中satRNA的主要特征中有说明。将satT1-KN序列送至金丝瑞生物技术有限公司合成，将satT1-KN的cDNA片段克隆至pCB301双元载体，得到重组质粒pCB301-T1-KN。
本发明还提供沉默植物内源性基因PDS的satRNA，satRNA包括satKN-pds3；
satKN-pds3：satT1-KN的序列第90～109位由AUGGUGGUGACAGCCCACCU替换为AUUCCAACAUAGACUGAUUGGGCAGAAAUCACUCUAUCUUGGAU。
说明：本发明中KN-mpds1和KN-mpds3仅为对照作用，插入的序列不能发挥作用。而实例9和实例10都说明KN-pds1不能使烟草出现白化表型。
本发明中提供的satRNA表达siRNA的系统，主要由satRNA和Fny-CMV-2brds组成。
其中，satRNA的具体特征是，以pCB301表达载体为骨架，由花椰菜花斑病毒35S启动子驱动，含有satT1-KN序列，并且将90～109位核苷酸替换为靶向植物PDS基因的siRNA序列的satRNA表达载体。
而Fny-CMV-2brds中含有农杆菌C1、F209-2brds、C3。
其中，农杆菌C1、C3来自文献Heterologous Replicase from Cucumoviruses canReplicate Viral RNAs,but is Defective in Transcribing Subgenomic RNA4A orFacilitating Viral Movement。该文献中提到的pCB301-C1、pCB301-C2、pCB301-C3载体可以组成野生型Fny-CMV侵染性克隆C1、C2、C3。
而农杆菌F209-2brds的构建，由实施例8中可知，是以载体pCB301-C2为模板，通过突变PCR技术，2b蛋白的开放阅读框后增加一段24碱基的序列，该序列与CMV基因组没有任何同源性的序列，得到突变体pCB301-FnyRNA2-rds，转化农杆菌，得到F209-2brds。
根据实施例3可知，将C1、C2、C3农杆菌按照1:1:1的比例和浓度混合，得到带有CMV基因组的混合农杆菌Fny-CMV，将该农杆菌与转化带有satRNA载体的农杆菌按照1：1的比例混合，接种本氏烟。
同理，根据实施例8可知，将C1、F209-2brds、C3按照等比例混合，可得到Fny-CMV-2brds农杆菌混合物。
本发明涉及用于农杆菌浸润侵染的植物是生长期在四至五叶期的本氏烟以及长出第一片真叶的番茄合作903。
本发明的实验作物于22℃，光照时长16h黑暗8h植物生长室培养观察。
本发明提供一种satRNA系统，表达有效沉默植物内源性基因的siRNA，为研究植物基因功能提供一种新方法。
本发明提供的satRNA表达siRNA的技术方案，具体如下：
1、如实施例1所述，采用定点突变PCR的技术，以载体pCB301-T1-KN为模板，在satT1-KN序列第56～249位上，进行结构改造。如图2所示，经RNA2Drawer软件绘图，得到4个satRNA突变体satKNCL、satKN+5bp、satKNls1和satKNcR2，该图仅展示突变位点的二级结构预测图。
2、如实施例2、4所述，将突变体pCB301-KNCL、pCB301-KN+5bp、pCB301-KNls1和pCB301-KNcR2转化农杆菌，在28℃恒温摇床下培养扩增，然后将之与混合农杆菌Fny-CMV接种本氏烟。在温度为22℃，日照时长16h的植物恒温培养室培养，分别采摘3天接种叶与6天的系统叶，提取总RNA。采用Northern blot检测样品RNA中突变体satRNA积累量。根据图3得到结果，组别KN+5bp突变体satRNA积累量与阴性对照T1-KN几乎无差别。
3、如实施例5所述，在satKN+5bp二级结构基础上，进行后续改造。利用定点突变PCR技术，以pCB301-T1-KN为模板，在satRNA的第97～103位增加长发夹结构以产生siRNA，得到突变体pCB301-KNls2，satKNls2的二级结构图，如图4所示。
4、如实施例5、6所述，将pCB301-KNls2转化农杆菌GV3101，得到农杆菌KNls2。将之与混合农杆菌Fny-CMV接种本氏烟，采摘3天接种叶与6天系统叶，Northern blot检测satRNA积累量，根据图5结果发现并无太大差别。杂交检测siRNA，即satRNA改造位点产生的特异性siRNA序列，根据图6结果，发现该位点产生大量siRNA。
5、如实施例7所述，基于之前的实验结果，引入植物的内源性基因PDS序列，选取PDS基因上的互补序列为siRNA，设计引物，进行定点突变PCR，以pCB301-T1-KN为模板，得到突变体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3。
6、如实施例8、9、10所述，将突变体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3转化农杆菌GV3101，得到农杆菌KN-pds1和KN-pds3。将之与混合农杆菌Fny-CMV-2brds接种本氏烟和番茄。在接种14天后，发现植株出现白化表型，说明PDS基因被沉默。拍摄记录表型，采摘接种14天系统叶，Northern blot检测satRNA积累量，根据图10、图12结果发现satRNA之间的积累无太大区别。
本发明解决的技术问题是确定satRNA能大量产生siRNA的特异性位点，并对其进行结构改造，在特定结构上插入序列，使插入序列能够精确表达出沉默植物内源性的PDS基因的siRNA。
本发明基于确定satRNA的二级结构区域可以精确产生siRNA，利用定点突变克隆技术，将靶向PDS基因的siRNA插入satRNA的特定位点，产生切割PDS的siRNA，沉默植物内源的PDS基因，使植物出现白化表型，实施例9应用于本氏烟，实施例10应用于番茄。
本发明所具有的技术优势是通过向植物接种satRNA与Fny-CMV-2b-rds，在satRNA的特异位点精确产生大量siRNA，沉默植物体内的PDS基因，在短时间内改变植株性状。具体而言，根据实施例6的实验结果，发现使用satRNA表达siRNA，产生的特异性siRNA的丰度高，并且证明该改造位点可以精确产生siRNA。实施例9证明在该位点插入PDS基因可以引起植物白化，改变植株性状，且相较于转基因植物时间短。根据实施例10证明，该方法是一种新型研究植物基因功能的方法且应用范围广。
综上，本发明提供一种新型基因沉默系统，该系统主要包括CMV的satRNA及其辅助病毒。通过在satRNA的特定部位的二级结构上，增加长发夹结构，使之能够表达siRNA。将插入序列更换为植物功能基因后，导入农杆菌介导的侵染性克隆，该系统可应用于烟草和番茄中，沉默特定的功能基因。本发明可以精确表达插入序列产生的siRNA，快速使植物出现表型，是一种研究植物功能基因的新型手段。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为pCB301-T1-KN载体图谱。
图2为本发明实施例1中satT1-KN通过RNA2Drawer软件绘制的第56～249位序列的二级结构预测图以及在satT1-KN特异性位点改造的突变体satKNCL、satKN+5bp、satKNsl、satKNcR2的二级结构预测示意图，该图仅展示satRNA第56～249位序列的二级结构示意图。
图3为本发明实施例3中农杆菌KNCL、KN+5bp、KNsl、KNcR2与野生型Fny-CMV接种本氏烟3天接种叶和6天系统叶中satRNA积累量的Northern blot图；
图3中，上图为Northern blot结果图；下图为RNA样品经过甲醛琼脂糖凝胶电泳，65V 50min后在紫外下的照片图，图中截取的条带为28s和18s rRNA。
图4为本发明实施例5中基于实施例4的结果，根据satKN+5bp的二级预测结构，以satT1-KN为模板，改造satRNA突变体KNls2的二级结构预测示意图，该图二级结构仅为突变位点的预测结构。
图5为本发明实例5中农杆菌KNls2与Fny-CMV接种烟本氏烟3天接种叶和6天系统叶中satRNA积累量的Northern blot图；
图5中，上图为Northern blot结果图；下图为RNA样品经过甲醛琼脂糖凝胶电泳，65V 50min后在紫外下的照片图，图中截取的条带为28s和18s rRNA。
图6为本发明实例6中农杆菌KNls2与Fny-CMV接种本氏烟6天系统叶中改造区域产生siRNA的Northern blot图；
图6中，上图为Northern blot结果图；下图为RNA样品经过甲醛琼脂糖凝胶电泳，65V 50min后在紫外下的照片图，图中截取的条带为28s和18s rRNA。
图7为本发明实例7中，RNA2Drawer软件绘制satT1-KN第56～249位序列的二级结构和突变体satKN-pds1、satKN-mpds1、satKN-pds3和satKN-mpds3的二级结构预测示意图，该图二级结构仅为突变位点的预测结构。
图8为本发明实例8中Fny-CMV-2brds、Fny-CMV分别接种本氏烟6天和14天的表型图。接种Fny-CMV-2brds的本氏烟表型相较于Fny-CMV明显减弱。
图9为本发明实例9中农杆菌KN-pds1、KN-pds3分别与Fny-CMV-2brds接种本氏烟14天表型图。实验组KN-pds3顶部系统叶出现白化表型，而对照组均无白化表型。其中对照组Mock接种浸润buffer，组别Vetor接种农杆菌带有空载体pCB301和Fny-CMV-2brds，组别T1-KN接种农杆菌T1-KN和Fny-CMV-2brds，组别KN-mpds1和KN-mpds3分别与Fny-CMV-2brds接种本氏烟。
图10为本发明实例9中对应实验组与对照组接种14天的系统叶中satRNA积累的Northern blot图；
图10中，上图为Northern blot结果图；下图为RNA样品经过甲醛琼脂糖凝胶电泳，65V 50min后在紫外下的照片图，图中截取的条带为28s和18s rRNA。
图11为本发明实例10中将实例9的结果应用于番茄，即KN-pds1、KN-pds3分别与Fny-CMV-2brds接种番茄14天的表型图，具体的组别说明同图8。
图12为本发明实例10中将实例9的结果应用于番茄，KN-pds1、KN-pds3分别与Fny-CMV-2brds接种番茄14天的系统叶中satRNA积累量的Northern blot图，具体组别说明同图9；
图12中，上图为Northern blot结果图；下图为RNA样品经过甲醛琼脂糖凝胶电泳，65V 50min后在紫外下的照片图，图中截取的条带为28s和18s rRNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实例用于阐述本发明，但本发明保护范围不仅仅包括于此。若未特别指出实例操作均按照常规实验操作条件，材料、试剂等无特殊说明均可以从商业途径获取或自行配置。实例中载体转化、载体提取、Northern blot均可按照试剂盒说明书操作进行。
实施例1、satRNA突变载体pCB301-KNCL、pCB301-KN+5bp、pCB301-KNls1、pCB301-KNcR2的构建
(1)、pCB301-KNCL突变载体的构建
载体pCB301-T1-KN如图1，pCB301-T1-KN的序列如SEQ ID NO:1。其中，satT1-KN序列对应载体序列766～1170位。satT1-KN的序列来自NCBI上CMV satRNA：pKN-sat(D28559)、CMV satRNA strain T1(DQ785472)，将pKN-sat第56～249位序列替换为satT1第56～181位序列得到satT1-KN。将satT1-KN的cDNA序列送至金丝瑞生物技术有限公司合成，并由该公司完成克隆，得到载体pCB301-T1-KN。
通过突变PCR技术，以载体pCB301-T1-KN为模板，采用引物KNcL-F/KNcL-R进行突变PCR扩增，得到PCR产物pCB301-KNCL。
采用的突变PCR引物序列如下：
KNcL-F：5’-CATGTAGTTACCCGGGTTGAGTGACGCATCTCGG-3’
KNcL-R：5’-CCCGGGTAACTACATGGTGGGCTGTCACCACC-3’
突变PCR反应体系如下：
PCR反应程序为：98℃3min，98℃20s，60℃25s，72℃4min，12个循环；46℃2min，72℃10min，获得突变PCR反应产物。
扩增结束后，从突变PCR反应产物中取出5μL样品进行120V 30min琼脂糖凝胶电泳，EB中染色5min，紫外系统下检测得到～5000bp大小的条带。
将剩余的20μL突变PCR反应产物转移至1.5mL离心管中，采用DpnⅠ酶除去反应体系中的模板。
DpnⅠ酶消化体系如下：
37℃水浴过夜，得反应后的PCR产物；
取出2.5μL消化后的PCR产物加入30μL大肠杆菌Top10感受态细胞中，冰上静置30min，加入500μL LB液体培养基，然后放入37℃摇床中培养1h。
在超净台内，取100μL扩大培养后的大肠杆菌，采用涂布棒涂布于含有卡那霉素(浓度为50ng/μL)的平板，37℃培养箱倒置培养12h。
在超净台内，采用无菌白枪头挑取倒置培养12h后所得的单菌落，加入含有卡那霉素浓度为50ng/μL的LB液体培养基12.5mL中，放入37℃摇床扩大培养16h。
参考Axygen mini-prepare载体提取试剂盒操作手册，提取突变载体。将构建的satRNA突变载体pCB301-KNCL送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序确定目的位点是否成功突变，结果发现：按照上文制备所得的突变载体pCB301-KNCL位点已发生突变。
如图2所述，具体为向satT1-KN中插入碱基，使原本序列上不配对的第82位、83位、84位、91位碱基配对，插入碱基为图中标红碱基。
(2)、pCB301-KN+5bp突变载体的构建
依照pCB301-KNCL突变体载体的构建，构建pCB301-KN+5bp突变载体模板、反应体系、PCR程序、操作过程均与之相同，采用引物KN+5bp-F/KN+5bp-R进行突变PCR，引物序列如下：
KN+5bp-F：5’-CGCAGTGACAGCCTGCGCCACCTGTAGTCCGGGT-3’
KN+5bp-R：5’-GGCTGTCACTGCGCCACCATGCAGCTACCC-3’
结果发现：按照上文制备所得的突变载体pCB301-KN+5bp位点已发生突变。
如图2所述，插入序列为标红序列，具体为在satT1-KN第96位碱基和第97位碱基之间插入序列CGCAG，在第103位和第104位碱基之间插入序列CUGCG。
(3)、pCB301-KNls1突变载体的构建
依照pCB301-KNCL突变载体的构建，构建pCB301-KNls1突变载体模板、反应体系、PCR程序、操作过程均与之相同，采用引物KNLS1-F/KNLS1-R行突变PCR，引物序列如下：
KNLS1-F：5’-TTGTAGTATGCCGGGTTGAGTGACGCATCTCGG-3’
KNLS1-R：5’-CCCGGCATACTACAAGGTGGGCTGTCACCAC-3’
结果发现：按照上文制备所得的突变载体pCB301-KNls1位点已发生突变。
如图2所述，插入序列为标红序列，具体为在satT1-KN序列中第108位和第109位，插入1位碱基U，使它不能配对形成突起。在第114位和第115位，插入3位碱基AUG，使之不能形成配对而形成茎环结构。
(4)、pCB301-KNcR2突变载体的构建
依照pCB301-KNCL突变载体的构建，构建pCB301-KNcR2突变载体模板、反应体系、PCR程序、操作过程均与之相同，采用引物KNcR2-F/KNcR2-R行突变PCR，引物序列如下：
KNcR2-F：5’-CTCTGCTTCTAACGAAGCCGACGATCTTCTCACTTTTTCAGCTCTGCGCATTTCA-3’
KNcR2-R：5’-GCTTCGTTAGAAGCAGAGACGAAGGTCTCACTCCCACCATCGTGGGC-3’
结果发现：按照上文制备所得的突变载体pCB301-KNcR2位点已发生突变。
如图2所述，具体为satT1-KN序列中的第192～198位由UACCUCC替换为GUGAGACCUUCGUCUCUGCUUC；第203～210位由GGAGGCUA替换为GAAGCCGACGAUCUUCUCAC。其中，替换序列为标红序列。
实施例2、构建pCB301-KNCL、pCB301-KN+5bp、pCB301-KNls1、pCB301-KNcR2载体的农杆菌侵染性克隆
(1)、活化
测序过后，将实施例1所得的确定成功突变的pCB301-KNCL、pCB301-KN+5bp、pCB301-KNls1、pCB301-KNcR2突变载体、模板pCB301-T1-KN以及空载体pCB301分别进行如下操作：取突变载体2.5μL加入30μL农杆菌GV3101感受态细胞中，冰上静置20min，液氮冷冻1min，42℃热激1min，冰上冷却2min后，加入400μL LB液体培养基，28℃摇床中扩大培养4h。
6000rpm离心3min，其中上清液为LB液体培养基，沉淀为农杆菌，收集农杆菌。在超净台中，用移液枪吸取300μL LB液体培养基，弃去。更换枪头，吹打剩余的100μL LB液体培养基，使农杆菌悬浮于溶液。
用涂布棒将农杆菌悬浮液，涂布于含有卡那霉素、庆大霉素和利福平三种抗生素(三者的浓度分别为50ng/μL、50ng/μL、50ng/μL)的LB固体培养基，28℃培养箱中倒置培养2d。
待长出单菌落后，挑取单菌落至含有卡那霉素、庆大霉素和利福平三种抗生素的LB液体培养基中扩大培养16h。
(2)、按照上述步骤一所述，同时将与Fny-CMV相关的克隆载体在-80℃保存的农杆菌C1、C2、C3进行同样的活化操作，这几个农杆菌分别带有载体pCB301-C1、pCB301-C2和pCB301-C3。
说明：上述农杆菌的相应内容在文献Heterologous Replicase fromCucumoviruses can Replicate Viral RNAs,but is Defective in TranscribingSubgenomic RNA4A or Facilitating Viral Movement中有告知。
(3)、分别取150μL步骤一所得的农杆菌KNCL、KN+5bp、KNls1、KNcR2活化菌液以及步骤二所得的Fny-CMV相关的农杆菌C1、C2、C3活化菌液，加入含有卡那霉素和利福平(两者的浓度分别为50ng/μL、50ng/μL)的LB液体培养基6ml中，并同时加入无菌的1.5μL 0.2mol/L乙酰丁香酮和300μL 0.5mol/L MES(吗啉乙磺酸)缓冲液，28℃扩大培养16h，6000rpm/min离心3min收集菌体，分光光度计测定菌体吸光度，使用浸润buffer调节农杆菌的浓度，使菌液在OD600的值为0.5。
浸润buffer的具体配方为10mL 0.5mol/L MES，2.5mL 2mol/L MgCl2，0.2mol/L乙酰丁香酮500μL，双蒸水定容至500mL。
0.5mol/L MES缓冲液的具体配方为将5.33g吗啉乙磺酸(MES)溶入40mL双蒸水中，使用2mol/L NaOH调节pH至5.6，定容至50mL。
综上，相应获得相同浓度的农杆菌pCB301、T1-KN、KNCL、KN+5bp、KNls1、KNcR2以及农杆菌C1、C2、C3的活化菌液。
实施例3、satRNA突变体与Fny-CMV农杆菌浸润侵染本氏烟
组别Mock向本氏烟注射浸润buffer，组别Vetor向本氏烟注射Fny-CMV和pCB301作为阴性对照，组别T1-KN向本氏烟注射T1-KN和Fny-CMV作为阳性对照，组别KNCL、KN+5bp、KNls1、KNcR2分别为KNCL、KN+5bp、KNls1、KNcR2与Fny-CMV接种本氏烟为实验组。
其中，Fny-CMV农杆菌，即带有载体pCB301-C1、pCB301-C2和pCB301-C3的农杆菌C1、C2、C3的混合物，混合比例为1:1:1，使其能够组成CMV。
将Fny-CMV农杆菌混合活化菌液与pCB301、T1-KN、KNCL、KN+5bp、KNls1、KNcR的活化菌液，1:1混合均匀，放至避光处孵育3～4h。
挑选四至五叶期的本氏烟，将其第四片叶子用注射器的针头穿透。用1mL无针头注射器将孵育后的菌液接种至叶片，实验组和对照组接种的叶片的叶位需保持一致，所有接种植物置于22℃，光照时长16h，黑暗8h植物生长室培养。
实施例4、本氏烟总RNA提取及Northern blot检测
(1)、提取样品总RNA
分别采摘实施例3所得的实验组KNCL、KN+5bp、KNls1、KNcR与对照组Mock、Vetor、T1-KN相同叶位的3天接种叶和接种6天系统叶。
称取0.1g叶片，将叶片置于带有2颗小钢珠的2mL离心管中，并将其置于液氮。
将2mL离心管置于研磨机中，使样品粉碎充分后，向其中加入1mL RNA提取液(1.66mL 3mol/L pH5.2醋酸钠，2mL 0.5mol/L pH8.0 EDTA，10mL 10％ SDS，86mL ddH2O)。
使之充分混匀后，将离心管置于冰上静置5min。
将样品更换至无RNA酶的离心管(2mL)中，向离心管中加入1mL水饱和酚溶液，冰上静置5min，置于涡旋仪上剧烈震荡3min。
4℃12000rpm离心6min，离心结束后取800μL上清液，加入540μL水饱和酚/氯仿(1:1)混合溶液，涡旋剧烈震荡3min。
4℃12000rpm离心6min后，取400μL上清，并加入1.2mL无水乙醇和40μL 3mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，混合均匀后置于-20℃冰箱沉降2h。
4℃12000rpm离心10min，弃去上清加入500μL 70％乙醇(用DEPC水配制乙醇)洗涤沉淀，涡旋震荡沉淀，待沉淀悬浮于溶液中后，4℃12000rpm离心10min，弃去上清，晾干沉淀。
根据样品情况加入DEPC水溶解沉淀，系统叶使用50μL，接种叶使用30μL。用微量分光光度计在260nm测定RNA样品的浓度和纯度。
(2)、Northern blot检测样品总RNA中satRNA的含量
根据步骤(1)所得的RNA样品的浓度，将RNA样品的浓度调为1000μg/mL。
向PCR管中加入10μL RNA loading(甲酰胺500μL，甲醛175μL，5×Mops 100μL，EB20μL，饱和溴酚蓝30μL)和1μL RNA样品，确保不同样品之间的总RNA含量一致，混合均匀后，65℃变性10min。
冰上放置3min，进行甲醛琼脂糖凝胶电泳。65V电泳50min，在紫外灯下观察RNA条带，若条带清晰且无降解情况，则继续65V电泳70min。
Northern blot转膜和杂交方法参考地高辛标记检测试剂盒II(Roche,Switzerland)的产品使用说明书。
杂交探针为互补于satT1的5’端核苷酸，由上海生物工程有限公司合成。具体序列如下：
5’-AGTGACAGATCCTCACGCAGATACAACCCCTCTGCGC-DIG-3’。
所得结果如图3中左图所述，可获得以下结论：根据接种3天接种叶中satRNA的积累量，确认satRNA突变体的复制情况，组别KN+5bp的积累量与对照组T1-KN的积累量几乎无差别，而组别KNCL和组别KNls1的积累量都略低于对照组T1-KN，说明这两种结构改造会影响satRNA在植物体内正常复制积累。
如图3中右图所述，在接种6天的系统叶中，未检测到组别KNCL有satRNA积累，说明KNCL的结构改造不稳定或无法系统性移动到系统叶，组别KNcR2的结构改造与对照组T1-KN相比积累量减少，从而说明该种结构改造会对satRNA的积累产生影响。而组别KN+5bp的积累与对照组T1-KN相比无太大区别，说明该改造方式对satRNA的积累影响最小，选择satKN+5bp的二级结构进行后续实验改造。
实施例5、构建可产生siRNA的突变载体pCB301-KNls2及Northern blot检测其积累量
(1)、pCB301-KNls2突变载体的构建
为了使satRNA能产生siRNA，在实施例4结果的基础上按照satKN+5bp的结构延长satKN+5bp原本的长发夹结构。
依照实施例1中pCB301-KNCL突变载体的构建方法，以载体pCB301-T1-KN为模板，构建pCB301-KNls2突变体，载体模板、反应体系、PCR程序均与之相同(即，参照实施例1)，采用引物KNls2-F/KNls2-R行突变PCR，得到satRNA突变载体pCB301-KNls2。引物KNls2-F/KNls2-R序列如下：
KNls2-F：5’-CATGTCTGACAGCGATATCCTCTCCCCACCTGTAGTCCGGGTTG-3’
KNls2-R：5’-GATATCGCTGTCAGACATGCTCTCGCCACC ATGCAGCTACCCAG-3’
结果发现：按照上文制备所得的突变体载体pCB301-KNls2载体的位点已发生突变。
如图4所述，具体为：在satT1-KN序列的第96和97位之间，插入序列CGAGAGCAUGUCUGA；在satT1-KN序列的第103和104位之间，插入序列AGCGAUAUCCUCUCC。
将突变体pCB301-KNls2载体，按照实施例2的方法构建农杆菌介导的侵染性克隆，得到农杆菌KNls2。
参照实施例3的方法，将农杆菌KNls2与Fny-CMV农杆菌混合侵染本氏烟作为实验组KNls2。对照组Mock向本氏烟注射浸润buffer，组别Vetor向本氏烟注射Fny-CMV和pCB301作为阴性对照，组别T1-KN向本氏烟中注射T1-KN和Fny-CMV作为阳性对照。
按照实施例4的方法测定satRNA积累量的方法，测定注射satKNls2后本氏烟的3天接种叶和6天系统叶中satRNA的积累量。
上文中satKNls2在植物体内的积累量的结果如图5所述，可获得以下总结性结论：实验组satKNls2的3天接种叶与对照组satT1-KN相比，积累量减少，但是减少较小。而在6天系统叶中，这两个组别的satRNA积累量相差不大。说明组别KNls2改造位点的长发夹结构对于satRNA的复制没有造成很大的影响，证明该改造方案可行。
实施例6、satKNls2长发夹结构区域siRNA Northern blot检测
配置15％8mol/L尿素-page胶(7.2g尿素，1.5mL 10×TBE，5.6mL 40％Acrylamide(Acr:Bis＝19:1)，加ddH2O定容到15mL，加入75μL 10％ APS，15μL TEMED)，混匀后将胶倒入模具，插上梳子，室温放置30-60min等待胶凝固。
将胶放在电泳装置上后往里面倒入0.5×TBE电泳缓冲液，100V预电泳30min。
用注射器吸取0.5×TBE缓冲液清洗上样孔，将RNA与RNA loading，按照1：1的比例混匀，加入上样孔，RNA的上样量为15μL。使用的RNA，来自实施例5中组别KNls2以及对照组satT1-KN、Mock。
100V电泳130min左右待溴酚蓝条带跑到胶的底部时，停止电泳。
分别在胶和膜的右上角做上记号，把胶放在含有EB的0.5×TBE缓冲液中浸泡10min，用紫外灯照射膜观察RNA电泳的情况，若RNA无降解且上样量均一，则拍摄并保存图片。
利用半干法电转膜仪进行转膜，100mA转膜1h，转完膜后把膜正面朝上放到UPV紫外交联仪上，能量参数设置为1200，交联两次。
将设好的oligo DNA探针按DIG Oligonucleotide Tailing Kit探针标记试剂盒的说明书进行标记。
杂交探针为互补与改造长发夹结构的序列，序列如下：
5’-GACATGCTCTCGCCACCATGCAGCT-DIG-3’
5’-GGACTACAGGTGGGGAGAGGATATC-DIG-3’
Northern bolt具体操作同实施例4，探针结合温度和洗探针温度改为37℃。
siRNA杂交结果如图6所述，可得知以下结论：实验结果检测发现在KNls2的长发夹结构上产生了大量的siRNA，并且产生的siRNA序列与插入序列相吻合。即，根据在此位点检测到了对应序列的siRNA，判断按照该种改造方式，插入特异性的siRNA序列，同样能产生siRNA。
实施例7、构建沉默植物内源性基因PDS的突变载体pCB301-KN-pds1、pCB301-KN-pds3
(1)、pCB301-KN-pds1、pCB301-KN-pds3突变载体的构建
根据实施例5和实施例6的实验结果，构建可以沉默植物内源性基因PDS的突变载体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3。以载体pCB301-T1-KN为模板，将实例6中产生siRNA的位点序列更换为内源性PDS基因的siRNA序列。
即，KN-pds1和KN-pds3的二级结构是以KNls2为模板改造的，具体情况见图6。
按照实施例1中pCB301-KNCL载体的构建方法，即参考实例1，应用引物KN-pds1-F/KN-pds1-R进行突变PCR，得到突变载体pCB301-KN-pds1。引物KN-pds1-F/KN-pds1-R的序列如下：
KN-pds1-F：5’-CAGTCTTCACTTGACTGCAAAGACATTCCTGTAGTCCGGGTTGAGTG-3’
KN-pds1-R：5’-GCAGTCAAGTGAAGACTGGAAAGAGATTCCATGCAGCTACCCAGG-3’
按照实施例1中pCB301-KNCL载体的构建方法，即参考实例1，应用引物KN-pds3-F/KN-pds3-R进行突变PCR，得到突变载体pCB301-KN-pds3。引物KN-pds3-F/KN-pds3-R的序列如下：
KN-pds3-F：5’-GACTGATTGGGCAGAAATCACTCTATCTTGGATGTAGTCCGGGTTGAGTGAC-3’
KN-pds3-R：5’-GATTTCTGCCCAATCAGTCTATGTTGGAATGCAGCTACCCAGGGAG-3’
(2)、pCB301-KN-mpds1、pCB301-KN-mpds3突变载体的构建
同时，将siRNA pds1和siRNA pds3这两个序列上的第10～12位的碱基突变为互补碱基，即图6中紫色序列，得到两个突变载体pCB301-KN-mpds1和pCB301-KN-mpds3，使这两载体的二级结构与pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3相同，即使它可以产生siRNA但无法作用于PDS基因。
按照实施例1中pCB301-KNCL载体的构建方法应用，即参考实例1，引物KN-mpds1-F/KN-mpds1-R进行突变PCR，得到突变载体pCB301-KN-mpds1。引物KN-mpds1-F/KN-mpds1-R的序列如下：
KN-mpds1-F：5’-CAGTCTTCACTTGACTGCATTCACATTCCTGTAGTCCGGGTTG-3’
KN-mpds1-R：5’-GCAGTCAAGTGAAGACTGGATTCAGATTCCATGCAGCTACCCAG-3’
按照实施例1中pCB301-KNCL载体的构建方法，即参考实例1，应用引物KN-mpds3-F/KN-mpds3-R进行突变PCR，得到突变载体pCB301-KN-mpds3。引物KN-mpds3-F/KN-mpds3-R的序列如下：
KN-mpds3-F：5’-CTGATTGGGCAGAAATCACTGATTCTTGGATGTAGTCCGGGTTG-3’
KN-mpds3-R：5’-TGATTTCTGCCCAATCAGTGATTGTTGGAATGCAGCTACCCAG-3’
上文中satKN-pds1、satKN-pds3、satKN-mpds1和satKN-mpds3的二级结构突变位点结果如图7所述，具体为：satT1-KN的序列第90～109位由AUGGUGGUGACAGCCCACCU替换为AUGGAAUCUCUUUC CAGUCUUCACUUGACUGCAAAGACAUUCCU，得到突变体satKN-pds1。
satT1-KN的序列第90～109位由AUGGUGGUGACAGCCCACCU替换为AUUCCAACAUAGACUGAUUGGGCAGAAAUCACUCUAUCUUGGAU，得到突变体satKN-pds3。
satT1-KN的序列第90～109位由AUGGUGGUGACAGCCCACCU替换为AUGGAAUCU AAAUCCAGUCUUCACUUGACUGCAUUCACAUUCCU，得到突变体satKN-mpds1。
satT1-KN的序列第90～109位由AUGGUGGUGACAGCCCACCU替换为AUUCCAACA CUAACUGAUUGGGCAGAAAUCACUGAUUCUUGGAU，得到突变体satKN-mpds3。
实施例8、Fny-CMV-2brds相关载体的构建及农杆菌介导的侵染性克隆
构建减少2b蛋白表达量的载体pCB301-FnyRNA2-rds，以pCB301-C2为模板，按照实施例1中pCB301-KNCL载体的构建方法应用引物R2-2br-F/R2-2br-R，对模板进行PCR扩增，得到载体pCB301-FnyRNA2-rds，该载体序列如序列表SEQ ID NO：2。
说明：pCB301-FnyRNA2-rds与pCB301-C2的不同之处在于插入24碱基(GAGAGTGTGAGATACACGTGACGG)。
引物R2-2br-F/R2-2br-R的序列如下：
R2-2br-F：5’-GAGAGTGTGAGATACACGTGACGGAACCTCCCCTTCCG-3’
R2-2br-R：5’-GTATCTCACACTCTCTCAGAAAGCACCTTCCPCR-3’
将载体pCB301-FnyRNA2-rds，按照实施例2的方法构建农杆菌的侵染性克隆，得到农杆菌F209-2brds。
将C1、F209-2brds、C3的农杆菌混合(1:1:1混合，即菌量等比)，得到表达少量2b蛋白的混合农杆菌Fny-CMV-2brds。
将Fny-CMV-2brds与野生型Fny-CMV分别接种至本氏烟，接种6天与14天拍摄症状图。
组别Mock向本氏烟接种浸润buffer，组别Fny-CMV向本氏烟接种农杆菌侵染性克隆Fny-CMV，组别Fny-CMV-2brds向本氏烟接种表达少量2b蛋白的Fny-CMV-2brds。
Fny-CMV-2brds侵染性克隆在本氏烟接种6天和14天的表型如图8所述，可获得以下总结性结论：发现接种Fny-CMV-2brds的本氏烟症状明显弱于野生型的Fny-CMV，说明Fny-CMV-2brds的毒力弱于Fny-CMV。
实施例9、satKN-pds1和satKN-pds3在本氏烟上的应用
根据实施例2的方法构建pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3的农杆菌侵染性克隆，得到农杆菌KN-pds1和KN-pds3。
将农杆菌KN-pds1和KN-pds3分别与实施例8构建的Fny-CMV-2brds混合农杆菌，按照实例3的方法接种本氏烟，作为两个不同的实验组。
组别Mock向本氏烟中接种buffer，组别Vetor向本氏烟中接种Fny-CMV-2brds和pCB301，组别T1-KN向本氏烟中接种T1-KN和Fny-CMV-2brds，组别KN-mpds1和KN-mpds3分别向本氏烟中接种KN-mpds1、Fny-CMV-2brds和KN-mpds3、Fny-CMV-2brds，实验组KN-pds1和KN-pds3分别向本氏烟中分别接种KN-pds1、Fny-CMV-2brds和KN-pds3、Fny-CMV-2brds。
在接种本氏烟14天后，观察到KN-pds3组别本氏烟的顶部系统叶出现白化表型，而其余对照组都未出现白化，说明实验组KN-pds3本氏烟中PDS基因被沉默。
拍摄各个组别的症状并采摘顶部系统叶，参照实例4的方法提取样品总RNA量进行Northern blot。
KN-pds1和KN-pds3在烟草上的表型结果如图9所述，satKN-pds1和satKN-pds3在烟草中的积累情况结果如图10所述，因此可获得以下结论：Northern blot结果与表型图相对应，实验组KN-pds3的satRNA的积累量是最高的，表型中白化面积最大。采用KN-pds3与Fny-CMV-2brds这一组合可以有效的沉默植物PDS基因，该组合是一种新型的用于植物基因功能研究的优良工具。
实施例10、satKN-pds1和satKN-pds3在番茄上的应用
根据实施例9的结果，将KN-pds1和KN-pds3的系统推广应用至番茄中。
选择生长期为长出第一片真叶的番茄合作903，按照实施例9的方法，农杆菌浸润侵染番茄。
实例10中的实验组别设置与实例9完全相同，只是更换侵染宿主为番茄，番茄品种为合作903。
注射接种14天后，我们发现组别KN-pds3顶部系统叶出现白化表型，但是白化面积、效果弱于本氏烟，随后按照实例4的方法提取检并测样品中satRNA的积累量，发现各个satRNA在番茄中的积累几乎无差别。
上文中的KN-pds1和KN-pds3在番茄的结果表型如图11所述，上文中的KN-pds1和KN-pds3在番茄内的积累情况结果如图12所述，因此可获得以下结论：KN-pds3与Fny-CMV-2brds这一系统同样可以应用于番茄，成为研究植物基因功能的优良工具。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种表达小干扰RNA的卫星RNA系统，其特征在于：卫星RNA系统包括一种带有长发夹结构的卫星RNA和一种表达少量2b蛋白的黄瓜花叶病毒突变体。
2.根据权利要求1所述的表达小干扰RNA的卫星RNA系统，其特征在于：
卫星RNA为CMV satRNA strain T1和pKN-sat两株卫星RNA的嵌合体；
具体为将pKN-sat第56～249位核苷酸序列替换至CMV satRNA strain T1第56～181位核苷酸序列，获得嵌合卫星satT1-KN；将satT1-KN的cDNA片段克隆至pCB301双元载体，得到重组质粒pCB301-T1-KN；然后，将satT1-KN第90～109位核苷酸序列替换为44碱基组成的外源序列；该外源该序列通过碱基配对形成一个含有碱基错配的发夹结构；
表达少量2b蛋白的黄瓜花叶病毒突变体，该黄瓜花叶病毒来自Fny株系，为表达小干扰RNA系统中的辅助病毒，被命名为Fny-CMV-2brds。
3.根据权利要求2所述的表达小干扰RNA的卫星RNA系统，其特征在于：卫星RNA的辅助病毒Fny-CMV-2brds，由三种农杆菌组成，分别为农杆菌C1、F209-2brds、C3；该三种农杆菌中，分别带有载体pCB301-C1、pCB301-FnyRNA2-rds、pCB301-C3。
4.根据权利要求1～3任一所述的表达小干扰RNA的卫星RNA系统，其特征在于：
构建卫星RNA的方法为定点突变PCR技术，利用该技术插入靶向植物内源PDS基因的小干扰RNA序列，小干扰RNA序列与PDS基因的序列互补，构建获得表达特定小干扰RNA的载体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3；
将构建的载体转化农杆菌GV3101，获得携带相应载体的农杆菌KN-pds1和农杆菌KN-pds3；分别将以上农杆菌与Fny-CMV-2brds共接种至本氏烟和番茄，混合接种KN-pds3和Fny-CMV-2brds的植株表现出明显白化表型。
5.根据权利要求1～4任一所述的表达小干扰RNA的卫星RNA系统，其特征在于：含有载体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3的农杆菌KN-pds1和农杆菌KN-pds3的构建方法，包括以下步骤：
1)、设计引物KN-pds1-F/KN-pds1-R和KN-pds3-F/KN-pds3-R，以pCB301-T1-KN为模板，通过定点突变PCR克隆技术，得到突变卫星RNA载体pCB301-KN-pds1和pCB301-KN-pds3；
2)、将satKN-pds1和satKN-pds3中插入序列的第10～12位碱基突变为互补碱基，即根据预测的二级结构将该位点碱基互换，得到突变卫星RNA载体pCB301-KN-mpds1和pCB301-KN-mpds3，使之可以产生小干扰RNA，但无法沉默PDS基因；
3)、通过DpnⅠ酶除去模板，凝胶电泳确定载体大小，转化入大肠杆菌后，提取载体，将载体转化入农杆菌GV3101；
4)、将农杆菌KN-pds1、KN-pds3、KN-mpds1、KN-mpds3，分别与混合农杆菌Fny-CMV-2brds接种至本氏烟，另将空载体pCB301与混合农杆菌Fny-CMV-2brds混合接种至本氏烟，作为阴性对照；
5)、接种农杆菌KN-pds3和Fny-CMV-2brds的实验组出现明显白化表型，而其余组别均无此表型，由此可推断PDS基因被沉默。
6.根据权利要求5所述的表达小干扰RNA的卫星RNA系统，其特征在于：与卫星RNA载体共接种的混合农杆菌Fny-CMV-2brds，具体构建方法如下：
1)、选用带有侵染性CMV基因组的载体pCB301-C1、pCB301-C2、pCB301-C3，以及带有这些载体的农杆菌C1、C2、C3；
2)、以pCB301-C2载体为模板，通过定点突变PCR技术，应用引物R2-2br-F/R2-2br-R，在表达2b蛋白的开放阅读框后，增加24碱基长度的随机序列，添加的随机序列具体为GAGAGTGTGAGATACACGTGACGG，得到突变体pCB301-FnyRNA2-rds；
3)、将该载体转化入农杆菌GV3101后，得到减少2b表达量的农杆菌F209-2brds；
4)、将农杆菌C1、F209-2brds、C3，按照1:1:1的比例混合，即可得到减少2b蛋白表达量的混合农杆菌Fny-CMV-2brds。
7.沉默植物内源性基因PDS的卫星RNA，其特征在于：卫星RNA包括satKN-pds3；
satKN-pds3：satT1-KN的序列第90～109位由AUGGUGGUGACAGCCCACCU替换为AUUCCAACAUAGACUGAUUGGGCAGAAAUCACUCUAUCUUGGAU。
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