CN117741156A - Ctsl蛋白在作为支原体肺炎诊断标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了CTSL蛋白在作为支原体肺炎诊断标志物中的应用。本发明研究发现通过判断待测对象中CTSL基因的表达情况，可进行支原体肺炎的诊断，为支原体肺炎的诊断提供了新的方法。

Description

CTSL蛋白在作为支原体肺炎诊断标志物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及CTSL蛋白在作为支原体肺炎诊断标志物中的应用。

背景技术

组织蛋白酶L(cathepsin L,CL)属于溶酶体木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶成员,以酶原的形式贮存于溶酶体中，其空间结构主要由α螺旋构成的L结构域以及由β折叠构成的R结构域组成。CTSL基因编码的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在细胞内蛋白质分解代谢中起主要作用。正常情况下，大约10％的酶原分泌至胞质，然后可被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，参与许多生理过程，如激素原的激活、抗原呈递、组织器官的发育等。但在病理状态下，由于各种原因(如病原微生物、炎症因子、氧化应激等)所引起的细胞损伤，会导致溶酶体膜稳定性降低，通透性增高甚至破裂，大量酶原释放到胞质或组织间隙。释放的酶原被激活，会降解细胞组分或细胞间质基质成分(如层粘素、IV型胶原纤维及纤维连接素等)，从而导致疾病的发生。研究发现该过程与人类肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、阿尔茨海姆病、多发性硬化症及其他慢性炎症性等多种疾病有关。

目前对CTSL基因的研究主要集中在人类疾病易感和抗性机制解析等方面。王秀丽团队研究证明过表达miR-379-5p通过靶向CTSL而减弱肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，诱导细胞凋亡。黄朝晖和费伯健研究团队研究发现通过两个基因(CTSL/ZBTB7B)即可鉴定的胃癌高危亚型。杨金奎团队首次阐明了人体组织蛋白酶CTSL激活新冠Spike蛋白的分子机制，并证明在细胞和动物水平以及离体人肺组织中，CTSL抑制剂可有效地抑制新冠病毒感染。Joe E Mouawad等人研究发现，与正常对照组相比，系统性硬化症(SSc)患者肺成纤维细胞和组织表达的CTSL水平显着降低。后续通过实验研究确定CTSL是一种通过激活抗纤维化内皮抑素来防止肺纤维化的蛋白质，通过提高SSc患者CTSL内源性表达水平可以作为一种可行的治疗策略。同时也有学者在畜禽上对CTSL基因进行了研究，认为其与畜禽的生产性能相关。Yamazaki等在小鼠骨骼肌中研究发现，CTSL是FOXO1发挥作用的直接靶基因，阐明了FOXO1/CTSL通路在快速诱导骨骼肌代谢变化和肌萎缩过程中所起的关键作用。栗敏杰等人研究发现CTSL对尧山白山羊肌肉蛋白质可能有负调控作用。但是，CTSL基因与猪支原体肺炎相关联的研究目前没有报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的诊断支原体肺炎的方法。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供CTSL蛋白在作为支原体肺炎诊断标志物中的应用。

本发明研究了CTSL基因(Gene ID:396926)在未感染和已感染猪肺炎支原体的巴马香猪之间的基因表达差异，并通过单细胞分析确定该基因为主要表达的细胞类型，CTSL在猪支原体肺炎期间基因表达量显著提升，可通过判断CTSL基因的表达量来进行支原体肺炎的诊断，并为猪的抗病育种提供了新的基因靶标。

第二方面，本发明提供CTSL蛋白在制备支原体肺炎诊断试剂盒、诊断试剂或芯片中的应用。

第三方面，本发明提供CTSL蛋白或其检测工具在制备支原体肺炎治疗评价体系中的应用。

第四方面，本发明提供CTSL蛋白的检测试剂在制备诊断支原体肺炎产品中的应用。

本发明的上述应用中，所述产品为试剂盒。所述检测试剂包括CTSL基因检测引物。

本发明的上述应用中，通过检测待测肺组织基因组中CTSL基因表达水平来诊断支原体肺炎。

本发明的上述应用中，当待测肺组织基因组中CTSL基因表达水平与阴性对照相比差异显著(P＜0.05)，则判断待测对象患有支原体肺炎；所述阴性对照为正常肺组织。

本发明的上述应用中，待测肺组织来源于猪。

第五方面，本发明提供一种诊断支原体肺炎的产品，所述产品包括检测CTSL基因表达水平的试剂；优选，所述产品为试剂盒。

第六方面，本发明提供一种支原体肺炎治愈的评价体系，其含有检测CTSL蛋白表达量的检测工具；优选，所述检测工具为检测试剂盒、检测试剂和/或检测仪器。

本领域技术人员应当理解，凡是以检测CTSL蛋白的表达量为目的，用于判断待测样品是否来自患有支原体肺炎的个体的诊断试剂盒、评价体系、诊断方法都属于本发明的保护范围。

本发明中，所述检测工具通过蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析、免疫扩散法、免疫组合染色、免疫沉淀分析、补体结合分析、流式细胞荧光分析技术或蛋白芯片进行检测。

本发明中，所述检测工具通过聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析进行检测。

第七方面，本发明提供降低CTSL基因或CTSL蛋白表达的试剂在制备治疗支原体肺炎或缓解支原体肺炎炎性症状中的应用。

本发明的有益效果至少在于：

本发明提供了一种新的诊断支原体肺炎的方法，仅通过判断CTSL基因的表达量变化，即可实现有效诊断，同时为支原体肺炎提供了新的基因靶标。

附图说明

图1为构建的巴马香猪肺脏单细胞图谱。

图2为通过单细胞分析在猪患病期间每种细胞类型变化的情况。

图3为单核细胞在猪患猪肺炎支原体期间细胞数量变化(A)及炎性因子变化情况(B)。对照组，猪无支原体肺炎，攻毒组，猪患支原体肺炎。图中，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

图4为单细胞分析感染猪支原体肺炎期间CTSL基因的表达情况结果(A)和RT-qPCR验证CTSL在猪支原体肺炎期间基因表达的情况(B)。图中，C1、C2为对照组，猪无支原体肺炎，T1、T2为攻毒组，猪患支原体肺炎。**代表P＜0.01。

图5为敲低CTSL基因的情况下，各组CTSL基因表达量(左图)和IL1B基因的表达情况结果(右图)。对照组，猪无支原体肺炎，攻毒组，猪患支原体肺炎。图中，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。

实施例1

1.实验材料

巴马香猪肺脏等组织样收集于江苏省农业科学院兽医研究所。

2.单细胞建库分析

现场采集相关的猪肺脏样品，该样品包括2个无特异性病原的对照组(来自两头健康猪)与2个人工攻毒只携带猪肺炎支原体的肺脏组织(来自两头攻毒猪)，运输到实验室进行剪碎，组织裂解，去红细胞，细胞过滤，细胞计数等相关处理后进行单细胞RNA-seq建库。相关文库按照10×Genomics(北京诺禾致源科技股份有限公司)提供的标准方案制备。从Ensembl数据库下载了FASTA格式的Sscrofa11.1参考基因组和GTF格式的注释基因模型。将原始scRNA-seq数据与猪参考基因组进行比对，并使用Cell Ranger(10×Genomics，CA，USA)推荐的命令进行条形码分配和唯一分子标识符(UMI)计数。过滤后，对剩余的高质量数据进行对数归一化和缩放。随后，使用Scanorama工具进行均匀流形近似和投影(UMAP)可视化方法，以捕获组织的全局细胞类型景观。本发明使用带有默认参数的FindAllMarks函数来识别每个簇的标记基因，并根据大量已发表文献中的已知经典标记注释每种细胞类型。使用ggplot2 R包可视化标记基因在不同细胞类型的表达。

3.单核细胞分离

采集猪血液于含有抗凝剂的采血管中，按照索莱宝猪外周血单核细胞分离液试剂盒(货号：P5270)操作说明分离单核细胞，接种于铺有多聚赖氨酸的6孔板中。

4.引物设计

利用Primer Premier 5软件设计引物进行RT-qPCR实验，siRNA双链来自吉玛基因(上海，中国)。引物序列见表1。

表1

5.RT-qPCR实验

根据产品说明书，使用RNAiso试剂(Takara,Japan)从猪肺脏中提取总RNA，然后使用HiScript III第一链cDNA合成试剂盒(Vazyme,China)将其反转录为互补DNA。使用SYBRGreen Master Mix(Vazyme,China)进行RT-qPCR，并使用2-ΔΔCT方法分析结果。

6.RNA干扰实验

6孔板单核细胞贴壁后，分别取3微升siRNA，加入100ul opti-MEM，充分混匀，制成siRNA稀释液。取9ul HiperFect Transfection Reagent(品牌QIAGEN货号301707)，加入100ul opti-MEM，充分混匀，制成HiperFect Transfection Reagent稀释液。将HiperFectTransfection Reagent稀释液和siRNA稀释液充分混合，室温静置15分钟，加入单核细胞中，孔中剩余空间的用完全培养基补全，培养24小时收集细胞进行后续的RT-qPCR检测。

7.猪肺炎支原体感染细胞

细胞贴壁后，更换含有10％胎牛血清的1640培养基，不含有抗生素，同时接种100MOI猪肺炎支原体，培养24小时收集细胞进行后续的RT-qPCR检测。

8.统计分析

以均数±标准差表示的测量数据使用SPSS统计软件(IBM,Armonk,NY,USA)进行分析。两组间服从正态分布和方差齐性的资料采用wilcox检验进行比较。以P＜0.05确认为有统计学意义。

9.结果

(1)构建了肺部细胞图谱

本发明基于测序的单细胞数据，构建了巴马香猪肺部单细胞图谱。结果参见图1，其为来自巴马香猪4个肺组织的18784个细胞的单细胞数据集的均匀流形近似和投影表示；图中每个点代表一个单元格，单元格被标记为19种离散单元格类型中的一种。

(2)通过单细胞分析在猪患病期间每种细胞类型变化情况

基于以上单细胞数据分析，对每种细胞类型的细胞数目进行统计作图，观察到人工感染猪肺炎支原体的猪在感染期间单核细胞大量增加，结果见图2和图3中的A，图2中C1,C2是对照组，猪无支原体肺炎；T1,T2是攻毒组，猪患支原体肺炎。

通过RT-qPCR实验，以表1中记载的对应引物对，对对照组(来自两头健康猪)和攻毒组(来自两头攻毒猪)的猪的IL1B基因的表达量进行分析，结果见图3中的B。猪在肺炎支原体感染期间持续受到刺激导致炎性因子释放，最终导致肺炎支原体感染期间肺部细胞处于炎性浸润状态。

(3)确定CTSL基因在猪肺部主要表达的细胞类型及发病期间的基因变化

通过对照组(来自两头健康猪)和攻毒组(来自两头攻毒猪)的单细胞分析确定CTSL基因在肺部单核细胞内高表达，且猪支原体肺炎感染期间该基因大量升高。结果见图4中的A。

(4)RT-qPCR验证感染与未感染猪支原体肺炎期间CTSL基因的表达情况

本实施例另以无特异性病原的3头猪的肺脏组织作为空白组和人工攻毒只携带猪肺炎支原体的3头猪的肺脏组织作为攻毒组，以RT-qPCR检测了CTSL基因在感染猪肺炎支原体过程中的表达模式。结果发现猪患病期间整体肺脏组织CTSL基因升高。这一结果从侧面验证了单细胞转录组的检测结果，也同时证明CTSL基因与猪的支原体肺炎有关。具体结果见图4中的B。

(5)敲低CTSL基因，IL1B表达情况

本实施例通过RT-qPCR检测了CTSL基因在感染猪肺炎支原体过程中单核细胞表达模式。本实施例采集了1头健康猪的血液，分离获得单核细胞，平均铺板到6孔板中，对照组3个孔，猪肺炎支原体攻毒3个孔，si-NC 3个孔，si-CTSL 3个孔，si-CTSL+攻毒3个孔。通过RT-qPCR方法对上述各组的CTSL基因和IL1B基因表达量进行检测，结果见图5。从图5的结果可知接种支原体后细胞CTSL基因升高，IL1B基因表达升高。敲低CTSL基因后，IL1B基因在攻毒后表达量也将下降，可证明CTSL与猪的支原体肺炎有关，且降低CTSL基因表达量可以减少炎性因子释放。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.CTSL蛋白在作为支原体肺炎诊断标志物或在制备支原体肺炎诊断试剂盒、诊断试剂或芯片中的应用。

2.CTSL蛋白或其检测工具在制备支原体肺炎治疗评价体系中的应用。

3.CTSL蛋白的检测试剂在制备诊断支原体肺炎产品中的应用，优选，所述产品为试剂盒。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，通过检测待测肺组织基因组中CTSL基因表达水平来诊断支原体肺炎。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，当待测肺组织基因组中CTSL基因表达水平与阴性对照相比差异显著，则判断待测对象患有支原体肺炎；所述阴性对照为正常肺组织；

和/或，待测肺组织来源于猪。

6.一种诊断支原体肺炎的产品，其特征在于，所述产品包括检测CTSL基因表达水平的试剂；优选，所述产品为试剂盒。

7.一种支原体肺炎治愈的评价体系，其特征在于，含有检测CTSL蛋白表达量的检测工具；优选，所述检测工具为检测试剂盒、检测试剂和/或检测仪器。

8.根据权利要求7所述的评价体系，其特征在于，所述检测工具通过蛋白质印迹法、酶联免疫吸附法、放射免疫分析、免疫扩散法、免疫组合染色、免疫沉淀分析、补体结合分析、流式细胞荧光分析技术或蛋白芯片进行检测。

9.根据权利要求7所述的评价体系，其特征在于，所述检测工具通过聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析进行检测。

10.降低CTSL基因或CTSL蛋白表达的试剂在制备治疗支原体肺炎或缓解支原体肺炎炎性症状中的应用。