CN117752016A - 槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和饮水剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物饲料技术领域，具体涉及槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和饮水剂中的应用。本发明以槟榔产品作为唯一活性成分，将槟榔产品与非洲猪瘟病毒悬液混合后接种细胞，经体外细胞实验评价，发现以槟榔产品作为唯一活性成分对非洲猪瘟病毒具有良好的杀灭效果，30分钟可以100％杀灭病毒滴度为5×103HAD50/mL的非洲猪瘟病毒，2小时内可以100％杀灭病毒滴度为5×104HAD50/mL的非洲猪瘟病毒。将槟榔产品作为添加剂添加到饲料或水中，能够阻断非洲猪瘟病毒通过饲料和饮水传播，且方法简单，成本可控，为非洲猪瘟防控生物安全提供了有效措施。
Description
本申请要求于2023年03月13日已提交中国专利局、申请号为CN202310231797.5、发明名称为“槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和/或饮水剂中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于生物饲料技术领域，具体涉及槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和/或饮水剂中的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，猪感染ASFV后的发病率和死亡率可高达100％。目前，还出现多种低致死率的非洲猪瘟病毒变异株，临床表现具有隐蔽性，但仍存在水平传播风险，造成持续感染、慢性病程甚至死亡，进一步增加了其疫病防控复杂性和难度。对于病毒性疫病的防控策略，一直以来首选疫苗接种，但到目前为止，还没有预防非洲猪瘟的商品化疫苗。
非洲猪瘟病毒最主要的传播途径是经口传播，而污染的猪饲料和水源是其主要传播媒介。如何阻断非洲猪瘟病毒通过饲料媒介传播，目前采用的有效生物安全方法是85℃、3分钟高温制粒，杀灭饲料中的病毒，此方法投资巨大，生产效率显著下降，每吨饲料增加成本80元左右，而且还会破坏饲料中的热敏营养成分，如多种维生素等。相比饲料媒介传播而言，非洲猪瘟病毒通过饮水传播其感染阈值更低，风险更高，因此，猪场水源受污染更容易造成猪群感染发病。如何阻断非洲猪瘟病毒通过饮水媒介传播，目前普遍采用的方法是在饮水中添加消毒剂(如过硫酸氢钾或次氯酸钠)或者酸化剂，目前暂无任何研究证实酸化剂对非洲猪瘟病毒有完全杀灭效果，而消毒剂需要达到一定浓度才能杀灭非洲猪瘟病毒，较高浓度的化学消毒剂长期添加到饮水中，其势必会对猪群口腔和肠道黏膜造成损伤以及扰乱肠道菌群，导致猪群更易感染发病。
槟榔为棕榈科槟榔属常绿乔木，其生长地域主要分布于我国南部热带、亚热带地区以及其他南亚、东南亚等国家，是我国传统的道地药材和重要药用植物之一，其种子、果皮、花等均可入药。槟榔原果含有多种生理活性成分，主要包括生物碱、多酚类、多糖以及脂肪酸等。现代研究表明，槟榔的药理作用十分广泛，具有促消化、抗氧化、抗炎、抗寄生虫和抑菌等多种生物学活性，对人体的消化系统、神经系统、心血管系统、内分泌系统均有一定影响。但关于槟榔及其提取物对非洲猪瘟病毒杀灭效果的研究还未发现。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和/或饮水剂中的应用，将槟榔产品添加到饲料或水源中，杀灭饲料和饮水中非洲猪瘟病毒，切断非洲猪瘟通过饲料和饮水传播。
本发明提供了槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和/或饮水剂中的应用。
优选的，所述槟榔产品包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉。
优选的，所述槟榔提取物中多酚含量为2％～30％；
所述槟榔超微粉为目数≥80目的筛网的筛下物。
优选的，所述槟榔提取物的制备方法包括如下步骤：
将槟榔原料与提取溶剂混合，提取，收集槟榔提取液；
对所述槟榔提取液进行干燥处理，得到所述槟榔提取物。
优选的，所述槟榔原料与提取溶剂的质量体积比为1g：(8～35)mL；
所述干燥处理的温度为65～75℃，时间为72～96h。
优选的，所述提取溶剂为水、甲醇和质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液中的任意一种，进一步优选为水或质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液，更优选为水。
当所述提取溶剂为水时，所述提取的方式包括水浴提取。本发明所述水浴提取的温度优选为60～90℃，进一步优选为90℃；所述水浴提取的时间优选为1～3h，进一步优选为2h。
当所述提取溶剂为甲醇时，所述提取的方式包括超声提取。本发明所述超声提取的频率优选为60～100Hz，时间优选为15～30min；
当所述提取溶剂为盐酸质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液时，所述提取的方式包括：将所述槟榔原料与盐酸质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液混合，浸泡1h后装渗滤柱，用盐酸质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水渗滤提取。
本发明还提供了一种防控非洲猪瘟的生物饲料，由槟榔产品和基础饲料组成；
所述基础饲料包括全价饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的任意一种或多种。
优选的，所述槟榔产品包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉；
所述槟榔提取物中多酚含量为2％～30％；
当所述槟榔产品为槟榔提取物时，每1吨全价饲料添加25g～400g所述槟榔提取物；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉时，每1吨全价饲料添加125g～2000g所述槟榔超微粉；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉和槟榔提取物时，每1吨全价饲料添加60～1000g所述槟榔超微粉和10～200g所述槟榔提取物。
本发明还提供了一种防控非洲猪瘟的饮水剂，由槟榔产品和水组成。
优选的，所述槟榔产品包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉；
所述槟榔提取物中多酚含量为2％～30％；
当所述槟榔产品为槟榔提取物时，每1吨水添加25g～400g所述槟榔提取物；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉时，每1吨水添加125g～2000g所述槟榔超微粉；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉和槟榔提取物时，每1吨水添加60～1000g所述槟榔超微粉和10～200g所述槟榔提取物。
有益效果：
本发明模拟猪场的饲料和饮水的条件，将槟榔产品与非洲猪瘟病毒悬液混合后接种细胞，经体外细胞实验评价，发现以槟榔产品作为唯一活性成分对非洲猪瘟病毒具有良好的杀灭效果，30分钟可以100％杀灭病毒滴度为5×103HAD50/mL非洲猪瘟病毒，2小时内可以100％杀灭病毒滴度为5×104HAD50/mL非洲猪瘟病毒。将槟榔产品作为添加剂用于饲料工业企业或养殖场自配饲料、饮水以及环境消杀，不需增加昂贵的高温制粒设备以及供水设施改造，应用方便，能够有效切断非洲猪瘟病毒通过饲料和饮水的传播，为非洲猪瘟防控提供了重要的生物安全措施。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为HAD检测的阳性对照，具体为实施例7中第五组直接利用病毒原液孵育细胞后的HAD检测结果；
图2为HAD检测的阴性对照，具体为实施例7中第七组PBS溶液孵育细胞2h后的HAD检测结果；
图3为实施例7中第三组利用浓度为50ppm的槟榔提取物BL-5(混合后实际工作浓度25ppm)在4℃条件下灭活病毒2h后再孵育细胞2h的HAD检测结果；
图4为实施例7中第四组利用浓度为50ppm的槟榔提取物BL-5(混合后实际工作浓度25ppm)在25℃条件下灭活病毒2h后再孵育细胞2h的HAD检测结果；
图5为IFA检测的阳性对照，具体为实施例7中第五组直接利用病毒原液孵育细胞后的IFA检测结果；
图6为IFA检测的阴性对照，具体为实施例7中第七组PBS溶液孵育细胞2h后的IFA检测结果；
图7为实施例7中第三组利用浓度为50ppm的槟榔提取物BL-5(混合后实际工作浓度25ppm)在4℃条件下灭活病毒2h后再孵育细胞2h的IFA检测结果；
图8为实施例7中第四组利用浓度为50ppm的槟榔提取物BL-5(混合后实际工作浓度25ppm)在25℃条件下灭活病毒2h后再孵育细胞2h的IFA检测结果；
其中，图5～8从左到右依次为DAPI染色结果、非洲猪瘟病毒P30蛋白荧光染色结果和DAPI染色与荧光染色的融合图，标尺100um。
具体实施方式
本发明提供了槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和/或饮水剂中的应用。
在本发明中，所述槟榔产品优选包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉，进一步优选为槟榔提取物。本发明所述槟榔提取物优选为槟榔水提取物；所述槟榔提取物中多酚含量优选为2％～30％，进一步优选为8.8％～30％，再优选为10.72％～24.01％，更优选为13.67％～19.56％，最优选为18.80％；所述槟榔超微粉优选为目数≥80目的筛网的筛下物。
本发明对将所述槟榔产品添加到饲料或水中的方式没有严格要求，预混剂或散剂的形式添加到饲料中或日常饮水中均可。
本发明对所述槟榔提取物或槟榔超微粉的来源均没有严格要求，可直接购买或者自行制备。本发明优选采用自行制备的方式获得所述槟榔提取物。本发明所述槟榔提取物的制备方法优选包括如下步骤：
将槟榔原料与提取溶剂混合，提取，收集槟榔提取液；
对所述槟榔提取液进行干燥处理，得到所述槟榔提取物。
本发明将槟榔原料与提取溶剂混合，提取，收集槟榔提取液。在本发明中，所述槟榔原料优选包括槟榔鲜果和/或槟榔干果；本发明对所述槟榔鲜果或槟榔干果的成熟度没有严格要求，任意成熟度均可；本发明所述槟榔原料与提取溶剂的质量体积比优选为1g：(8～35)mL，进一步优选为1g：(10～20)mL，更优选为1g：(15～20)mL，最优选为1g：20mL。本发明优选用粉碎机粉碎所述槟榔原料，将槟榔粉碎物与水混合进行提取。本发明收集所述槟榔提取液的方式优选为过滤。
在本发明中，所述提取溶剂优选为水、甲醇和质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液中的任意一种，进一步优选为水或质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液，更优选为水。本发明所述甲醇优选为体积浓度为50％的甲醇。
当所述提取溶剂为水时，本发明所述提取的方式优选包括水浴提取；所述水浴提取的温度优选为60～90℃，进一步优选为90℃；所述水浴提取的时间优选为1～3h，进一步优选为2h。
当所述提取溶剂为甲醇时，本发明所述超声提取的频率优选为60～100Hz，进一步优选为70Hz，时间优选为15～30min，进一步优选为20min。
当所述提取溶剂为质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液时，本发明所述提取的方式优选包括：将所述槟榔原料与质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液混合，浸泡1h后装渗滤柱，用质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水渗滤提取。
得到所述槟榔提取液后，本发明优选对所述槟榔浓缩液进行干燥处理。在本发明中，所述干燥处理的温度优选为65～75℃，进一步优选为70℃；所述干燥处理的时间优选为72～96h，进一步优选为75～90h，更优选为80～85h。
本发明对所述槟榔提取液进行干燥处理前，优选对所述槟榔提取液进行浓缩处理。本发明所述浓缩的方式优选为真空减压浓缩。本发明所述浓缩的倍数优选为30～35倍，进一步优选为32倍。本发明对所述浓缩的具体参数条件没有严格要求，只要能够浓缩至滤液体积的1/30～1/35即可。当所述提取溶剂为盐酸质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液时，本发明优选进行浓缩处理前，将槟榔提取液过732型阳离子吸附柱，得阳离子吸附柱流出液。
本发明模拟养猪产业饲料和饮水的被高载量病毒污染的情况，以槟榔产品为唯一活性成分，将产品进行非洲猪瘟病毒灭活实验，发现槟榔产品可以对非洲猪瘟病毒具有良好的杀灭效果。
本发明还提供了一种防控非洲猪瘟的生物饲料，由槟榔产品和基础饲料组成；所述基础饲料包括全价饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的任意一种或多种。
在本发明中，所述基础饲料包括全价饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的任意一种或多种，进一步优选为全价饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的任意一种。
当所述基础饲料为全价饲料时，本发明优选直接将所述槟榔产品添加到全价饲料中，得到所述生物饲料。本发明所述槟榔产品优选包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉。当所述槟榔产品为槟榔提取物时，本发明优选每1吨全价饲料添加25g～400g所述槟榔提取物，进一步优选为125g～300g，更优选为150g～200g。本发明在添加槟榔提取物时，优选在25g～400g的范围内任意选值，例如25g、28g、30g、40g、50g、55g、60g、80g、100g、125g、130g、145g、150g、180g、195g、200g、230g、250g、260g、280g、300g、350g、360g、380g或400g。当所述槟榔产品为槟榔超微粉时，本发明优选每1吨全价饲料添加125g～2000g所述槟榔超微粉，进一步优选为250g～1500g，更优选为400g～1200g，最优选为800g～1200g。本发明在添加槟榔超微粉时，优选在125g～2000g的范围内任意选值。当所述槟榔产品为槟榔提取物和槟榔超微粉时，本发明优选每1吨全价饲料添加60～1000g所述槟榔超微粉和10～200g所述槟榔提取物。每吨全价饲料中所述槟榔超微粉的添加量优选为100～800g，进一步优选为200～600g更优选为400～600g；每吨全价饲料中所述槟榔提取物的添加量优选为40～180g，进一步优选为60～140g，更优选为80～140g或120g。
当所述基础饲料为浓缩饲料时，本发明优选根据浓缩饲料的浓缩倍数，以及上述全价饲料中需要添加的槟榔产品质量，将槟榔产品添加到所述浓缩饲料中，得到所述生物饲料。当所述浓缩倍数为N，且当1吨全价饲料中需要添加Xg槟榔产品时，每吨浓缩饲料添加NXg槟榔产品，得到所述生物饲料。本发明所述浓缩倍数优选为3～5倍。本发明所述生物饲料可以单独售卖、可以与其他成分例如能量饲料混合制备成全价饲料后售卖。当本发明制备全价饲料时，优选每吨全价饲料添加Xg所述槟榔产品。
当所述基础饲料为预混合饲料时，本发明优选根据预混合饲料的浓缩倍数，以及上述全价饲料中需要添加的槟榔产品质量，将槟榔产品添加到所述预混合饲料中，得到所述生物饲料。当所述预混合饲料浓缩倍数为N，且当1吨全价饲料中需要添加Xg槟榔产品时，每吨预混合饲料添加NXg槟榔产品，得到所述生物饲料。本发明所述浓缩倍数优选为20～25倍。本发明所述生物饲料可以单独售卖、可以与其他成分混合制备成全价饲料后售卖。当本发明制备全价饲料时，优选每吨全价饲料添加Xg所述槟榔产品。
本发明对所述全价饲料、浓缩饲料和预混合饲料的来源没有严格要求，常规购买或自行配制即可。
本发明优选提供了上述生物饲料的制备方法，优选包括如下步骤：将所述槟榔产品与基础饲料混合，静置0.5h～3h，得到所述饲料，进一步优选为静置1～2h。
本发明在基础饲料中添加槟榔产品，能够杀灭饲料中可能污染的非洲猪瘟病毒，阻断非洲猪瘟病毒通过饲料媒介传播，防控非洲猪瘟。
本发明还提供了一种防控非洲猪瘟的饮水剂，由槟榔产品和水组成。
在本发明中，所述槟榔产品优选包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉。当所述槟榔产品为槟榔提取物时，本发明优选每1吨水添加25g～400g所述槟榔提取物，进一步优选为125g～200g，更优选为150g。本发明在添加槟榔提取物时，优选在25g～400g的范围内任意选值，例如25g、28g、30g、40g、50g、55g、60g、80g、100g、125g、130g、145g、150g、180g、195g、200g、230g、250g、260g、280g、300g、350g、360g、380g或400g。
当所述槟榔产品为槟榔超微粉时，本发明优选每1吨水添加125g～2000g所述槟榔超微粉，进一步优选为250g～1500g，更优选为400g～1200g，最优选为800g～1200g。本发明在添加槟榔超微粉时，优选在125g～2000g的范围内任意选值。
当所述槟榔产品为槟榔提取物和槟榔超微粉时，本发明优选每1吨水添加60～1000g所述槟榔超微粉和10～200g所述槟榔提取物。每吨饮水添加所述槟榔超微粉优选为100～800g，进一步优选为200～600g更优选为400～600g；每吨饮水中添加所述槟榔提取物的添加量优选为40～180g，进一步优选为60～140g，更优选为80～140g或120g。
本发明优选提供了上述饮水剂的制备方法，优选包括如下步骤：将槟榔提取物与水混合，静置0.5～3h，得到所述水剂，进一步优选为静置1～2h；或者优选包括如下步骤：将槟榔超微粉放入滤袋，浸泡于水中12h及以上，得到所述水剂。
本发明在水中添加槟榔产品，得到的水剂可直接作为动物的饮用水，杀灭了饮用水中可能污染的非洲猪瘟病毒，阻断非洲猪瘟病毒通过水媒介传播，防控非洲猪瘟；也可将所述水剂喷涂于猪舍环境，阻断非洲猪瘟病毒通过环境媒介传播，防控非洲猪瘟。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和/或饮水剂中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
槟榔提取物的制备，由如下步骤组成：
(1)将槟榔饮片用粉碎机粉碎后，得到槟榔粉碎物；
(2)将槟榔粉碎物和50％甲醇按照1g：20mL的质量体积比混合，在70Hz条件下超声20min，得到超声提取液，将超声提取液过滤得到槟榔提取液；
(3)采用真空减压浓缩的方式将槟榔提取液浓缩至滤液体积的1/30，70℃干燥72～96h，得到所述槟榔提取物。
实施例2
槟榔提取物的制备，由如下步骤组成：
(1)将槟榔干果用粉碎机粉碎，得到槟榔粉碎物；
(2)将槟榔粉碎物和水按照1g：25mL的质量体积比混合，在80℃的水浴条件下提取1h，过滤，得到槟榔提取液；
(3)采用真空减压浓缩的方式将槟榔提取液浓缩至滤液体积的1/35，70℃干燥72～96h，得到所述槟榔提取物。
实施例3
槟榔提取物的制备，由如下步骤组成：
(1)将槟榔干果用粉碎机粉碎，得到槟榔粉碎物；
(2)将槟榔粉碎物和质量浓度为0.5％的盐酸水按照1g：10mL的质量体积比混合浸泡1h后装渗滤柱，用3000mL质量浓度为0.5％的盐酸水渗滤提取，得到槟榔盐酸滤出液；
(3)将槟榔盐酸滤出液过400mL 732型阳离子吸附柱，得阳离子吸附柱流出液；
(4)用1％氢氧化钠溶液将流出液的pH值调至7，采用真空减压浓缩的方式将流出液浓缩至总体积的1/40，70℃干燥72～96h，得到槟榔提取物。
实施例4
同实施例2，唯一区别在于，步骤(2)将槟榔粉碎物和水按照1g：15mL的质量体积比混合。
实施例5
同实施例3，唯一区别在于，步骤(2)将槟榔粉碎物和质量浓度为0.2％的盐酸水按照1g：10mL的质量体积比混合浸泡1h后装渗滤柱，用3000mL质量浓度为0.2％的盐酸水渗滤提取，得到槟榔盐酸滤出液。
测试例1
利用液相色谱和福林酚法，分析实施例1～5得到的槟榔提取物成分的含量，结果如表1。
表1实施例1～5得到的槟榔提取物成分及含量检测结果
根据表1可以看出，本发明得到的槟榔提取物中总酚含量为10.72％～24.01％，总碱含量为0.044％～1.57％。
实施例6
模拟养猪产业饲料和饮水被高载量病毒污染的情况，以水为溶剂，将实施例1制备的槟榔提取物制备成400ppm、800ppm和1600ppm三个浓度，其中1ppm表示即1L的水中添加1mg槟榔提取物。
和国家非洲猪瘟区域实验室(广州)合作，将槟榔提取物进行非洲猪瘟病毒灭活实验，本次实验非洲猪瘟病毒浓度为104HAD50/mL。
具体实验步骤如下：
(1)试验分组：槟榔提取物与病毒悬液作用，每组4个重复实验。
第一组：4℃环境下，槟榔提取物和非洲猪瘟病毒悬液混合30min、1h、2h和3h，得到不同灭活病毒时间的试样，分别将不同灭活病毒时间的试样稀释100倍，接种至细胞；
第二组：25℃环境下，槟榔提取物和非洲猪瘟病毒悬液混合30min、1h、2h和3h，得到不同灭活病毒时间的试样，分别将不同灭活病毒时间的试样稀释100倍，接种至细胞；
第三组：4℃环境下，非洲猪瘟病毒悬液原液、稀释10倍、100倍、1000倍和10000倍，得到不同浓度的病毒液，接种至细胞；
第四组：25℃环境下，非洲猪瘟病毒悬液原液、稀释10倍、100倍、1000倍和10000倍，得到不同浓度的病毒液，接种至细胞；
第五组：4℃环境下，PBS溶液接种细胞；
第六组：25℃环境下，PBS溶液接种细胞。
(2)将PAMs细胞铺96孔板，第一组取400ppm、800ppm、1600ppm浓度的槟榔提取物0.5mL，分别在4℃环境下与0.5mL病毒悬液反应，待作用至上述分组预定灭活病毒时间(即反应30min、1h、2h、3h)，将反应产物稀释100倍；按照200μL/孔的接种量接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第二组取400ppm、800ppm、1600ppm浓度的槟榔提取物0.5mL，分别在25℃环境下与0.5mL病毒悬液反应，待作用至上述分组预定灭活病毒时间(即反应30min、1h、2h、3h)，将反应产物稀释100倍；按照200μL/孔的接种量接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第三组按照200μL/孔的接种量，4℃环境下，将不同浓度的病毒液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第四组按照200μL/孔的接种量，25℃环境下，将不同浓度的病毒液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第五组按照200μL/孔的接种量，4℃环境下，将PBS溶液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养。
第六组按照200μL/孔的接种量，25℃环境下，将PBS溶液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养。
上述细胞维持培养液由10％胎牛血清、100U·mL-1青霉素、100U·mL-1链霉素和余量的RPMI-1640培养基组成，其中胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基、青霉素(细胞培养级别)、链霉素(细胞培养级别)均购自Gibco公司。
(3)步骤(2)培养48h，此时PAMs细胞的浓度约为96孔板70％～80％，由非洲猪瘟区域实验室(广州)进行红细胞吸附试验(HAD)，结果如表2所示。
表2红细胞吸附(HAD)结果
注：“-”和“+”分别表示HAD阴性和阳性。
根据表2可以看出，实际工作浓度最低为200ppm的槟榔提取物在30分钟内可以有效杀灭病毒滴度为5×103HAD50/mL非洲猪瘟病毒，红细胞吸附(HAD)试验结果显示病毒为阴性。
实施例7
模拟养猪产业饲料和饮水被高载量病毒污染的情况，以水为溶剂，将实施例2制备的槟榔提取物(记为BL-1)制备成400ppm、200ppm和100ppm三个浓度；将实施例3制备的槟榔提取物(记为BL-5)制备成200ppm、100ppm和50ppm三个浓度，与国家非洲猪瘟区域实验室(广州)合作，将槟榔提取物进行非洲猪瘟病毒灭活实验，本次实验非洲猪瘟病毒浓度为105HAD50/mL。
具体实验步骤如下：
(1)试验分组：槟榔提取物与病毒悬液作用，每组4个重复实验。
第一组：4℃环境下，槟榔提取物BL-1和非洲猪瘟病毒悬液混合2h，稀释100倍，接种细胞；
第二组：25℃环境下，槟榔提取物BL-1和非洲猪瘟病毒悬液混合2h，稀释100倍，接种细胞；
第三组：4℃环境下，槟榔提取物BL-5和非洲猪瘟病毒悬液混合2h，稀释100倍，接种细胞；
第四组：25℃环境下，槟榔提取物BL-5和非洲猪瘟病毒悬液混合2h，稀释100倍，接种细胞；
第五组：4℃环境下，非洲猪瘟病毒悬液原液、稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，接种细胞；
第六组：25℃环境下，非洲猪瘟病毒悬液原液、稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，接种细胞；
第七组：4℃环境下，PBS溶液接种细胞；
第八组：25℃环境下，PBS溶液接种细胞。
(2)将PAMs细胞铺96孔板，第一组取不同浓度的槟榔提取物0.5mL，分别在4℃环境下与0.5mL病毒悬液反应，待作用至上述分组预定灭活病毒时间(即2h)，将反应产物稀释100倍；按照200μL/孔的接种量接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第二组取不同浓度的槟榔提取物0.5mL，分别在25℃环境下与0.5mL病毒悬液反应，待作用至上述分组预定灭活病毒时间(即反应2h)，将反应产物稀释100倍；按照200μL/孔的接种量接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第三组取不同浓度的槟榔提取物0.5mL，分别在4℃环境下与0.5mL病毒悬液反应，待作用至上述分组预定灭活病毒时间(即2h)，将反应产物稀释100倍；按照200μL/孔的接种量接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第四组取不同浓度的槟榔提取物0.5mL，分别在25℃环境下与0.5mL病毒悬液反应，待作用至上述分组预定灭活病毒时间(即反应2h)，将反应产物稀释100倍；按照200μL/孔的接种量接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第五组按照200μL/孔的接种量，4℃环境下，将不同浓度的病毒液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第六组按照200μL/孔的接种量，25℃环境下，将不同浓度的病毒液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第七组按照200μL/孔的接种量，4℃环境下，将PBS溶液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
第八组按照200μL/孔的接种量，25℃环境下，将PBS溶液接种到含有PAMs细胞的96孔板上，孵育2h，吸去反应产物，另加细胞维持培养液，置于5％CO2的37℃培养箱中培养；
细胞维持培养液由10％胎牛血清、100U·mL-1青霉素、100U·mL-1链霉素和余量的RPMI-1640培养基组成，其中为胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基、青霉素(细胞培养级别)、链霉素(细胞培养级别)均购自Gibco公司。
(3)步骤(2)培养48h，此时PAMs细胞的浓度约为96孔板70％-80％，由非洲猪瘟区域实验室(广州)进行红细胞吸附试验(HAD)和间接免疫荧光实验(IFA)，结果如表3所示。
由于利用BL-1处理和与BL-5处理在不同温度下3个浓度试验组中结果相似，并且分组过多，考虑篇幅问题，提供部分HAD检测结果(如图1～4所示)和部分IFA检测结果(如图5～8)，其中图1和图5为阳性对照，具体为第五组直接利用病毒原液孵育细胞后的检测结果(4℃-无槟榔提取物)；图2和图6为阴性对照，具体为第七组PBS溶液孵育细胞2h后的结果(4℃-无病毒)；图3和图7为第三组利用浓度为50ppm的槟榔提取物BL-5(混合后实际工作浓度25ppm)灭活病毒2h后再孵育细胞2h的检测结果(4℃-2h灭活)，图4和图8具体为第四组利用浓度为50ppm的槟榔提取物BL-5(混合后实际工作浓度25ppm)与病毒灭活2h后再孵育细胞2h的检测结果(25℃-2h灭活)；图5～8从左到右依次为DAPI染色结果、非洲猪瘟病毒P30蛋白荧光染色结果和DAPI染色与荧光染色的融合图。
表3红细胞吸附(HAD)结果
注：“-”表示HAD和IFA均为阴性，“+”分别表示HAD和IFA均为阳性。
根据图5～8可以看出，第五组处理方式下PAMs细胞核中存在绿色荧光，表示存在非洲猪瘟病毒，而其他处理方式下，没有荧光信号生成，结合表3，可以看出，在4℃和25℃的条件下，实际工作浓度最低为50ppm的槟榔提取物BL-1或实际工作浓度最低为25ppm的槟榔提取物BL-5在2小时内均可100％杀灭病毒滴度为5×104HAD50/mL非洲猪瘟病毒。
实施例8
每吨全价饲料添加25g实施例1～5中的任意一种槟榔提取物，得到5种生物饲料，具体如下：
第1种生物饲料：每吨全价饲料添加25g实施例1中的槟榔提取物；
第2种生物饲料：每吨全价饲料添加25g实施例2中的槟榔提取物；
第3种生物饲料：每吨全价饲料添加25g实施例3中的槟榔提取物；
第4种生物饲料：每吨全价饲料添加25g实施例4中的槟榔提取物；
第5种生物饲料：每吨全价饲料添加25g实施例5中的槟榔提取物；
以下实施例均采用相同表述。
实施例9
每吨全价饲料添加200g实施例1～5中的任意一种槟榔提取物，得到5种生物饲料。
实施例10
每吨全价饲料添加400g实施例1～5中的任意一种槟榔提取物，得到5种生物饲料。
实施例11
每吨全价饲料添加125g槟榔超微粉(80目及以上)，得到5种生物饲料。
实施例12
每吨全价饲料添加1000g槟榔超微粉(80目及以上)，得到5种生物饲料。
实施例13
每吨全价饲料添加2000g槟榔超微粉(80目及以上)，得到5种生物饲料。
实施例14
每吨浓缩倍数为5倍的浓缩饲料中添加125g实施例1～5中的任意槟榔提取物，得到5种生物饲料，将生物饲料和能量饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/5，即每吨全价饲料中添加的槟榔提取物为25g。
实施例15
每吨浓缩倍数为5倍的浓缩饲料中添加625g实施例1～5中的任意槟榔提取物，得到5种生物饲料，将生物饲料和能量饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/5，即每吨全价饲料中添加的槟榔提取物为125g。
实施例16
每吨浓缩倍数为5倍的浓缩饲料中添加2000g实施例1～5中的任意槟榔提取物，得到5种生物饲料，将生物饲料和能量饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/5，即每吨全价饲料中添加的槟榔提取物为400g。
实施例17
每吨浓缩倍数为5倍的浓缩饲料中添加625g槟榔超微粉(80目及以上)，得到生物饲料，将生物饲料和能量饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/5，即每吨全价饲料中添加的槟榔超微粉(80目及以上)为125g。
实施例18
每吨浓缩倍数为5倍的浓缩饲料中添加3125g槟榔超微粉(80目及以上)，得到生物饲料，将生物饲料和能量饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/5，即每吨全价饲料中添加的槟榔超微粉(80目及以上)为625g。
实施例19
每吨浓缩倍数为5倍的浓缩饲料中添加10000g槟榔超微粉(80目及以上)，得到生物饲料，将生物饲料和能量饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/5，即每吨全价饲料中添加的槟榔超微粉(80目及以上)为2000g。
实施例20
每吨浓缩倍数为25倍的预混合饲料中添加625g实施例1～5中的任意槟榔提取物，得到5种生物饲料，将生物饲料和能量饲料、蛋白质饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/25，即每吨全价饲料中添加的槟榔提取物为25g。
实施例21
每吨浓缩倍数为25倍的预混合饲料中添加10000g实施例1～5中的任意槟榔提取物，得到5种生物饲料，将生物饲料和能量饲料、蛋白质饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/25，即每吨全价饲料中添加的槟榔提取物为400g。
实施例22
每吨浓缩倍数为25倍的预混合饲料中添加3125g实施例1～5中的任意槟榔提取物，得到5种生物饲料，将生物饲料和能量饲料、蛋白质饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/25，即每吨全价饲料中添加的槟榔提取物为125g。
实施例23
每吨浓缩倍数为25倍的预混合饲料中添加10000g槟榔超微粉(80目及以上)，得到生物饲料，将生物饲料和能量饲料、蛋白质饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/25，即每吨全价饲料中添加的槟榔超微粉(80目及以上)为400g。
实施例24
每吨浓缩倍数为25倍的预混合饲料中添加3125g槟榔超微粉(80目及以上)，得到生物饲料，将生物饲料和能量饲料、蛋白质饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/25，即每吨全价饲料中添加的槟榔超微粉(80目及以上)为125g。
实施例25
每吨浓缩倍数为25倍的预混合饲料中添加50000g槟榔超微粉(80目及以上)，得到生物饲料，将生物饲料和能量饲料、蛋白质饲料混合配置成全价饲料时，生物饲料在全价料中的占比为1/25，即每吨全价饲料中添加的槟榔超微粉(80目及以上)为2000g。
实施例26
每吨水加入实施例1～5中的任意槟榔提取物25g，静置2h后自由饮用。
实施例27
每吨水加入实施例1～5中的任意槟榔提取物400g，静置2h后自由饮用。
实施例28
每吨水按槟榔超微粉(80目及以上)125g配比，将槟榔超微粉放入滤袋，浸泡于水中12小时及以上，自由饮用。
实施例29
每吨水按槟榔超微粉(80目及以上)2000g配比，将槟榔超微粉放入滤袋，浸泡于水中12小时及以上，自由饮用。
实施例30
每吨水加入实施例1～5中的任意槟榔提取物25g，喷涂于猪舍环境中。
实施例31
每吨水加入实施例1～5中的任意槟榔提取物400g，喷涂于猪舍环境中。
根据上述内容可以看出，以槟榔产品作为唯一活性成分，能够阻断非洲猪瘟病毒通过饲料和饮水传播，且方法简单，成本可控，为非洲猪瘟防控提供有效措施。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.槟榔产品作为唯一活性成分在制备防控非洲猪瘟的生物饲料和饮水剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述槟榔产品包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述槟榔提取物中多酚含量为2％～30％；
所述槟榔超微粉为目数≥80目的筛网的筛下物。
4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述槟榔提取物的制备方法包括如下步骤：
将槟榔原料与提取溶剂混合，提取，收集槟榔提取液；
对所述槟榔提取液进行干燥处理，得到所述槟榔提取物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
所述槟榔原料与提取溶剂的质量体积比为1g：(8～35)mL；
所述干燥处理的温度为65～75℃，时间为72～96h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提取溶剂为水、甲醇和质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液中的任意一种；
当所述提取溶剂为水时，所述提取的方式包括水浴提取；所述水浴提取的温度为60～90℃，时间为1～3h；
当所述提取溶剂为甲醇时，所述提取的方式包括超声提取；所述超声提取的频率为60～100Hz，时间为15～30min；
当所述提取溶剂为质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液时，所述提取的方式包括：将所述槟榔原料与质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液混合，浸泡1h后装渗滤柱，用质量浓度为0.2～0.5％的盐酸水溶液渗滤提取。
7.一种防控非洲猪瘟的生物饲料，其特征在于，由槟榔产品和基础饲料组成；
所述基础饲料包括全价饲料、浓缩饲料和预混合饲料中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的生物饲料，其特征在于，所述槟榔产品包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉；
所述槟榔提取物中多酚含量为2％～30％；
当所述槟榔产品为槟榔提取物时，每1吨全价饲料添加25g～400g所述槟榔提取物；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉时，每1吨全价饲料添加125g～2000g所述槟榔超微粉；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉和槟榔提取物时，每1吨全价饲料添加60～1000g所述槟榔超微粉和10～200g所述槟榔提取物。
9.一种防控非洲猪瘟的饮水剂，其特征在于，由槟榔产品和水组成。
10.根据权利要求9所述的饮水剂，其特征在于，所述槟榔产品包括槟榔提取物和/或槟榔超微粉；
所述槟榔提取物中多酚含量为2％～30％；
当所述槟榔产品为槟榔提取物时，每1吨水添加25g～400g所述槟榔提取物；
当所述槟榔产品为槟榔超微粉时，每1吨水添加125g～2000g所述槟榔超微粉；
当所述槟榔产品包括槟榔超微粉和槟榔提取物时，每1吨水添加60～1000g所述槟榔超微粉和10～200g所述槟榔提取物。
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