CN117756901A - 一种烟草抗青枯病基因NtWRKY45及其在烟草抗青枯病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草抗青枯病基因NtWRKY45及其在烟草抗青枯病中的应用，本方案申请基于前期烟草基因芯片数据筛选出的受青枯菌诱导上调表达的WRKY转录因子NtWRKY45，经过PCR克隆获得编码该蛋白的cDNA序列，通过基于Gateway系统的BP和LR反应构建CaMV 35S启动子驱动NtWRKY45基因植物表达载体p35S::NtWRKY45‑TAP，将其转化GV3101农杆菌，通过叶盘法将其导入感病烟草品种红花大金元上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种抗性鉴定，结果证明NtWRKY45可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了一种烟草抗青枯病基因NtWRKY45及其在烟草抗青枯病中的应用。
背景技术
烟草是重要的经济作物，在经济发展中发挥了重要作用，也是分子生物学研究的模式植物。由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是重要土传性病害，目前仍无文献记载有效的防治手段。挖掘抗青枯病基因并阐明抗病机理，可为利用基因工程选育抗青枯病烟草品种奠定理论基础。
转录因子是一类显著调节植物生长和发育并在植物防御和胁迫应答中发挥重要作用的重要调节因子。WRKY转录因子是植物中转录调控因子最大的家族之一。这些转录因子含有一个或两个WRKY结构域，由60个氨基酸组成。它在N-末端具有保守的氨基酸序列WRKYGQK，在C-末端具有C2H2型(CX4-5CX22-23HXH)或C2HC型(CX7CX23HXC)锌指基序，所有已知的WRKY蛋白中至少存在一个WRKY结构域。WRKY转录因子可以调控应激反应中的植物激素信号转导途径，还能够通过结合W-box基序(TTGAC/T)来激活或抑制下游基因的表达。WRKY型转录因子参与植物生长，发育和胁迫反应的多个方面。近年来，越来越多的WRKY TFs被发现涉及植物对非生物胁迫的反应。另外，WRKY涉及植物防御反应的报道也很广泛。棉花中的GhWRKY15基因参与了抗病反应。葡萄VvWRKY1在烟草中过表达增强了烟草对各种真菌的抗性。随着生物技术的发展，运用转基因技术选育抗病虫等品种已成为农作物育种的热点。青枯病是一种毁灭性的细菌性病害，寄主范围很广，但除了拟南芥，尚未从正反向遗传学手段获得抗病基因，近年来，虽然在烟草抗青枯病研究方面己经开展了一些工作，但烟草抗青枯病分子机制及调控网络尚不清晰，烟草中WRKY类抗青枯病基因报道更是甚少。
本研究基于实验室前期烟草基因芯片数据分析结果，获得了一个受青枯菌诱导表达的WRKY类基因NtWRKY45，构建过量表达载体经农杆菌介导转化烟草可显著增强对青枯菌的抗性，推测NtWRKY45基因可能参与烟草对青枯菌的防御反应，可为植物抗青枯病遗传改良提供基因资源。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种烟草抗青枯病基因NtWRKY45及其在烟草抗青枯病中的应用，其将为植物抗青枯病基因工程的提供基因资源，具有重要的应用前景。
为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明申请基于前期烟草基因芯片数据筛选出的受青枯菌诱导表达基因，Blast分析表明该基因为烟草WRKY转录因子中WRKY45，命名为NtWRKY45。根据其预测的CDS序列设计引物，进行聚合酶联反应扩增该基因，结果表明，NtWRKY45序列含有549个碱基对，编码182个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。NtWRKY45编码的蛋白含两个WRKY DNA结合域，符合WRKY类转录因子基因家族的特点，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在上述基础上，本方案提供一种烟草WRKY转录因子NtWRKY45，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
基于上述，本发明还提供编码权利要求1所述的烟草WRKY转录因子NtWRKY45的基因，其为NtWRKY45基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
基于上述，本发明还提供一种超量表达载体，其包含上述所述的NtWRKY45基因；本方案烟草NtWRKY45基因的过量表达能够显著提高烟草对青枯菌的抗性，这为烟草抗青枯病的分子机理提供理论基础。
基于上述，本发明还提供一种烟草WRKY转录因子NtWRKY45基因的超量表达载体构建方法，其包括：基于Gateway系统通过BP反应构建入门载体pDONR207-NtWRKY45，再经过LR反应构建CaMV 35S启动子驱动的植物表达载体p35S::NtWRKY45-TAP。
本方案通过农杆菌介导的遗传转化，得到超量表达NtWRKY45的转基因烟草植株，对其进行抗性鉴定，结果表明NtWRKY45可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。
基于上述，本发明还提供上述所述的烟草WRKY转录因子NtWRKY45在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
基于上述，本发明还提供上述所述的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
基于上述，本发明还提供上述所述的构建方法构建所得的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案申请基于前期烟草基因芯片数据筛选出的受青枯菌诱导上调表达的WRKY转录因子NtWRKY45，经过PCR克隆获得编码该蛋白的cDNA序列，通过基于Gateway系统的BP和LR反应构建CaMV 35S启动子驱动NtWRKY45基因植物表达载体p35S::NtWRKY45-TAP，将其转化GV3101农杆菌，通过叶盘法将其导入感病烟草品种红花大金元上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种抗性鉴定，结果证明NtWRKY45可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基于Gateway系统的烟草NtWRKY45超量表达载体的构建示意图。
图2为NtWRKY45在抗感品种青枯菌处理后的表达模式。X轴代表青枯菌接种后取样时间，Y轴代表基因的相对表达水平，柱子表示均值+标准误，重复三次独立实验,大写字母表示极显著差异(p≤0.01)。
图3为NtWRKY45超表达转基因烟草T0代部分鉴定结果。a)DNA水平上的鉴定；b)RNA水平上的鉴定；M：DL2,000DNA Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；其余泳道为以T0代植株个体的DNA或sscDNA为模板的扩增产物。
图4为NtWRKY45超表达转基因烟草接种青枯菌的表型。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1转录因子NtWRKY45基因获取和构建NtWRKY45超量表达载体
基于实验室前期烟草基因芯片数据分析结果，获得了一个受青枯菌诱导在抗、感青枯病烟草品种中均上调表达的WRKY类转录因子基因，命名为NtWRKY45(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。
在中国烟草数据库中比对分析获得该基因的CDS序列。
根据NtWRKY45全长基因CDS序列，设计特异性引物：
NtWRKY45-attB1-F:
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-ACCATGGAGAATCAGTCGATGC，(SEQ ID NO.3)；
NtWRKY45-attB2-R:
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-ATGGGGAGGAATAATATGCATC，(SEQ ID NO.4)
以抗青枯病烟草岩烟97叶片cDNA为模板进行PCR扩增，采用TAKARA公司高保真酶LA进行扩增，PCR反应体系：1μL的cDNA为模板，2μL的10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+plus)，1.5μL的dNTP Mixture(2.5mM)，0.1μL的LA Taq，正反引物各0.5μL，补水至20μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，28个循环。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测后切胶纯化回收，将目的基因片段与pDONR207空载连接进行BP反应：纯化后的NtWRKY45产物1μL(80～100ng)，pDONR207空载体1μL，BP酶0.25μL，25℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。
将测序正确的克隆提取质粒，构建入门载体pDONR207-NtWRKY45。将入门载体质粒和植物超量表达载体pEarleyGate205进行LR反应：pDONR207-NtWRKY45质粒1μL(80～100ng)，pEarleyGate205空载1μL(80～100ng)，LR酶0.25μL，25℃连接过夜，转化大肠杆菌，验证阳性克隆，构建植物超表达载体p35S::NtWRKY45-TAP。其中，p35S::NtWRKY45-TAP超量表达载体的构建过程示意图如图1所示。
实施例2NtWRKY45在抗、感青枯病烟草品种青枯菌侵染后的表达模式分析
为了分析NtWRKY45基因在抗、感青枯病烟草品种响应青枯菌侵染的表达差异，本实施例方案分别接种青枯病菌处理高抗青枯病的烟草品种岩烟97(YY97)和易感青枯病的烟草品种红花大金元(HD)植株的倒2、倒3功能叶，放在28℃温室中培养，每个处理设三个生物学重复。分别以8个不同时间点(0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h)取样，采取实时荧光定量PCR方法分析NtWRKY45受青枯菌诱导的表达情况。
设计该NtWRKY45基因的荧光定量PCR引物：
NtWRKY45-qPCR-F：CAACAACTACCCAAGAAGCTACTAC，SEQ ID NO.5
NtWRKY45-qPCR-R：CTTGTCAATAGGATGAGTGTGCATG，SEQ ID NO.6。
采用CTAB法提取青枯菌侵染前后烟草叶片总RNA，根据PrimeScriptTMReverseTranscriptase逆转录酶(TAKARA)说明书将1μg的总RNA进行逆转录合成单链cDNA，将单链cDNA稀释10倍，2μL为模板，以NtEF1α为内参基因(NtEF1α-F：TGCTGCTGTAACAAGATGGATGC(SEQ ID NO.7)，NtEF1α-R：GAGATGGGGACAAAGGGGATT(SEQ ID NO.8))，采用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行定量PCR反应，按照TAKARA公司Premix Ex TaqTM试剂盒方案操作，20μL的反应体系包括10μL 2×SYBR Premix Ex-Taq buffer，正反引物各0.5μL，补水到20μL。qRT-PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃15s，60℃15s，72℃30s，40个循环。相对表达量采用2-△△Ct(Livak)法计算。其中△△Ct＝(CTgene-CTactin)处理-(CTgene-CTactin)对照。结果显示YY97接种青枯菌后，NtWRKY45基因表达量持续上调，在24h出现了表达高峰，最大至21.10倍，而后开始下调，96h下调至2倍。在感病品种中，初始阶段也是上调，但在24h略微下调，然后在48h上调至最大达14.65倍。经分析，NtWRKY45基因在抗、感品种中均上调表达，但在抗病品种YY97中上调倍数更大(图2)。
实施例3超量表达NtWRKY45转基因烟草对青枯菌的抗性分析
将实施例1中超表达载体p35S::NtWRKY45-TAP转化农杆菌GV3101，通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化至感青枯病烟草红花大金元，通过卡那霉素筛选和转基因分子鉴定获得阳性转基因株系。为了验证该基因是否重组到烟草基因组上，采用Trans-35sfwd(TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG(SEQ ID NO.9))和NtWRKY45#trans-R(CTTGTCAATAGGATGAGTGTGCATG(SEQ ID NO.10))引物对转基因植株进行DNA(图3a)和RNA(图3b)水平验证，获得了71株阳性植株；经统计分析，T0代转基因植株阳性率为93.4％。
通过叶脉注射法对野生型和T0代转基因烟草进行青枯菌接种处理，置于高温高湿条件下生长以便青枯菌发病，18d后观察发病情况。根据烟草青枯病发病程度等级统计野生型与转基因烟草的发病情况，并根据所得数据计算各自的病情指数。结果表明NtWRKY45基因超量表达转基因烟草植株相对于野生型对照对青枯菌的抗性显著增强，野生型烟草出现整株萎蔫甚至死亡，表明过表达NtWRKY45可以明显增强烟草对青枯病的抗性(图4)。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种烟草WRKY转录因子NtWRKY45，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述的烟草WRKY转录因子NtWRKY45的基因，其特征在于，其为NtWRKY45基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种超量表达载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的NtWRKY45基因。
4.一种烟草WRKY转录因子NtWRKY45基因的超量表达载体构建方法，其特征在于，其包括：基于Gateway系统通过BP反应构建入门载体pDONR207-NtWRKY45，再经过LR反应构建CaMV 35S启动子驱动的植物表达载体p35S::NtWRKY45-TAP。
5.如权利要求1所述的烟草WRKY转录因子NtWRKY45或编码其的基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
6.如权利要求3所述的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
7.如权利要求4所述的构建方法构建所得的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。
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