CN117777304A - 呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒及其制备方法和用途。该呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒包括由佐剂蛋白组成的核和位于核表面的抗原,且佐剂蛋白连接有第一连接臂,抗原连接有第二连接臂,或者佐剂蛋白连接有第二连接臂,抗原连接有第一连接臂,第一连接臂与第二连接臂通过肽键等共价键结合。经疫苗抗原性检测发现,本发明制备的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒保留了较好的靶向SARS‑CoV‑2RBD受体(hACE2)的亲和力,同时其能够促使免疫细胞分泌促炎性细胞因子,能够激活体液免疫应答。此外,本发明的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒能够诱导小鼠产生特异性抗体,在预防或治疗由呼吸道相关病毒引起人呼吸道相关疾病中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地涉及呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒及其制备方法和用途。
背景技术
呼吸道病原体主要通过呼吸系统和消化系统感染,具有较高的传染率和致死率,其临床表现从轻微的流感样症状到严重危及生命的重症肺炎。
受到自然界病原体结构和功能的启发,仿病原体颗粒(病毒样颗粒,自组装蛋白颗粒)应运而生,仿病原体颗粒具有同时递送抗原和免疫刺激的功能,可通过提高疫苗抗原的稳定性,促进抗原递呈,增强交叉递呈等方式增加疫苗免疫原性。
仿病原体颗粒一般可以通过基因融合或化学偶联的方式展示外源表位肽。利用基因融合的方式能够保证抗原表位以同样的构象展示在VLP的外表面并且能够实现高密度排列,但是某些抗原的遗传融合导致抗原或衣壳的错误折叠,从而导致产生的抗体无效。化学结合可能无法控制VLP修饰的数量,造成抗原展示不均一。此外,当以巯基作为目标化学修饰基团时,由于许多重要抗原结构内含有二硫键,它们在蛋白质折叠和稳定中起着重要作用,新的半胱氨酸插入可能会影响展示抗原的结构、造成载体的相互交联,从而导致聚集性沉淀。因此需要更简单及稳定的结合方法。
尽管目前我国已有灭活病毒疫苗、腺病毒载体疫苗、亚单位疫苗和mRNA疫苗等上市,但是大都通过肌肉注射方式进行免疫接种。相比而言,吸入免疫具有更好的人群顺应性,而且有望产生高水平的局部黏膜免疫应答及高于或等于传统疫苗接种方式诱导的全身免疫应答水平,是预防呼吸道传播病原体感染的优势免疫途径。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景,不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少技术问题之一,本发明提供一种呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒及其制备方法和用途。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一方面,提供一种呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其包括由佐剂蛋白组成的核和位于所述核表面的抗原,且所述佐剂蛋白连接有第一连接臂,所述抗原连接有第二连接臂,或者所述佐剂蛋白连接有第二连接臂,所述抗原连接有第一连接臂,且所述第一连接臂与所述第二连接臂通过共价如肽键结合。
在某些实施方案中,根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其中,所述佐剂蛋白的序列如SEQ ID No:1所示。
在某些实施方案中,根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其中,所述第一连接臂的序列如SEQ ID No:3所示,和/或所述第二连接臂的序列如SEQ ID No:5所示。
在某些实施方案中,根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其中,所述抗原源自冠状病毒S蛋白的RBD或流感病毒的HA。
在某些实施方案中,根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其中,其粒径在10-50nm。
本发明的第二方面,提供一种呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的制备方法,其包括以下步骤:
(1)获得连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或获得连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原,其中第一连接臂和第二连接臂分别具有活性基团;和
(2)使所述佐剂蛋白与所述抗原以1:(1-5)摩尔比混合于体外缓冲液如PBS或Tris缓冲液,通过活性基团之间的反应从而使所述佐剂蛋白和所述抗原共价连接。
在某些实施方案中,根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的制备方法,其中,所述连接第一连接臂的佐剂蛋白和所述连接第二连接臂的抗原,或所述连接第一连接臂的抗原和所述连接第二连接臂的佐剂蛋白通过双表达系统表达,且所述连接第二连接臂的抗原或连接第一连接臂的抗原需通过真核表达系统制备,和所述活性基团包括氨基、羧基和/或硫醇基团。
本发明的第三方面,提供根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒在制备疫苗中的用途。
本发明的第四方面,提供一种体外激活免疫细胞的方法,其包括使根据本发明所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒与所述免疫细胞接触的步骤。
在某些实施方案中,根据本发明所述的体外激活免疫细胞的方法,其中,所述免疫细胞包括树突状细胞或巨噬细胞。
本发明的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒具有显著提高的稳定性、安全性和免疫原性,能够应对不同突变株的流行。经疫苗抗原性检测发现,本发明制备的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒保留了较好的靶向SARS-CoV-2RBD特异性受体ACE2的亲和力。同时本发明进一步对其激活免疫细胞的能力进行了研究,结果发现其能够促使免疫细胞分泌促炎性细胞因子,有效激活体液免疫应答。此外,通过免疫小鼠后发现,本发明的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒能够诱导小鼠产生特异性抗体,在预防或治疗由新型冠状病毒或流感病毒引起人呼吸道相关疾病中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为纳米蛋白疫苗R-CNP的制备结果图。其中,A:疫苗制备示意图;B:RBD单体、未偶联空载纳米颗粒和RBD偶联纳米颗粒在还原剂下SDS-PAGE结果图;C:Western-blot结果图。
图2为R-CNP纳米疫苗的表征。其中,A:透射电镜检测结果;B:动态光散射检测结果。
图3为SPR动力学检测RBD和R-CNP与ACE2的结合能力。其中各图中曲线从上到下依次为:50nm、25nm、12.5nm、5.25nm、3.125nm。
图4示出了BMDCs的活化水平。
图5示出了巨噬细胞的活化水平。
图6示出了APCs释放促炎性细胞因子水平。
图7示出了免疫小鼠的血清抗体滴度。
图8为ST-HA单体、未偶联空载纳米颗粒和HA偶联纳米颗粒在还原剂下SDS-PAGE结果图。
图9为流感疫苗HA-CNP免疫小鼠的血清抗体滴度。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。除非另有说明,否则“%”为基于重量的百分数。
呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒
本发明的第一方面,提供一种呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其为核壳结构,包括由佐剂蛋白组成的核结构和位于所述核表面的抗原(即壳结构),且所述佐剂蛋白连接有第一连接臂,所述抗原连接有第二连接臂,且所述第一连接臂与所述第二连接臂通过肽键共价结合。在某些实施方案中,所述佐剂蛋白连接有第二连接臂,所述抗原连接有第一连接臂,且所述第一连接臂与所述第二连接臂通过肽键共价结合。
本发明的佐剂蛋白只要具备免疫佐剂功能,则不特别限定其结构或序列。优选地,佐剂蛋白具有能够使佐剂蛋白单体聚集的基团或序列,从而能够使多个蛋白相互聚集得到聚集体,如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或更多单体的聚集体,进而得到颗粒的核心结构。能够使佐剂蛋白单体聚集的基团不特别限定,优选地,基团之间能够形成非共价键结合的基团。非共价连接方式的实例包括但不限于氢键、范德华力、离子键(盐键,指水相中相反电荷的吸引)或疏水键。能够使佐剂蛋白单体聚集的序列不特别限定。示例性的序列如SEQID No:2所示(RLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELAR)。优选地,能够使佐剂蛋白单体聚集的基团或序列位于佐剂蛋白C端。
本发明中,第一连接臂和第二连接臂的组成不特别限定,可以是任意柔性连接臂,且具有体外条件下能够形成共价键的活性基团。第一连接臂和第二连接臂可以是由多个氨基酸组成的序列,优选地至少一个氨基酸为活性氨基酸或修饰后具有反应活性基团的氨基酸。此类活性基团的实例包括但不限于氨基、羧基、巯基等。
在某些实施方案中,第一连接臂与佐剂蛋白或抗原形成共价连接,例如形成融合蛋白。第一连接臂与佐剂蛋白或抗原的连接顺序不特别限定,例如可以是自N端到C端为第一连接臂-佐剂蛋白或抗原,或佐剂蛋白或抗原-第一连接臂。此处,“-”表示共价键或间隔连接子(本文有时也称为“linker”)。连接子不特别限定,可以采用本领域已知的连接子。连接子的实例包括但不限于GSGTAGGGSGS或GGSG。
在某些实施方案中,所述佐剂蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示(TPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELAR)。
在某些实施方案中,所述第一连接臂的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示(AHIVMVDAYKPTK)。
在某些实施方案中,本发明的抗原为呼吸道传播病原体抗原,其实例包括但不限于急性呼吸道相关病毒,如流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、呼吸道牛痘病毒、副流感病毒、呼吸道腺病毒、严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)或人偏肺病毒(HMPV)的感染。
本某些实施方案中,位于所述核表面的抗原源自冠状病毒S蛋白(刺突蛋白)的RBD,术语“RBD(受体结合结构域)”是指S蛋白与ACE2相联结或结合的区域。术语“刺突蛋白”是指位于新冠病毒最外层的三聚体结构的蛋白,也称为刺突糖蛋白或S蛋白。冠状病毒包括但不限于2019新型冠状病毒(2019-nCoV)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及它们的突变体。
在某些实施方案中,本发明的抗原氨基酸序列如SEQ ID No:4所示(RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTN)。本发明的抗原氨基酸序列选自冠状病毒S蛋白的RBD的部分序列,本发明人发现,该抗原制备的融合蛋白用于呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒具有优异的靶向和结合性能以及免疫效果。
在某些实施方案中,本发明的抗原源自于流感病毒,所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒,甲型流感病毒的实例包括H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H7N9等。
在某些实施方案中,本发明的抗原氨基酸序列如SEQ ID No:10所示(GIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNA)。
本发明中,与所述抗原或佐剂蛋白连接有第二连接臂。第二连接臂与抗原或佐剂蛋白形成共价连接,例如形成融合蛋白。第二连接臂与抗原或佐剂蛋白的连接顺序不特别限定,例如可以是自N端到C端为第二连接臂-抗原或佐剂蛋白,或抗原或佐剂蛋白-第二连接臂。此处,“-”表示共价键或间隔连接子(本文有时也称为“linker”)。连接子不特别限定,可以采用本领域已知的连接子。连接子的实例包括但不限于GSGTAGGGSGS或GGSG、GGSGS等。
在某些实施方案中,所述第二连接臂的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示(GAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI)。
在某些实施方案中,本发明的抗原连接第一连接臂(本文有时简称为“ST-HA”)的序列如SEQ ID NO:11所示:AHIVMVDAYKPTKGSGTAGGGSGSGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNAGGSG。
在某些实施方案中,编码本发明的ST-HA序列如SEQ ID NO:12所示:GCCCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGAAGCGGAACAGCCGGAGGAGGAAGCGGATCAGGAATTGCCCCTCTGCAGCTGGGCAAGTGTAACATCGCCGGTTGGCTCCTGGGAAATCCCGAGTGCGATCCTCTGCTGCCAGTGCGGTCTTGGAGCTACATCGTGGAGACCCCCAACAGCGAGAACGGCATTTGCTACCCCGGCGACTTCATCGACTACGAGGAACTGAGGGAGCAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGCGCTTCGAGATCTTCCCCAAGGAGAGCTCTTGGCCCAACCACAACACCAACGGCGTGACAGCCGCTTGTAGCCACGAAGGCAAGAGCAGCTTCTACCGGAACCTCCTCTGGCTGACCGAGAAAGAGGGCAGCTACCCCAAGCTGAAGAACAGCTACGTGAACAAGAAGGGCAAGGAGGTGCTCGTCCTCTGGGGAATTCACCACCCTCCCAACAGCAAGGAGCAGCAGAACCTGTACCAGAACGAGAACGCCTACGTGTCCGTGGTGACCAGCAACTACAACCGGAGGTTCACCCCCGAGATCGCCGAGAGACCCAAAGTGCGAGACCAGGCCGGCCGGATGAACTACTATTGGACCCTGCTGAAGCCCGGCGACACCATCATCTTCGAAGCCAACGGCAACCTGATCGCCCCTATGTACGCCTTCGCTCTGAGCAGAGGCTTTGGCAGCGGCATCATCACATCTAACGCCGGCGGAAGCGGA。
在某些实施方案中,本发明的佐剂蛋白连接第二连接臂(本文有时简称为“SC-CTB”)的氨基酸序列如下SEQ ID NO:13所示:GAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGGSGSTPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANGGSGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGSG。
在某些实施方案中,抗原序列进一步连接有标签序列,如多组氨酸标签(His标签,His-tag),其包括6-10个连续的组氨酸残基,以用于能够从细胞或细胞裂解液中提取目的蛋白。
本发明中,呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的粒径在10-50nm,例如10、20、30、40、50或其间任意数值的纳米粒径。
呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的制备方法
本发明进一步提供呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的制备方法,其包括:
(1)获得连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或获得连接第二连接臂的自组装佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原,其中第一连接臂和第二连接臂分别具有活性基团;和
(2)使所述佐剂蛋白与所述抗原以1:(1-5)摩尔比混合于PBS缓冲液,通过活性基团之间的反应从而使所述佐剂蛋白和所述抗原共价连接。
在本发明的步骤(1)中,获得连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或获得连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原可以通过DNA重组技术获得相应的融合蛋白。对于融合蛋白的重组生产,可以将编码连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或将连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原的核酸插入载体中用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于表达。在具体实施方案中,载体组分通常包括但不限于以下的一种或多种:信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本发明中,连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原可通过体外表达方式获得。体外表达方式通常包括使用表达载体,包括但不限于质粒。导入质粒可通过标准技术例如,感染、转染、转导或转化实现。基因转移模式的实例包括例如,裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE聚葡糖、电穿孔、原生质体融合、脂质体转染、细胞显微注射等。
在优选的实施方案中,连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原分别通过不同的表达载体或表达体系来制备。为了保证纳米蛋白颗粒的结构及功能,优选地,本发明的纳米蛋白颗粒通过双表达系统来制备,优选不同类型的表达系统来制备,如真核表达系统和原核表达系统双表达系统。在真核表达系统中制备连接第二连接臂的抗原,而对于连接第一连接臂的佐剂蛋白,则在原核表达系统中制备连接第一连接臂的佐剂蛋白。在此情况下,既能保证制备效率,又能保证所得到的纳米蛋白颗粒的功能或活性。在另外的实施方案中,连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原通过双表达系统分别表达,且至少连接第一连接臂的抗原的表达系统为真核表达系统。
在某些实施方案中,编码第一连接臂和佐剂蛋白的核酸如SEQ ID No:6所示,编码连接第二连接臂和抗原的核酸如SEQ ID No:7所示。
用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。将用于本发明蛋白或抗原生产的或用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞在适当常规营养物培养基中培养,用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。使用本领域普通技术人员已知的纯化技术,可以纯化从所述细胞制备的融合蛋白。
本发明的步骤(2)中,所述佐剂蛋白与所述抗原以1:(1-5)摩尔比混合于PBS缓冲液,通过活性基团之间的反应从而使所述佐剂蛋白和所述抗原共价连接。所述佐剂蛋白与所述抗原的摩尔比优选为1:1-5,还优选为1:1-2.5,进一步优选为1:1-2。步骤(2)的反应温度不特别限定,可以是0-40℃,例如0-5℃,再例如5-10℃,10-30℃。反应时间不特别限定,可以为20分钟-36h,优选为12-30h。在示例性实施方案中,反应温度为4℃,反应时间为10-15小时。
本发明进一步提供一种融合蛋白,其包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或SEQID NO:6编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列。
本发明还提供一种融合蛋白,其包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或SEQ IDNO:7编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列。
本发明还提供一种融合蛋白,其包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或SEQ IDNO:12编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列。
本发明还提供一种融合蛋白,其包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列。
本发明提供了一种编码本文所述的融合蛋白的核酸分子。在一些实施方式中,所述融合蛋白包括SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中,本文所述的核酸分子或载体可以被密码子优化。
在示例性实施方案中,本发明提供了一种载体,其包含本文所述的核酸分子。
在示例性实施方案中,本发明提供了一种药物组合物,其包含:
(1)本文所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,或本文所述的融合蛋白,或本文所述的核酸分子,或本文所述的载体;和
(2)药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在示例性实施方案中,本发明提供了本文所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,或本文所述的融合蛋白、或本文所述的核酸分子、或本文所述的载体在制备用于在有需要的受试者中治疗或预防呼吸道相关病毒感染和/或相关疾病的药物中的用途。优选地,所述药物为疫苗。在某些实施方案中,所述相关疾病可以是COVID-19或流感病毒。在某些实施方案中,所述相关疾病可以是由SARS-COV-2病毒或流感病毒和/或其突变体引起。
在示例性实施方案中,本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防呼吸道相关病毒感染和/或相关疾病的方法,其包括将治疗有效量的本文所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,或本文所述的融合蛋白、或本文所述的核酸分子、或本文所述的载体、或本文所述的药物组合物施用于所述受试者。
在示例性实施方案中,本发明提供一种体外激活免疫细胞的方法,其包括使根据本文所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒与所述免疫细胞接触的步骤。优选地,所述免疫细胞包括树突状细胞或巨噬细胞。
本发明中,“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等生理学相容的载体。本发明的药物还可以以联合疗法施用,即联合其它治疗剂及其药剂。此类治疗剂包括任何抗感染活性剂、小分子药物,包括但不限于瑞德西韦、利巴韦林、奥司他韦、扎那米韦、羟氯喹、干扰素、镇痛药、阿奇霉素和皮质类固醇。
本文中使用的术语“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”表示,足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种征状的改善的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的量。精确量取决于众多因素,例如,组合物的活性、采用的递送的方法、组合物的免疫刺激能力、预期的患者和患者考虑因素等,且可以由本领域普通技术人员容易地确定。治疗效果可以直接地或间接地包括疾病的一种或多种征状的减轻,治疗效果还可以直接地或间接地包括细胞免疫应答的刺激。
在某些实施方案中,本文所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,或本文所述的融合蛋白、或本文所述的核酸分子、或本文所述的载体、或本文所述的组合物可以经肌肉内或肺吸入等合适的途径施用于需要的受试者。
本文中使用的术语“激活免疫细胞”表示可以刺激或引起免疫应答的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒。优选地,所述免疫应答是细胞和体液免疫应答,诸如由T-细胞介导的适应性免疫应答。在某些实施方式中,呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒可以包含在药物制剂中。
本文中使用的术语“受试者”可以是能够发生细胞免疫应答的任何生物体,诸如人类、宠物、家畜、展示动物、动物园样本或其它动物。例如,受试者可以是人、非人灵长类动物、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、猪等。需要施用如本文中所述的治疗剂的受试者包括已被流感病毒或冠状病毒,例如SARS-CoV-2病毒感染甚至已经出现病毒感染相关疾病,或者处于呼吸道相关病毒感染风险中的受试者。
本文中使用的术语“有需要的受试者”表示处于疾病、障碍或病症的高危中或遭受疾病、障碍或病症的受试者,所述疾病、障碍或病症适合用本文所提供的化合物或其组合物治疗或改善。在某些实施方式中,有需要的受试者是人。
实施例1
1、实验方法
1.1第一连接臂-佐剂蛋白(ST-CNP)融合蛋白表达载体的构建
该融合蛋白中,自N端起第1位至第13位为第一连接臂氨基酸序列,第14至第24位为柔性linker,第25至第177位为自组装佐剂蛋白(本文有时简写为sCTB)单体序列,酶切位点为NCoI,XhoI。
用NCoI和XhoI分别酶切上述所示的DNA分子,得到基因片段;用NCoI和XhoI酶切pET28a(+),得到载体大片段;将基因片段与载体大片段连接,分别得到DNA分子的重组载体,将该重组载体命名为pET28-ST-CNP。
该融合蛋白的氨基酸序列:AHIVMVDAYKPTKGSGTAGGGSGSTPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANGGSGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELAR(SEQ ID NO:8)。
核苷酸序列:gcacatattgtgatggttgatgcctataaaccgaccaaaggtagcggcaccgccggcggcggttcaggctcaaccccgcagaatattaccgatctgtgtgccgaatatcataatacccagatttataccttaaatgataaaatttttagttataccgaatcactggcaggcaaacgcgaaatggccattattacctttaaaaatggtgcaatttttcaggttgaagttccgggtagtcagcatattgattctcagaaaaaagccattgaacgtatgaaagataccttacgtattgcctatctgaccgaagccaaagtggaaaaactgtgtgtttggaataataaaaccccacacgcaattgcagccatttctatggccaatggtggtagcggtcgtctgttactgcgcttagaagaactggaacgtcgcttagaagaattagccaaatttgttgccgcatggaccctgaaagcagcagccgtggatctggaactggccgccctgcgtcgtcgcttagaagaactggcacgc(SEQ ID NO:6)。
1.2第一连接臂-佐剂蛋白融合蛋白的表达与纯化
将pET28-ST-CNP载体分别化转入BL21感受态,涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基,阳性克隆即BL21/pET28-ST-CNP。挑取BL21/pET28-第一连接臂(tag)-VLP,接种于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基,37℃,220转/分钟培养12小时后转接于10mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃,220转/分钟培养12h。之后转接于1L LB培养基37℃,220转/分钟培养至OD600约为0.6时,加入终浓度为1mM的IPTG,并降温至30℃诱导12h。
样品处理:取上述30℃诱导12h的菌体,加入100mL上样缓冲液(20mM pH7.8 Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑、8M尿素),高压破菌,16000g离心,收集上清。
样品纯化:首先用A1液(20mM,pH7.8 Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑、8M尿素)平衡至少3个柱床体积,以上流速均为4mL/min。上样后,再用A2液(20mM Tris-HCl、0.2MNaCl、10mM咪唑、8M尿素,pH7.5)洗去未结合蛋白,冲洗至紫外吸收(280nm)接近于0mAU,最后用100%B1(20mM pH7.8 Tris-HCl、0.2M NaCl、500mM咪唑、8M尿素)洗脱,收集洗脱液30mL,经SDS-PAGE检测得到纯化的目标样品ST-CNP。对目标样品进行透析,最终将缓冲液换为PBS,透析结束后16000g离心,收集上清。通过SDS-PAGE检测蛋白纯度。
1.3第二连接臂和抗原(SC-RBD)融合蛋白表达载体的构建
用于表达第二连接臂和抗原融合蛋白的基因通过南京铭研生物科技有限公司MaxCodonTM Optimization Program(V13)密码子平台优化,第1至第116位为第二连接臂序列,第117至第121位为柔性linker,第122至第335位为RBD序列,第336至第341位为His标签,采用全基因合成并通过双酶切法将SC-R基因插入到表达载体pcDNA3.4中,最终转到DH5α克隆菌株中,通过质粒大抽试剂盒提取转染级质粒。
氨基酸序列:GAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGGSGSRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNHHHHHH(SEQ ID NO:9)。
核苷酸序列:ggagctatggtggacaccctgagcggactgtctagcgaacagggacagagcggcgatatgaccatcgaggaggacagcgccacccacatcaagttcagcaagcgggacgaggacggcaaagagctggccggagctacaatggagctgagagacagcagcggcaagaccatcagcacttggatcagcgacggccaggtcaaggacttctacctgtaccccggcaagtacaccttcgtggagaccgcagctccagacggatacgaagtggccacagccatcaccttcaccgtgaacgagcagggacaggtcaccgtgaacggaaaggccaccaagggagatgcccacattggaggaagcggctctagagtgcagcctacagagagcatcgtgcggttccccaacatcaccaacctctgccccttcggagaggtgttcaacgccaccagattcgccagcgtgtacgcttggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtctcccaccaagctgaacgacctctgcttcaccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatcaggggcgacgaagtgcgacagattgccccaggacagaccggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggttgcgtgatcgcttggaacagcaacaacctggacagcaaggtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagagcaacctgaagcccttcgagcgggacatcagcaccgagatctaccaggccggctctacaccttgcaacggcgtggagggcttcaattgctacttccccctgcagagctacggcttccagcctaccaacggcgtgggataccagccttacagggtggtggtgctgagcttcgaactgctgcacgccccagctacagtgtgcggtcctaaaaagagcaccaaccaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO:7)。
1.4 SC-RBD融合蛋白表达与纯化
转染:转染前1天将HEK293细胞悬浮培养至1000mL,接种密度为1×106cells/mL,置于培养箱中110rpm,37℃,5%CO2培养。转染当天使细胞密度控制在1-1.5×106cells/mL左右。向转染缓冲液中加入DNA和转染试剂混匀,37℃温育。将DNA-转染试剂混合物加入待转染细胞中,放入培养箱中110rpm,37℃,5%CO2培养。转染后约4-6天,取出细胞培养物,离心,收集上清或细胞。
纯化:取转染培养5天后的细胞培养液离心,上清用0.22μm滤器过滤,在4℃环境下透析至缓冲液1×PBS,pH7.4中。对于蛋白携带His标签,上清流穿Ni-NTA亲和层析色谱柱,咪唑洗脱目的蛋白,经过SDS-PAGE检测后收集上述目标蛋白SC-RBD,并将其透析到1×PBS,10%Glycerol,pH7.4中,透析结束后用0.22um滤器过滤,并分装冻于-80℃。
1.5结合
将纯化的ST-CNP和SC-RBD蛋白以亚基摩尔1:1.5或者以上比例在4℃反应过夜,孵育的缓冲液为PBS,当反应结束后,共轭混合物经过分子排阻色谱柱去除未结合SC-RBD蛋白,纯化得到纳米蛋白疫苗R-CNP。
1.6纳米疫苗的表征
透射电子显微镜:将R-CNP样品蛋白浓度稀释至大约100μg/mL,将样品滴加在200目的铜网上,静置1min。用滤纸将多余的样品吸干,加入2%乙酸双氧铀,静置45s,进行风干。之后通过日立HT7700显微镜在80KV的电压下成像。
动态光散射:将R-CNP样品蛋白浓度稀释至大约200μg/mL,以16000g离心10min,收集上清,取1mL样品加入一次性比色皿中,放入DLS槽中,通过马尔文公司Zetasizer Ultra仪器检测纳米颗粒的粒径,每个样品平行检测三次。
1.7抗原提呈细胞的激活
APC的提取:取两只雌性BALB/c小鼠,分别在股骨、胫骨和腹腔提取骨髓源树突状细胞(BMDCs)和巨噬细胞。
刺激:向巨噬细胞和培养至第6天的BMDCs中分别加入不同的疫苗制剂(PBS,RBD,CTB+RBD或R-CNP),将24孔板继续在5%CO2,37℃细胞培养箱中培养24h。用细胞刮小心收集各组细胞,吸取至1.5mL无菌离心管中,500g,5min离心,收集上清和沉淀,上清部分待用,将沉淀用stain buffer重悬,清洗两次。
染色:100μL stain buffer重悬细胞,每管分别加入CD11c,CD40,CD86,MHC I,MHCII,同时设置单染管和空白管,在4℃避光染色30min。结束后,500g,5min离心,收集沉淀,用stain buffer重悬,清洗两次。最后用300μL stain buffer重悬细胞。通过CytoFLEX LX流式细胞仪进行检测各组活化相关信号分子的表达。
细胞因子检测:通过CBA细胞因子试剂盒检测各组间上清中细胞因子含量。
1.8小鼠免疫
18只6周龄的雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,随机分为3组:PBS组,R-CNP(im)或R-CNP(ih)。免疫前用PBS稀释纯化后的免疫原,每只小鼠免疫5.0μg的RBD蛋白,分别在第1和14天肌肉(im)或肺吸入(ih)免疫,间隔两周取血。
1.9间接酶联免疫吸附试验
包被:包被液将RBD稀释为2μg/mL,96孔板中每孔加入100μL,4℃包被过夜。结束后用PBST溶液洗板3次,停留30s后弃去孔内液体,在滤纸上扣干。
封闭:200μL/孔加入5%BSA封闭液,37℃封闭2h。结束后用PBST溶液洗板3次,在滤纸上扣干。
一抗:加入抗体稀释液倍比稀释的小鼠血清,100μL/孔,37℃孵育1h。反应结束后洗板、拍干。
二抗:加入抗体稀释液稀释的二抗(1:10000),100μL/孔,37℃孵育1h。反应结束后洗板、拍干。
显色:100μL/孔加入显色液,避光反应10min,50μL/孔加入终止液,结束后,用检测波长450nm读值。
结果判定:以阴性对照组检测的OD值的均值为标准,乘以2.1作为阳性血清OD值的判断标准,从而计算每只小鼠血清效价。
2、实验结果
2.1纳米蛋白疫苗R-CNP的制备
为了将RBD抗原均匀展示在自组装蛋白CNP表面,如图1A所示,通过将第一连接臂和佐剂蛋白融合表达,以制备ST-CNP;其次,将第二连接臂和抗原融合表达,以制备SC-RBD;最后,将两者进行结合以制备CNP表面展示RBD的纳米疫苗R-CNP。
首先表达和纯化了高纯度的ST-CNP和SC-RBD,将两者在PBS缓冲液中4℃结合过夜,经SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色,结果如图1B所示,结合后SC-RBD分子量由50kDa提高至65kDa左右,分子量明显提升,表明两者通过第一连接臂和第二连接臂的酰胺键发生有效结合。利用Western-blot分别以抗-His标签抗体和抗-CTB检测结合前后样品(图1B、C),结果与考马斯亮蓝结果一致,均检测到目标条带,且分子量高于结合前SC-RBD样品。
2.2 R-CNP疫苗表征
如图2A所示,为纳米蛋白疫苗的透射电镜图,结果表明制备得到的纳米疫苗大小分布均匀,颗粒呈圆球状。利用动态光散射粒度仪进一步检测CNP和R-CNP的水合粒径,R-CNP大小在24nm左右(图2B),结合前纳米颗粒CNP大小在19nm左右,与结合前颗粒相比,大小明显增加,主要是CNP表面展示了RBD蛋白。
2.3 R-CNP疫苗抗原性检测
为了验证RBD经过纳米颗粒展示后是否影响RBD的抗原性,通过表面等离子体共振(SPR)实验检测RBD共轭的纳米颗粒的结合动力学。如图3所示,检测了RBD单体和R-CNP纳米颗粒,结合hACE2受体的亲和常数值(KD)分别为7.34×10-9和5.92×10-9M,两者具有相似的亲和常数,表明纳米蛋白疫苗保留了较好的与ACE2结合能力,RBD结构表位得到了很好的保持。
2.4 R-CNP疫苗对APCs的体外激活能力
通过体外实验考察纳米蛋白疫苗R-CNP的APCs激活能力。首先,提取小鼠的骨髓源树突状细胞(BMDCs),经过培养后,将未成熟的DC分别经不同的疫苗制剂孵育后,用流式细胞仪检测DC细胞表面的共刺激分子。结果如图4所示,在激活共刺激分子CD40和CD86的表达方面,与PBS相比,RBD、CTB+RBD和R-CNP组在CD40表达上提升了3.0、3.7和5.3倍;在CD86表达上分别提升了2.0、2.5和3.0倍。另外,在DC细胞表面MHC II、MHC I类分子表达水平方面,R-CNP组明显高于PBS和RBD组,并具有显著性差异(p<0.05)。
其次,巨噬细胞也是一种专职抗原提呈细胞,因此在体外也考察了R-CNP对巨噬细胞的激活能力。如图5所示,在激活共刺激分子CD40和CD86的表达方面,与PBS相比,RBD、CTB+RBD和R-CNP组在CD40表达上提升了1.1、1.1和1.8倍;在CD86表达上分别提升了1.4、2.0和3.0倍。另外,在DC细胞表面MHC II、MHC I类分子表达水平方面,R-CNP组明显高于PBS、RBD和CTB+RBD组,并具有显著性差异(P<0.05)。
进一步检测BMDCs和巨噬细胞培养液上清中细胞因子分泌水平。结果如图6所示,R-CNP均能促进BMDCs和巨噬细胞分泌大量的促炎性细胞因子。上述结果说明R-CNP纳米疫苗能有效地激活APCs成熟,为激活体液免疫应答奠定了基础。
2.5 R-CNP疫苗抗体水平
进一步通过ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度,将BALB/c小鼠随机分为PBS组、R-CNP(im,肌肉注射)和R-CNP(ih,肺吸入)三组,分别在第0和14天经过肌肉或肺吸入免疫两针。结果如图7所示,随着免疫剂次加强,两种免疫方式均能诱导产生特异性抗体,在70天内抗体水平仍未降低。并且,R-CNP疫苗免疫后均能产生高水平的IgG1和IgG2a,其中,IgG1代表Th2型抗体,IgG2a代表Th1型抗体,表明疫苗免疫后能够引起Th1、Th2的细胞免疫和体液免疫应答。以上结果显示,R-CNP疫苗经过肌肉或肺吸入免疫后能够诱导中和抗体,且无需佐剂。
实施例2
1、实验方法
1.1第一连接臂-抗原(ST-HA)融合蛋白(真核表达)
该融合蛋白中,自N端起第1位至第13位为第一连接臂氨基酸序列,第14至第24位为柔性linker,第25位开始为流感抗原序列。该融合蛋白的氨基酸序列:AHIVMVDAYKPTKGSGTAGGGSGSGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNSYVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQAGRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNAGGSGHHHHHH。
核苷酸序列:GCCCACATCGTGATGGTGGACGCCTACAAGCCTACCAAAGGAAGCGGAACAGCCGGAGGAGGAAGCGGATCAGGAATTGCCCCTCTGCAGCTGGGCAAGTGTAACATCGCCGGTTGGCTCCTGGGAAATCCCGAGTGCGATCCTCTGCTGCCAGTGCGGTCTTGGAGCTACATCGTGGAGACCCCCAACAGCGAGAACGGCATTTGCTACCCCGGCGACTTCATCGACTACGAGGAACTGAGGGAGCAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGCGCTTCGAGATCTTCCCCAAGGAGAGCTCTTGGCCCAACCACAACACCAACGGCGTGACAGCCGCTTGTAGCCACGAAGGCAAGAGCAGCTTCTACCGGAACCTCCTCTGGCTGACCGAGAAAGAGGGCAGCTACCCCAAGCTGAAGAACAGCTACGTGAACAAGAAGGGCAAGGAGGTGCTCGTCCTCTGGGGAATTCACCACCCTCCCAACAGCAAGGAGCAGCAGAACCTGTACCAGAACGAGAACGCCTACGTGTCCGTGGTGACCAGCAACTACAACCGGAGGTTCACCCCCGAGATCGCCGAGAGACCCAAAGTGCGAGACCAGGCCGGCCGGATGAACTACTATTGGACCCTGCTGAAGCCCGGCGACACCATCATCTTCGAAGCCAACGGCAACCTGATCGCCCCTATGTACGCCTTCGCTCTGAGCAGAGGCTTTGGCAGCGGCATCATCACATCTAACGCCGGCGGAAGCGGACATCATCACCACCACCAC。
1.2第二连接臂和佐剂蛋白(SC-CNP)融合蛋白(原核表达)
该融合蛋白的氨基酸序列如下所示:GAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGGSGSTPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANGGSGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGSGHHHHHH。
1.3将上述表达的ST-HA以及SC-CNP融合蛋白进行纯化
1.4结合
将纯化的ST-HA以及SC-CNP以亚基摩尔1:1.5或者以上比例在4℃反应过夜,孵育的缓冲液为PBS,当反应结束后,共轭混合物经过分子排阻色谱柱去除未结合蛋白,纯化得到纳米蛋白疫苗HA-CNP。
1.5将ST-HA单体、未偶联空载纳米颗粒和HA偶联纳米颗粒在还原剂下SDS-PAGE测定。
1.6小鼠免疫
雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。免疫前用PBS稀释纯化后的免疫原,每只小鼠免疫5.0μg的HA蛋白,分别在第1和14天肌肉(im)或肺吸入(ih)免疫,间隔两周取血。
1.7间接酶联免疫吸附试验
包被:包被液将HA稀释为2μg/mL,96孔板中每孔加入100μL,4℃包被过夜。结束后用PBST溶液洗板3次,停留30s后弃去孔内液体,在滤纸上扣干。
封闭:200μL/孔加入5%BSA封闭液,37℃封闭2h。结束后用PBST溶液洗板3次,在滤纸上扣干。
一抗:加入抗体稀释液倍比稀释的小鼠血清,100μL/孔,37℃孵育1h。反应结束后洗板、拍干。
二抗:加入抗体稀释液稀释的二抗(1:10000),100μL/孔,37℃孵育1h。反应结束后洗板、拍干。
显色:100μL/孔加入显色液,避光反应10min,50μL/孔加入终止液,结束后,用检测波长450nm读值。
结果判定:以阴性对照组检测的OD值的均值为标准,乘以2.1作为阳性血清OD值的判断标准,从而计算每只小鼠血清效价。
2、实验结果
2.1纳米蛋白疫苗HA-CNP的制备
为了将HA抗原均匀展示在自组装蛋白CNP表面,通过将第一连接臂和抗原融合表达,以制备ST-HA;其次,将第二连接臂和佐剂蛋白融合表达,以制备SC-CNP;最后,将两者进行结合以制备CNP表面展示HA的纳米疫苗HA-CNP。
首先表达和纯化了高纯度的ST-HA和SC-CNP,将两者在PBS缓冲液中4℃结合过夜,经SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色,结果如图8所示,结合后分子量提高至65kDa左右,分子量明显提升,表明两者通过第一连接臂和第二连接臂的酰胺键发生有效结合。
2.2 HA-CNP疫苗抗体水平
进一步通过ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度。结果如图9所示,随着免疫剂次加强,两种免疫方式均能诱导产生特异性抗体,在42天内抗体水平仍未降低。以上结果显示,HA-CNP疫苗经过肌肉或肺吸入免疫后能够诱导特异性抗体,且无需佐剂。
本说明书中提供了相应引物或分子的具体序列,同时根据相关规定,本申请还提供了计算机可读形式的序列表。需要说明的是,计算机可读形式的序列表中的序列仅供参考,在本说明书中的序列与计算机可读形式的序列表中的序列不一致的情况下,以本说明书中的序列内容为准。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述,但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (10)
1.一种呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其特征在于,包括由佐剂蛋白组成的核和位于所述核表面的抗原,且所述佐剂蛋白连接有第一连接臂,所述抗原连接有第二连接臂,或者所述佐剂蛋白连接有第二连接臂,所述抗原连接有第一连接臂,且所述第一连接臂与所述第二连接臂通过共价健结合。
2.根据权利要求1所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其特征在于,所述佐剂蛋白的序列如SEQ ID No:1所示。
3.根据权利要求1所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其特征在于,所述第一连接臂的序列如SEQ ID No:3所示,和/或所述第二连接臂的序列如SEQ ID No:5所示。
4.根据权利要求1所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其特征在于,所述抗原源自冠状病毒S蛋白的RBD或流感病毒的HA。
5.根据权利要求1所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,其特征在于,其粒径为10-50nm。
6.一种呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)获得连接第一连接臂的佐剂蛋白和连接第二连接臂的抗原,或获得连接第二连接臂的佐剂蛋白和连接第一连接臂的抗原,其中第一连接臂和第二连接臂分别具有活性基团;和
(2)使所述佐剂蛋白与所述抗原以1:(1-5)摩尔比混合于体外缓冲液,通过活性基团之间的反应从而使所述佐剂蛋白和所述抗原共价连接。
7.根据权利要求6所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒的制备方法,其特征在于,所述连接第一连接臂的佐剂蛋白和所述连接第二连接臂的抗原,或所述连接第一连接臂的抗原和所述连接第二连接臂的佐剂蛋白通过双表达系统表达,且所述连接第二连接臂的抗原或连接第一连接臂的抗原需通过真核表达系统制备,和所述活性基团包括氨基、羧基和/或硫醇基团。
8.一种药物组合物,其特征在于,包括根据权利要求1-5任一项所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒,优选地,其为疫苗,特别是肺吸入疫苗。
9.一种体外激活免疫细胞的方法,其特征在于,包括使根据权利要求1-5任一项所述的呼吸道相关病毒纳米蛋白颗粒与所述免疫细胞接触的步骤。
10.根据权利要求9所述的体外激活免疫细胞的方法,其特征在于,所述免疫细胞包括树突状细胞或巨噬细胞。
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