CN117776993A - 一种芳基硫醇化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种芳基硫醇化合物及其制备方法和用途。所述芳基硫醇化合物为式(III)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物，该化合物可将活化的酰肼以及邻苯二胺原位硫解为芳基硫酯，用于多肽硫酯肽段与N端经半胱氨酸修饰的肽段之间的自然化学连接，并具有较高的反应动力学。本发明通过对4‑巯基苯乙酸进行修饰，可克服疏水肽段在自然化学连接过程中因失去C端助溶标签而导致的析出、聚集问题，提高多肽中间体的自然化学连接效率。
Description
技术领域
本发明涉及多肽或蛋白合成技领域，尤其涉及一种芳基硫醇化合物及其制备方法和用途。
背景技术
自然化学连接是蛋白质化学合成中最常用的一类化学反应，其利用多肽C端硫酯和N端半胱氨酸肽在中性溶液中进行高选择性化学反应，实现多肽片段的无痕、高效拼接。利用这种高效的多肽片段拼接技术，目前已成功实现了数百个氨基酸蛋白质的化学合成，包括翻译后修饰组蛋白、糖基化修饰EPO和定点翻译后修饰膜蛋白等。利用自然化学连接进行蛋白质化学合成的过程中，需要将完整的蛋白分割成大小合适的肽段，在此过程中经常会遇到疏水性肽段中间体。疏水肽不仅难以通过高效液相色谱纯化，并且在自然化学连接反应液中易沉淀，难以通过自然化学连接的方式进行肽段拼接。
高比例的疏水性氨基酸是疏水肽的主要特征，提高亲水性氨基酸的比例或引入亲水性化学修饰可以改善疏水肽的溶解性，提高疏水肽的自然化学连接效率。为此，发展了很多多肽化学修饰策略，例如在疏水肽的N端、C端、氨基酸侧链(Thr，Cys，Lys和Glu等)以及酰胺骨架上引入亲水性氨基酸或其它共价化学修饰，以提高疏水肽中间体的溶解性。这些化学修饰还可以作为临时性的助溶标签，在完成多肽自然化学连接后，通过多肽兼容的化学反应选择性地脱除，得到天然序列多肽或蛋白质。Kent和Montal等人提出在C端硫酯以及邻苯二胺上引入多聚精氨酸作为临时助溶标签，来提高疏水肽的溶解性，并实现了含有疏水肽段的HIV virus protein u(Vpu)和diacylglycerol kinase(DAGK)等蛋白的合成。多肽C端助溶标签的引入十分方便，可以在固相上直接合成。更为重要的是，多肽C端助溶标签会在自然化学连接过程中被释放，不需要进行额外的脱除操作即可得到天然的多肽序列。然而，在自然化学连接过程中，多肽一般需要先转换为高活性的4-巯基苯乙酸(MPAA)硫酯中间体，疏水肽可能会失去C端助溶标签而聚集、析出，导致自然化学连接失败，这使得含有疏水肽段蛋白的合成变得困难。
因此，亟需提供一种化合物，以解决C端助溶标签去除时疏水肽出现析出、聚集等问题，提高疏水性多肽中间体的自然化学连接效率。
发明内容
本发明旨在至少一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种化合物，该化合物为聚乙二醇(PEG)修饰的芳基硫醇(MPAA-PEG)，可以克服疏水肽段在自然化学连接过程中因失去C端助溶标签而导致的析出、聚集问题，提高多肽中间体，尤其是疏水性多肽中间体的自然化学连接效率。
为此，本发明第一方面提供了一种化合物，所述化合物为式(III)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物：
其中，n≧2且为整数。
本发明提供的化合物可将活化的酰肼以及邻苯二胺原位硫解为芳基硫酯，可用于多肽硫酯肽段与半胱氨酸修饰的肽段之间的自然化学连接，并具有较高的反应动力学。本发明通过对MPAA的PEG化修饰，发现MPAA-PEG可以克服疏水肽段在自然化学连接过程中失去C端助溶标签而导致的析出、聚集问题，提高疏水性多肽中间体的自然化学连接效率。
根据本发明的实施例，n为2～10的整数。
本发明第二方面提供了第一方面所述的化合物在多肽连接中的应用。
本发明第一方面所述的化合物合成简单，水溶性较好，可将活化的酰肼以及邻苯二胺原位硫解为芳基硫酯，将其用于多肽硫酯肽段与半胱氨酸肽段之间的自然化学连接，具有较高的反应动力学，可克服疏水肽段在自然化学连接过程中失去C端助溶标签而导致的析出、聚集问题，提高疏水性多肽中间体的自然化学连接效率和产率。
本发明第三方面提供了第一方面所述的化合物的制备方法，包括：
(1)将式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸接触，得到式(b)所示化合物；
(2)将式(b)所示化合物与式(c)所示化合物进行缩合反应，得到式(d)所示化合物；
(3)将式(d)所示化合物与切割试剂接触，得到所述化合物；
其中，Ra为卤素，n≧2且为整数；
本发明提供的制备方法简单易行，便于制备第一方面所述的化合物，对疏水肽的全化学合成有着重要帮助。
根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：在第一溶剂中，将式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸接触，所述第一溶剂包括选自DCM或DMF。
根据本发明的实施例，式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸的摩尔比为(1：1)-(2：1)。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：在第二溶剂中，将式(b)所示化合物、式(c)所示化合物与缩合剂接触，所述第二溶剂包括选自DMF或DCM。
根据本发明的实施例，所述缩合剂包括EDC、TEA、HOAt和DMAP。
根据本发明的实施例，式(b)所示化合物与式(c)所示化合物的摩尔比为(1：1)-(1：2)。
根据本发明的实施例，步骤(3)中所述切割试剂包括TFA、DCM和TIPS。
根据本发明的实施例，所述切割试剂中TFA、DMC和TIPS的体积比为(12-13):(6-7):(1-1.5)。
本发明第四方面提供了一种多肽硫酯的制备方法，所述多肽硫酯为式(IV)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物：
所述制备方法包括：
步骤一：将多肽R2与修饰基团偶联，得到C端修饰的多肽；
步骤二：将所述C端修饰的多肽进行活化反应，得到式(II)所示化合物；
步骤三：将式(II)所示化合物与式(III)所示化合物接触，得到所述多肽硫醇；
其中，所述修饰基团为式(I)所示基团；R1选自多聚赖氨酸或多聚精氨酸；n≧2且为整数；
所述式(III)所示化合物为权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求4-7任一项所述的制备方法制备的化合物；
本发明提供的多肽硫酯基于第一方面所述的化合物，通过采用第一方面所述的化合物对多肽C端的修饰可增加多肽硫酯中间体的水溶性，促进疏水肽的自然化学连接，实现疏水性多肽/蛋白质的有效制备。
根据本发明的实施例步骤二中所述活化反应包括：将所述C端修饰的多肽溶于缓冲液中，与活化试剂接触。
根据本发明的实施例，所述缓冲液包括选自盐酸胍缓冲液或尿素缓冲液；其中，所述盐酸胍缓冲液的pH为2-3。
根据本发明的实施例，所述活化试剂包括亚硝酸钠。
根据本发明的实施例，步骤三中式(II)所示化合物与式(III)所示化合物的摩尔比为(1：25)-(1：100)。
本发明第五方面提供了一种多肽连接方法，所述多肽连接方法包括：
根据第四方面所述的制备方法得到多肽硫酯，将所述多肽硫酯与N端修饰的多肽进行分子间硫酯交换反应和分子内N-S酰基迁移反应，得到多肽连接产物。
根据本发明的实施例，N端修饰基团为半胱氨酸基团。
本发明提供的多肽连接方法基于MPAA-PEG，其可增加多肽硫酯中间体的水溶性，促进疏水肽的自然化学连接，实现疏水性多肽/蛋白质的有效制备。
本发明相对于现有技术的有益效果：
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的芳基硫醇(MPAA-PEG)，可以将活化的酰肼以及邻苯二胺原位硫解为芳基硫酯，促进多肽硫酯肽段与半胱氨酸肽段之间的自然化学连接，具有较高的反应动力学。该化合物合成简单，水溶性较好，在自然化学连接中帮助较为疏水的肽段活化硫酯片段后依然可以在溶液中存在，即可以进一步进行肽段的连接，对于疏水肽的全化学合成有着重要帮助，有效提高了其连接效率和产率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明提供的多肽硫酯的制备流程；
图2显示了本发明提供的多肽连接方法；
图3显示了本发明实施例1制得的MPAA-PEG的HPLC分析图和质谱图；
图4显示了本发明实施例2中6K-Dbz-16AA纯肽HPLC分析图和质谱图；
图5显示了本发明实施例2中6K-Dbz-16AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图；
图6显示了本发明实施例2中6K-Dbz-16AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图；
图7显示了本发明实施例3中4R-Dbz-8AA纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图8显示了本发明实施例3中4R-Dbz-8AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图；
图9显示了本发明实施例3中4R-Dbz-8AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图；
图10显示了本发明实施例4中6K-Dbz-14AA纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图11显示了本发明实施例4中6K-Dbz-14AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图；
图12显示了本发明实施例4中6K-Dbz-14AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图；
图13显示了本发明实施例5中6K-Dbz-19AA纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图14显示了本发明实施例5中6K-Dbz-19AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图；
图15显示了本发明实施例5中6K-Dbz-19AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图；
图16显示了本发明实施例6中模型肽A片段的HPLC分析图和质谱图；
图17显示了本发明实施例6中模型肽B片段的HPLC分析图和质谱图；
图18显示了本发明实施例6中模型肽A片段和模型肽B片段用MPAA进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图19显示了本发明实施例6中模型肽A片段和模型肽B片段用MPAA-PEG进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图20显示了本发明实施例7中Ub1-45-NHNH2纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图21显示了本发明实施例7中Ub46-76-COOH纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图22显示了本发明实施例7中Ub1-45-NHNH2和Ub46-76-COOH用MPAA进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图23显示了本发明实施例7中Ub1-45-NHNH2和Ub46-76-COOH用MPAA-PEG进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图24显示了本发明实施例8中6H-DPO4-1a-NHNH2纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图25显示了本发明实施例8中DPO4-1b纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图26显示了本发明实施例8中6H-DPO4-1a-NHNH2片段和DPO4-1b片段用MPAA进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图27显示了本发明实施例8中6H-DPO4-1a-NHNH2片段和DPO4-1b片段用MPAA进行自然化学连接的丁达尔现象图；
图28显示了本发明实施例8中6H-DPO4-1a-NHNH2片段和DPO4-1b片段用MPAA-PEG进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图29显示了本发明实施例8中6H-DPO4-1a-NHNH2片段和DPO4-1b片段用MPAA-PEG进行自然化学连接的丁达尔现象图；
图30显示了本发明实施例9中RBD3a-Dbz-R4纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图31显示了本发明实施例9中RBD3b纯肽的HPLC分析图和质谱图；
图32显示了本发明实施例9中RBD3a-Dbz-R4片段和RBD-3b片段用MPAA进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图；
图33显示了本发明实施例9中RBD3a-Dbz-R4片段和RBD-3b片段用MPAA-PEG进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，“卤素”应理解为氟、氯、溴和碘。
根据本发明的实施例，本发明第一方面提供了一种化合物及其制备方法，所述化合物为式(III)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物：
其中，n≧2且为整数，优选n为2～10的整数。
根据本发明的实施例，所述化合物的制备方法包括：
(1)将式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸接触，得到式(b)所示化合物；
(2)将式(b)所示化合物与式(c)所示化合物进行缩合反应，得到式(d)所示化合物；
(3)将式(d)所示化合物与切割试剂接触，得到所述化合物；
其中，Ra为卤素，n≧2且为整数，优选2～10的整数；
根据本发明的具体的实施例，当Ra为氯时，所述化合物的制备方法可为：
(1)将化合物a和化合物b溶于DCM中发生取代反应，经过纯化得到化合物c；
其中，化合物a和化合物b优选以摩尔比1.08:1混合，溶于适量DCM中，搅拌3h，用硅胶板和紫外灯监测反应；用适量水和乙酸乙酯混合淬灭反应，用饱和食盐水洗涤有机相两次，并用无水硫酸钠干燥后与粗硅胶充分混合；通过硅胶层析柱分离纯化，旋干后得到白色絮状固体，即得化合物c；
进一步的，所述水和乙酸乙酯的混合液中水与乙酸乙酯的体积比优选为1:4。所述硅胶层析柱分离纯化使用的展开剂优选为石油醚和乙酸乙酯，两者体积比为2:1。旋干仪器可为减压旋转蒸发仪。
(2)将纯化后的化合物c与化合物d溶于DMF中，加入缩合剂，发生脱水缩合反应后经过纯化得到化合物e；
其中，化合物c与化合物d的摩尔比优选为1:1。加入缩合剂后，进行过夜搅拌，缩合剂可选择1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)(EDC)，三乙胺(TEA)，1-羟基-7-叠氮苯并三唑(HOAt)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)。化合物c与化合物d、EDC、TEA、HOAt和DMAP的摩尔比优选为1:1:1.21:3:1.21:0.05，但不限于此比例。
进一步的，化合物e的纯化方法可选择加水或DMSO稀释反应液后用HPLC纯化并使用冷冻干燥机将其冻干。
(3)采用切割试剂将化合物e中的三苯基脱除，旋干得到黄色混合物，经过纯化后得到化合物f。
其中，切割试剂可选择TFA、DCM、TIPS等。TIPS、DCM与TFA的体积比优选为1:6.25:12.5。脱除反应需在冰浴条件下进行，时间可为1h。旋干仪器可选择减压旋转蒸发仪。化合物f的纯化方法可选择加水或DMF稀释后用反相液相色谱仪纯化并使用冷冻干燥机将其冻干。
根据本发明的实施例，本发明还提供一种多肽硫酯的制备方法，所述多肽硫酯为式(IV)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物：
所述制备方法包括：
步骤一：将多肽R2与修饰基团偶联，得到C端修饰的多肽；
步骤二：将所述C端修饰的多肽进行活化反应，得到式(II)所示化合物；
步骤三：将式(II)所示化合物与式(III)所示化合物接触，得到所述多肽硫酯；
其中，所述修饰基团为式(I)所示基团；R1选自多聚赖氨酸、多聚精氨酸或H；n≧2且为整数；
所述式(III)所示化合物为前述的化合物或根据前述的制备方法制备的化合物；
根据本发明的具体的实施例，多肽硫酯的制备方法可为：
提供化合物I和化合物II，其中R1为多聚赖氨酸(K)、多聚精氨酸(R)，可一定程度提高疏水肽的溶解性，n为≧2的整数，优选为2～10的整数；将所述化合物I中的邻苯二胺活化，原位转化为苯并三氮唑，之后与加入的聚乙二醇修饰的芳基硫醇(化合物II)反应，获得多肽硫酯(化合物III)，具体参见图1。
根据本发明的具体的实施例，所述化合物I含有邻苯二胺连接臂，其可以通过9-芴甲氧羰基(FMOC)-固相多肽合成法(SPPS)制备。化合物II含有多聚聚乙二醇修饰，用于提高化合物II的水溶性。
根据本发明的具体的实施例，化合物I的活化步骤具体为：在-10℃的冰盐浴条件下，将化合物I溶解于酸性盐酸胍缓冲液中(浓度为2mmol/L)，加入7倍量的亚硝酸钠，反应20min-25min，化合物I被定量转化为含有苯并三氮唑的活性中间体。其中，酸性盐酸胍缓冲液可包括6M盐酸胍溶液(GnCl·HCl)，0.2M磷酸氢钠溶液(NaHPO4)，pH调至2.4。
根据本发明的具体的实施例，化合物III的合成步骤具体为：化合物I被活化后，加入25倍当量的化合物II，置于室温，用1M的氢氧化钠溶液将反应液调至中性，反应15min，硫醇与苯并三氮唑发生取代反应，得到化合物III。因其具有聚乙二醇修饰，提高疏水多肽硫酯的水溶性。
根据本发明的实施例，本发明还提供了一种多肽连接方法，包括：
将多肽硫酯与N端修饰的多肽进行分子间硫酯交换反应和分子内N-S酰基迁移反应，得到多肽连接产物。
根据本发明的具体的实施例，多肽连接方法具体可参见图2。
根据本发明的具体的实施例，在中性盐酸胍缓冲液中，化合物III的C端硫酯与化合物IV的N端半胱氨酸发生分子间硫酯交换和分子N-S酰基迁移，获得含有天然异肽键的连接产物。
根据本发明的具体的实施例，N端修饰的多肽(化合物IV)可利用FMOC固相多肽合成方法合成，修饰基团可选择半胱氨酸基团。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实例为MPAA-PEG的具体合成过程，包括如下步骤：
(1)将3.59mmol、1.0g三苯基氯甲烷与3.32mmol、0.559g MPAA混合溶于8-15mLDCM中，搅拌3h。点板监测反应，用含有10mL水和40mL乙酸乙酯混合液淬灭反应。用饱和食盐水洗涤有机相两次，并用无水硫酸钠干燥与粗硅胶充分混合，通过硅胶层析柱分离纯化，其中展开剂为石油醚和乙酸乙酯，两者体积比为2:1。后通过减压旋转蒸发仪得到白色絮状固体；
(2)将760μmol 6Peg分子(即式(c)化合物中n为6)、920μmol EDC、2.29mmol TEA、920μmol HOAt、760μmol步骤(1)得到的反应产物、2-5mg DMAP溶解于2.5mL DMF中，过夜搅拌。用DMSO稀释反应液，用色谱纯化，色谱分离纯化条件为乙腈浓度梯度为20-80％，洗脱时间30min，流速为4mL/min，并经ESI-MS验证后用冷冻干燥机干燥得到白色絮状固体；
(3)配制切割试剂(10mL三氟乙酸，800μL TIPS，5mL DCM)，并将步骤(2)得到的反应产物与切割试剂接触在冰浴下搅拌1h。通过减压旋转蒸发仪旋干得到黄色混合物。用DMF稀释，并用色谱纯化，色谱分离纯化条件为乙腈浓度梯度为20-80％，洗脱时间30min，流速为4mL/min，冷冻干燥得到白色颗粒状固体，即为最终产物MPAA-PEG。其中图3为本发明提供的MPAA-PEG的HPLC分析图和质谱图。
实施例2
本实施例为较为亲水的多肽片段的转硫酯过程，包括如下步骤：
(1)将亲水多肽片段(DITQQAKDIGAGPVAS，包括16个氨基酸)引入邻苯二胺接头，接入6个赖氨酸氨基酸残基，提高疏水肽的溶解性，得到肽段6K-Dbz-16AA；
(2)用90μL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解6K-Dbz-16AA纯肽(0.55mg)，使其浓度为2.5mM。用HPLC检测该肽段纯度，色谱分析条件为乙腈浓度梯度为2-90％，洗脱时间30min，流速为1ml/min。HPLC分析结果和质谱结果参见图4，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(3)取8μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化6K-Dbz-16AA纯肽25min左右；
(4)氧化结束后，向反应体系中加入25eq的MPAA或MPAA-PEG，即11.2μmol、1.9mg的MPAA(对照组)或者11.2μmol、5mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，离心取上清；
(5)取反应液上清约10μL和等体积的100mM TCEP混合后用HPLC检测反应情况，色谱分析条件为乙腈浓度梯度为2-90％，洗脱时间30min，流速为1ml/min，并经ESI-MS验证。结果见图5-6，其中图5为6K-Dbz-16AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图，图6为6K-Dbz-16AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图，比较ESI-MS图中的硫酯峰高度可知，对于较亲水肽段而言，MPAA-PEG可实现肽段的转硫脂过程。
实施例3
本实施例为疏水性较弱的多肽片段的转硫酯过程，包括如下步骤：
(1)将疏水片段(ITRVLLIS，包括8个氨基酸)引入邻苯二胺接头，接入4个精氨酸氨基酸残基，提高疏水肽的溶解性，得到肽段4R-Dbz-8AA；
(2)用90μL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解4R-Dbz-8AA纯肽(0.37mg)，使其浓度为2.5mM。用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图7，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(3)用8μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化4R-Dbz-8AA纯肽25min左右；
(4)氧化结束后，向反应体系中加入25eq的MPAA或MPAA-PEG，即11.2μmol 1.9mg的MPAA(对照组)或者11.2μmol 5mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，离心取上清；
(5)取反应液上清约10μL和等体积的100mM TCEP混合后用HPLC检测反应情况，并经ESI-MS验证。结果见图8-9，其中图8为4R-Dbz-8AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图，图9为4R-Dbz-8AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图。其中图8未见硫酯峰，而图9出现很高的硫酯峰，由此可知，MPAA-PEG在较疏水片段的转硫脂反应中更有优势。
实施例4
本实施例为疏水性较弱的多肽片段的转硫酯过程，包括如下步骤：
(1)将疏水片段(VIAWNSNNLDSKVG，包括14个氨基酸)引入邻苯二胺接头，接入6个赖氨酸氨基酸残基，提高疏水肽的溶解性，得到肽段6K-Dbz-14AA；
(2)用90μL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解6K-Dbz-14AA纯肽(0.53mg)，使其浓度为2.5mM。用HPLC检测该肽段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图10，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(3)取8μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化6K-Dbz-14AA纯肽25min左右；
(4)氧化结束后，向反应体系中加入25eq的MPAA或MPAA-PEG，即11.2μmol、1.9mg的MPAA(对照组)或者11.2μmol、5mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，离心取上清；
(5)取反应液上清约10μL和等体积的100mM TCEP混合后用HPLC检测反应情况，并经ESI-MS验证。结果见图11-12，其中图11为6K-Dbz-14AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图，图12为6K-Dbz-14AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图。比较ESI-MS图中的硫酯峰高度可知，MPAA-PEG硫酯峰高度约是MPAA硫酯峰高度的3倍。因此对于疏水肽段而言，MPAA-PEG参与的肽段的转硫脂过程更为高效。
实施例5
本实施例为疏水性较强的多肽片段的转硫酯过程，包括如下步骤：
(1)将疏水片段(NEAAFRQEGVAVLLAVVIA，包括19个氨基酸)引入邻苯二胺接头，接入6个赖氨酸氨基酸残基，提高疏水肽的溶解性，得到肽段6K-Dbz-19AA；
(2)用90μL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解6K-Dbz-19AA纯肽(0.63mg)，使其浓度为2.5mM。用HPLC检测该肽段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图13，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(3)取8μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化6K-Dbz-19AA纯肽25min左右；
(4)氧化结束后，向反应体系中加入25eq的MPAA或MPAA-PEG，即11.2μmol、1.9mg的MPAA(对照组)或者11.2μmol、5mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，离心取上清；
(5)取反应液上清约10μL和等体积的100mM TCEP混合后用HPLC检测反应情况，并经ESI-MS验证。结果见图14-15，其中图14为6K-Dbz-19AA纯肽用MPAA活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图，图15为6K-Dbz-19AA纯肽用MPAA-PEG活化硫酯反应的HPLC分析图和质谱图，比较HPLC分析图中的硫酯峰面积可知，MPAA-PEG硫酯峰面积约是MPAA硫酯峰面积的4倍。因此对于强疏水肽段而言，MPAA-PEG参与的肽段的转硫脂过程更为高效。
实施例6
本实施例为设计的模型肽的自然化学连接过程，包括如下步骤：
(1)将模型肽A片段LYRAKLYRL-NHNH2的纯肽(0.2mg)用90μL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解，同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图16，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(2)取7μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化模型肽A片段纯肽25min左右；
(3)氧化结束后，向反应体系中加入50eq的MPAA或MPAA-PEG，即9μmol、1.5mg的MPAA(对照组)或者9μmol、4mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，形成如下不稳定的硫酯片段中间体；
(4)将1eq或者稍过量的带有半胱氨酸模型肽B纯肽片段CLYKAKLAA-NH2约0.2mg加入反应体系，添加10mM TCEP，并调节pH至6.8左右。同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图17，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(5)常温搅拌并取反应液与等体积或稍过量100mM TCEP溶液混合均匀后，通过HPLC监测反应，并经ESI-MS验证，约5h反应结束。结果见图18-19，其中图18为模型肽A片段和模型肽B片段用MPAA进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图，图19为模型肽A片段和模型肽B片段用MPAA-PEG进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图，通过产物峰对比可知MPAA-PEG同样可实现自然化学连接反应，且从反应所需时间来看也更加高效。
实施例7
本实施例为泛素片段的自然化学连接过程，包括如下步骤：
(1)将泛素片段(MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIF)的C端进行NHNH2修饰，得到肽段Ub1-45-NHNH2，用1mL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2MNaHPO4，pH＝2.4)溶解纯肽(11.3mg)，同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图20，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(2)取77μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化Ub1-45-NHNH2纯肽25min左右；
(3)氧化结束后，向反应体系中加入50eq的MPAA或MPAA-PEG，即110μmol、18.5mg的MPAA(对照组)或者110μmol、49mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，形成如下不稳定的硫酯片段中间体；
(4)将1eq或者稍过量的带有半胱氨酸修饰的肽段Ub46-76-COOH约12.7mg加入反应体系，添加2.86mg TCEP，并调节pH至6.8左右。同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图21，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(5)常温搅拌并取反应液与等体积或稍过量的100mM TCEP溶液混合均匀后，通过HPLC监测反应，并经ESI-MS验证，约4h反应结束。结果见图22-23，其中图22为Ub1-45-NHNH2和Ub46-76-COOH用MPAA进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图，图23为肽段Ub1-45-NHNH2和Ub46-76-COOH用MPAA-PEG进行自然化学连接的HPLC分析图和质谱图，通过产物峰对比可知，MPAA-PEG同样可实现泛素片段的自然化学连接反应。
实施例8
本实施例为DPO4-1的自然化学连接过程，包括如下步骤：
(1)将肽段6H-DPO4-1a-NHNH2(HHHHHHMIVLFVDFDYFY-NHNH2)用1mL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解纯肽(1.1mg)，同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图24，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(2)于室温下向反应体系中滴加约5.4μL、0.2M乙酰丙酮溶液，并加入100eq的MPAA或MPAA-PEG，即43μmol、7.23mg的MPAA(对照组)或者43μmol、19.1mg的MPAA-PEG(实验组)后，用1M NaOH缓慢将pH调至3.5左右，过夜活化，形成如下不稳定的硫酯片段中间体；
(3)将过量的带有半胱氨酸修饰的DPO4-1b纯肽(CQVEEVLNPSLKGKPVVVSVFSGRFEDSG-NH2)约2.6mg加入反应体系，添加10mM TCEP，并调pH至6.8左右。同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图25，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(4)常温搅拌并取反应液与等体积或稍过量的100mM TCEP溶液混合均匀后，通过HPLC监测反应，并经ESI-MS验证。结果见图26-29，通过产物峰对比可知，MPAA-PEG不仅可实现DPO4-1较疏水肽段的自然化学连接反应，从产物的峰高来看，MPAA-PEG产物峰高几乎是MPAA产物峰高的3倍，证明该方法也更加高效。同时对比产物溶液，MPAA对照组溶液浑浊且有明显的丁达尔效应(参见图27)，而MPAA-PEG实验组溶液澄清透亮，未发生丁达尔效应(参见图29)。可见对于疏水肽的自然化学连接反应，MPAA-PEG更优优势。
实施例9
本实施例为RBD-3的自然化学连接过程，包括如下步骤：
(1)将疏水片段VIAWNSNNLDSKVG引入邻苯二胺接头，接入4个精氨酸氨基酸残基，提高疏水肽的溶解性，得到肽段RBD3a-Dbz-R4。用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图30，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(2)用90μL pH为2.4的酸性PBS缓冲液(6M GnCl·HCl，0.2M NaHPO4，pH＝2.4)溶解纯肽(0.5mg)。用7μL 0.2M NaNO2溶液(7eq)在冰盐浴下(-10℃)氧化RBD3a-Dbz-R4纯肽25min左右；
(3)氧化结束后，向反应体系中加入50eq的MPAA或MPAA-PEG，即11.2μmol 1.9mg的MPAA(对照组)或者11.2μmol 5mg的MPAA-PEG(实验组)后，置于室温，用1M NaOH溶液缓慢将pH调至中性，反应15min左右，形成如下不稳定的硫酯片段中间体；
(4)将1eq或者稍过量的带有半胱氨酸修饰的RBD-3b(CNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQA-NH2)加入反应体系，加入TCEP，并调节pH至6.8左右。同时用HPLC检测该片段纯度，并经ESI-MS验证，HPLC分析结果和质谱结果参见图31，从HPLC分析图中的尖锐单峰可知该片段纯度较高；
(5)常温搅拌并取反应液与等体积或稍过量的100mM TCEP溶液混合均匀后，通过HPLC监测反应，并经ESI-MS验证，约2.5h反应结束。结果见图32-33，通过产物峰对比可知MPAA-PEG同样可实现自然化学连接反应，且从反应所需时间来看也更加高效。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物为式(III)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物：
其中，n≧2且为整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，n为2～10的整数。
3.权利要求1或2所述的化合物在多肽连接中的应用。
4.一种权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸接触，得到式(b)所示化合物；
(2)将式(b)所示化合物与式(c)所示化合物进行缩合反应，得到式(d)所示化合物；
(3)将式(d)所示化合物与切割试剂接触，得到所述化合物；
其中，Ra为卤素，n≧2且为整数；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：在第一溶剂中，将式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸接触，所述第一溶剂包括选自DCM或DMF；
任选地，式(a)所示化合物与4-巯基苯基乙酸的摩尔比为(1：1)-(2：1)。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：在第二溶剂中，将式(b)所示化合物、式(c)所示化合物与缩合剂接触，所述第二溶剂包括选自DMF或DCM；
任选地，所述缩合剂包括EDC、TEA、HOAt和DMAP；
任选地，式(b)所示化合物与式(c)所示化合物的摩尔比为(1：1)-(1：2)。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述切割试剂包括TFA、DCM和TIPS；
任选地，所述切割试剂中TFA、DCM和TIPS的体积比为(12-13):(6-7):(1-1.5)。
8.一种多肽硫酯的制备方法，其特征在于，所述多肽硫酯为式(IV)所示化合物、及其立体异构体、互变异构体、水合物、溶剂化物：
所述制备方法包括：
步骤一：将多肽R2与修饰基团偶联，得到C端修饰的多肽；
步骤二：将所述C端修饰的多肽进行活化反应，得到式(II)所示化合物；
步骤三：将式(II)所示化合物与式(III)所示化合物接触，得到所述多肽硫酯；
其中，所述修饰基团为式(I)所示基团；R1选自多聚赖氨酸或多聚精氨酸；n≧2且为整数；
所述式(III)所示化合物为权利要求1或2所述的化合物或根据权利要求4-7任一项所述的制备方法制备的化合物；
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤二中所述活化反应包括：将所述C端修饰的多肽溶于缓冲液中，与活化试剂接触；
任选地，所述缓冲液包括选自盐酸胍缓冲液或尿素缓冲液；其中，所述盐酸胍缓冲液的pH为2-3；
任选地，所述活化试剂包括亚硝酸钠。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤三中式(II)所示化合物与式(III)所示化合物的摩尔比为(1：25)-(1：100)。
11.一种多肽连接方法，其特征在于，包括：
根据权利要求8-10任一项所述的制备方法得到多肽硫酯，将所述多肽硫酯与N端修饰的多肽进行分子间硫酯交换反应和分子内N-S酰基迁移反应，得到多肽连接产物；
任选地，N端修饰基团为半胱氨酸基团。
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