CN117737143A - 一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法 - Google Patents

一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117737143A
CN117737143A CN202410120732.8A CN202410120732A CN117737143A CN 117737143 A CN117737143 A CN 117737143A CN 202410120732 A CN202410120732 A CN 202410120732A CN 117737143 A CN117737143 A CN 117737143A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
dissolved oxygen
succinic acid
initial
rate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410120732.8A
Other languages
English (en)
Inventor
马玲玲
陈平绪
叶南飚
曾祥斌
张佳龙
张豪
陈美琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kingfa Science and Technology Co Ltd
Original Assignee
Kingfa Science and Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kingfa Science and Technology Co Ltd filed Critical Kingfa Science and Technology Co Ltd
Priority to CN202410120732.8A priority Critical patent/CN117737143A/zh
Publication of CN117737143A publication Critical patent/CN117737143A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将产丁二酸菌株的种子液接种至培养基进行发酵，发酵初始溶氧量为90％以上；(2)持续发酵至溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的20％‑30％，提高转速和通气量使溶氧升至步骤(1)发酵初始溶氧量的50％‑60％；(3)继续发酵至溶氧回升至步骤(1)发酵初始溶氧量的70％以上后以0.1‑2g/L h的速率流加补料，持续发酵至溶氧回升；(4)溶氧回升后降低转速和通气量使溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的0‑0.5％，以3‑5g/L h的速率补料，持续发酵至丁二酸产量不再增高。本发明通过发酵调控显著降低发酵过程中副产物乙醇的生成，提高丁二酸的产率。

Description

一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法。
背景技术
丁二酸，又称琥珀酸，是工业上一种重要的四碳化合物。丁二酸作为有机合成原料、中间产物或专业化学制品广泛应用于食品、医药、香料、塑料、材料等行业。其中最具有发展前景的领域为合成塑料，它是合成聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)等可生物降解高分子材料的主要原料。
目前，工业上丁二酸的生产主要依赖于化学合成方法，即以石油为原料通过催化加氢等方法合成丁二酸。然而，这种方法不仅需要消耗大量不可再生的石油资源，生产成本较高，而且具有转化率低、易污染环境等弊端，不符合可持续发展的要求。因此，寻找一种新的、可持续的丁二酸生产方法成为了研究的重点。目前，生物发酵法被认为是一种环保、高效、可持续的丁二酸生产方法，备受关注和研究。
在生物发酵生产丁二酸的过程中，选择合适的生产菌株非常重要。酿酒酵母作为生产菌株具有显著优势：首先，酿酒酵母拥有成熟的遗传操作工具、清晰的遗传背景、丰富的代谢途径等，可以通过合适的培养条件和基因工程等手段进行调控，提高丁二酸的产量和分泌效率。其次，酿酒酵母可以在不同的发酵环境和培养基中生长和繁殖，具有较强的适应性和抗干扰能力，更适合于复杂的丁二酸发酵过程中的应用。
然而，酿酒酵母的发酵生产丁二酸时存在一个无法避免的问题：副产物乙醇的大量生成。乙醇生成会导致碳源流向乙醇而无法用于丁二酸的生产，从而限制了丁二酸生产产率的提升，同时也导致下游的丁二酸分离纯化等问题。因此，副产物乙醇偏高成为酿酒酵母发酵生产丁二酸工业化的制约因素之一。目前，由于酿酒酵母的代谢特性，采用基因工程改造、理化诱变等手段无法抑制乙醇的生成，无法解决副产物乙醇积累的问题。
因此，亟需提供一种降低丁二酸发酵副产物乙醇生成的方法来实现提升丁二酸产率并降低下游丁二酸的分离纯化成本。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法，解决了酿酒酵母发酵产丁二酸过程中，副产物乙醇、生物量偏高的问题，提升丁二酸产率并降低下游丁二酸的分离纯化成本，有利于促进微生物发酵法生产丁二酸产业的发展。以葡萄糖为原料发酵生产丁二酸时，通过发酵调控，乙醇产量由9.30g/L降低至0.5g/L以下，丁二酸的产率由0.14g/g葡萄糖提升至0.26g/g葡萄糖，丁二酸产率提升了1.9倍。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将产丁二酸菌株的种子液接种至培养基进行发酵，发酵初始溶氧量为90％以上；
(2)持续发酵至溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的20％-30％，提高转速和通气量使溶氧升至步骤(1)发酵初始溶氧量的50％-60％；
(3)继续发酵至溶氧回升至步骤(1)发酵初始溶氧量的70％以上后以0.1-2g/L h的速率补料，持续发酵至溶氧回升；
(4)溶氧回升后降低转速和通气量使溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的0-0.5％，以3-5g/L h的速率补料，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
本发明提升了丁二酸产率并降低了下游丁二酸的分离纯化成本，有利于促进微生物发酵法生产丁二酸产业的发展。以葡萄糖为原料发酵生产丁二酸时，通过发酵调控，乙醇产量由9.30g/L降低至0.5g/L以下，丁二酸的产率由0.14g/g提升至0.26g/g，丁二酸产率提升了1.9倍。
本发明在发酵产丁二酸的过程中分不同阶段通过控制通气、转速、溶氧量、补料速率来控制副产物乙醇的生成，并持续生产丁二酸。在发酵第一阶段，可以通过控制通气、转速控制溶氧，使菌株处于耗氧状态，菌株在耗氧状态下能够耗完葡萄糖代谢生成的副产物乙醇；在发酵第二阶段，维持转速、通气不变，使菌株仍处于耗氧状态，开始流加补料，以较低的补料速率(0.1-2g/L h)连续补料，使菌株在不生成乙醇的前体下持续生长，积累生物量；在发酵第三阶段，可以通过降低转速和通气使溶氧处于极低水平，使菌株处于微厌氧发酵状态，该状态下菌株停止生长，随着碳源的低流速(3-5g/L h)补加，菌株持续生产丁二酸，溶氧优选通过转速和/或通气来调节，但不限于这两种方式。
上述90％以上中的具体点值可以选择90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％等。
上述20％-30％中的具体点值可以选择20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％等。
上述50％-60％中的具体点值可以选择50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％等。
上述0-0.5％中的具体点值可以选择0、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％等。
优选地，步骤(1)中所述发酵的pH为5-6。
上述5-6中的具体点值可以选择5、5.5、6等。
优选地，步骤(1)中所述种子液接种的接种量为培养基体积的3％-10％。
上述3％-10％中的具体点值可以选择3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。
优选地，步骤(1)中所述种子液的制备方法包括：
接种产丁二酸菌株的单菌落于培养基进行培养，待菌液OD600达到5-8时转移至新的培养基继续培养，即得所述种子液。
上述5-8中的具体点值可以选择5、6、7、8等。
优选地，所述培养和继续培养的温度各自独立地为25-35℃，转速各自独立地为200-250rpm，时间各自独立地为12-48h。
上述25-35℃中的具体点值可以选择25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等。
上述200-250rpm中的具体点值可以选择200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm等。
上述12-48h中的具体点值可以选择12h、14h、20h、30h、32h、34h、40h、44h、48h等。
优选地，步骤(1)中所述发酵的转速为400-500rpm，所述发酵的通气量为0.5-1.0vvm。
上述400-500rpm中的具体点值可以选择400rpm、420rpm、440rpm、460rpm、500rpm等。
上述0.5-1.0vvm中的具体点值可以选择0.5vvm、0.6vvm、0.7vvm、0.8vvm、0.9vvm、1.0vvm等。
优选地，步骤(2)中所述提高转速和通气量为提高转速至500-600rpm，提高通气量至1.0-1.5vvm。
上述500-600rpm中的具体点值可以选择500rpm、520rpm、540rpm、560rpm、600rpm等。
上述1.0-1.5vvm中的具体点值可以选择1.0vvm、1.1vvm、1.2vvm、1.3vvm、1.4vvm、1.5vvm等
优选地，步骤(3)中所述补料的料液为400-700g/L的葡萄糖溶液。
上述400-700g/L中的具体点值可以选择400g/L、450g/L、500g/L、600g/L、650g/L、700g/L等。
上述0.1-2g/L·h中的具体点值可以选择0.1g/L·h、0.5g/L·h、1g/L·h、1.5
g/L·h、2g/L·h等。
优选地，步骤(4)中所述降低转速为降低转速至200-300rpm。
上述200-300rpm中的具体点值可以选择200rpm、220rpm、240rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm、300rpm等。
优选地，步骤(4)中所述降低通气量为降低通气量至0.05-0.1vvm。
上述0.05-0.1vvm中的具体点值可以选择0.05vvm、0.06vvm、0.07vvm、0.08vvm、0.09vvm、0.1vvm等。
优选地，步骤(4)中所述补料的料液为400-700g/L的葡萄糖溶液。
上述400-700g/L中的具体点值可以选择400g/L、450g/L、500g/L、600g/L、650g/L、700g/L等。
上述3-5g/L h中的具体点值可以选择3、3.5g/L h、4g/L h、4.5g/L h、5g/Lh等。
作为优选的技术方案，本发明所述的降低丁二酸发酵副产物乙醇生成的方法包括以下步骤：
(1)接种产丁二酸菌株的单菌落于培养基进行25-35℃、200-250rpm培养12-48h，待菌液OD600达到5-8时转移至新的培养基继续25-35℃、200-250rpm培养12-48h，得到种子液；将种子液接种至培养基进行发酵，所述发酵的pH为5-6，初始溶氧量为90％以上；
(2)持续发酵至溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的20％-30％，提高转速和通气量使溶氧升至步骤(1)发酵初始溶氧量的50％-60％；
(3)继续发酵至溶氧回升至步骤(1)发酵初始溶氧量的70％以上后以0.1-2g/L h的速率补料，持续发酵至溶氧回升；
(4)溶氧回升后降低转速和通气量使溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的0-0.5％，以3-5g/L h的速率补料，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的方法在制备丁二酸中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过控制转速、通气、溶氧量、补料速率等条件使菌株处于不同的发酵状态，从而显著降低发酵过程中副产物乙醇的生成，克服现有技术通过基因改造、理化诱变等方式无法控制酿酒酵母生成副产物乙醇的难题，并通过控制菌株的发酵状态，提高丁二酸的产率，从而提高原料利用率，有利于促进微生物发酵法生产丁二酸产业的发展；
(2)本发明以葡萄糖为原料发酵生产丁二酸时，通过发酵调控，乙醇产量在0.5g/L以下，丁二酸产量在35g/L以上，转化率在24％以上。
附图说明
图1为本发明实施例1发酵过程中溶氧变化、丁二酸产量、副产物乙醇产量、葡萄糖消耗的结果图；
图2为本发明对比例9发酵过程中溶氧变化、丁二酸产量、副产物乙醇产量、葡萄糖消耗的结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
制备例1
Verduyn培养基的配制。
第一部分为基础碳氮源：称取20.0g/L葡萄糖，15.0g硫酸铵，8.0g无水磷酸二氢钾，6.15g无水硫酸镁，加蒸馏水定容至1L。配制后115℃高温高压灭菌20min。
第二部分为微量元素溶液：称取2.80g硫酸亚铁，2.90g氯化钙，0.48g钼酸钠，0.47g氯化钴，5.75g硫酸锌，0.32g氯化锰，0.50g硫酸铜，15g EDTA，加蒸馏水定容至1L，在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤除菌。
第三部分为维生素溶液：0.05g生物素，1g泛酸钙，1g烟酸，25g肌醇，1g盐酸硫胺素，1g盐酸吡哆醇，1g对氨基苯甲酸，加蒸馏水定容至1L，在超净工作台中过滤后保存至4℃。
各培养基使用前加入过滤后的1mL微量元素溶液和1.2mL维生素溶液。
YPD培养基的配制。
称取20g葡萄糖、20g蛋白胨、10g酵母提取物，加蒸馏水定容至1L，配制后115℃高温高压灭菌20min。
丁二酸、乙醇、生物量OD600的检测。
生物量OD600通过紫外分光光度计在600nm波长下检测获得。
丁二酸、乙醇可以通过高效液相色谱(HPLC)定量分析。本研究使用Waters2695高效液相色谱仪，检测器为Milford RI-2414示差折光检测器，色谱柱为Bio-Rad的AminexHPX-87H(300×7.8mm)。自动进样器为，流动相为2.5mM稀硫酸。
(1)HPLC检测方法
具体方法如下：设置自动进样程序，进样量为10μL，流动相流速设为0.6mL/min，柱温箱温度设为40℃，分析时间设为25min。
(1)2.5mM稀硫酸流动相制备
量取2L超纯水(18.2MΩ)到试剂瓶中，取少量(约20mL)超纯水至烧杯中，加入280μL浓缩酸，用0.22μm滤膜过滤除菌后加至超纯水中，并超声脱气30min。
(2)样品标准曲线的绘制
制作丁二酸和乙醇的标准曲线：用流动相分别制备浓度梯度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L的混合标样品溶液，用0.22μm滤膜过滤至色谱瓶中。液相检测后记录丁二酸、乙醇峰面积绘制相应的标准曲线。
(3)样品制备
取200μL上发酵液于1.5mL离心管中，加入800μL流动相，混匀，用0.22μm滤膜过滤至色谱瓶中，待HPLC检测。
实施例1
本实施例提供一种降低丁二酸发酵副产物乙醇生成的方法，包括以下步骤：
(1)从平板上挑取产丁二酸的菌株CEN.PK2 SE11单菌落接种到含有5mLYPD培养基的试管中，于30℃、220rpm摇床培养24h，待菌液OD600达到5-8之间，控制初始OD600为0.05转接至含有100mLVerduyn培养基的500mL锥形瓶中，继续于30℃、220rpm摇床培养24h，得到种子液，按5％(v/v)的接种量将种子液接种到Verduyn培养基中，用20％NaOH调节发酵液的pH维持在5.5，调转速为400rpm，通气为0.5vvm，控制初始溶氧为90％以上，使菌株处于耗氧发酵状态；
(2)发酵过程中随着菌株的生长，溶氧逐渐降低，待溶氧骤降到30％时调转速到500rpm，通气为1.0vvm，使溶氧升至50％左右，继续发酵，溶氧再次开始逐渐降低；
(3)当溶氧骤然回升至70％以上时，表明发酵体系中无葡萄糖、乙醇等碳源，此时开始流加补料，补料液为600g/L的葡萄糖，补料速率为2g/L h，此时溶氧开始下降；
(4)当溶氧开始回升，表明生物量已达到一定程度，2g/Lh的补料速率无法满足菌株的生长需求，此时将调转速到200rpm、通气量0.1vvm，使溶氧维持在0.5％以下，使菌株处于微厌氧发酵状态，该状态下菌株停止生长；此时以4g/Lh的速率补料，菌株持续生成丁二酸，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
实施例2
本实施例提供一种降低丁二酸发酵副产物乙醇生成的方法，包括以下步骤：
(1)从平板上挑取产丁二酸的菌株CEN.PK2 SE11单菌落接种到含有5mLYPD培养基的试管中，于25℃、200rpm摇床培养24h，待菌液OD600达到5-8之间，控制初始OD600为0.05转接至含有100mLVerduyn培养基的500mL锥形瓶中，继续于25℃、200rpm摇床培养48h，得到种子液，按10％(v/v)的接种量将种子液接种到Verduyn培养基中，用20％NaOH调节发酵液的pH维持在6，调转速为450rpm，通气为1.0vvm，控制初始溶氧为90％以上，使菌株处于耗氧发酵状态；
(2)发酵过程中随着菌株的生长，溶氧逐渐降低，待溶氧骤降到30％时调转速到500rpm，通气为1.0vvm，使溶氧升至50％左右，继续发酵，溶氧再次开始逐渐降低；
(3)当溶氧骤然回升至70％以上时，表明发酵体系中无葡萄糖、乙醇等碳源，此时开始流加补料，补料液为400g/L的葡萄糖，补料速率为2g/L h，此时溶氧开始下降；
(4)当溶氧开始回升，表明生物量已达到一定程度，2g/Lh的补料速率无法满足菌株的生长需求，此时将调转速到300rpm、通气量0.05vvm，使溶氧维持在0.5％以下，使菌株处于微厌氧发酵状态，该状态下菌株停止生长；此时以3g/Lh的速率补料，菌株持续生成丁二酸，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
实施例3
本实施例提供一种降低丁二酸发酵副产物乙醇生成的方法，包括以下步骤：
(1)从平板上挑取产丁二酸的菌株CEN.PK2 SE11单菌落接种到含有5mLYPD培养基的试管中，于35℃、250rpm摇床培养12h，待菌液OD600达到5-8之间，控制初始OD600为0.05转接至含有100mLVerduyn培养基的500mL锥形瓶中，继续于35℃、250rpm摇床培养12h，得到种子液，按3％(v/v)的接种量将种子液接种到Verduyn培养基中，用20％NaOH调节发酵液的pH维持在5，调转速为500rpm，通气为0.5vvm，控制初始溶氧为90％以上，使菌株处于耗氧发酵状态；
(2)发酵过程中随着菌株的生长，溶氧逐渐降低，待溶氧骤降到30％时调转速到600rpm，通气为1.5vvm使溶氧升至50％左右，继续发酵，溶氧再次开始逐渐降低；
(3)当溶氧骤然回升至70％以上时，表明发酵体系中无葡萄糖、乙醇等碳源，此时开始流加补料，补料液为700g/L的葡萄糖，补料速率为2g/L h，此时溶氧开始下降；
(4)当溶氧开始回升，表明生物量已达到一定程度，2g/Lh的补料速率无法满足菌株的生长需求，此时将调转速到200rpm、通气量0.1vvm，使溶氧维持在0.5％以下，使菌株处于微厌氧发酵状态，该状态下菌株停止生长；此时以5g/Lh的速率补料，菌株持续生成丁二酸，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于步骤(1)发酵液的pH维持在6.5。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于步骤(1)发酵液的pH维持在4.5。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于步骤(1)中发酵的转速为300rpm，通气为0.5vvm，使初始溶氧量为50-60％。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于步骤(1)中发酵的转速为300rpm，通气为0.1vvm，使溶氧量为30-40％。
对比例5
本对比例与实施例1的区别在于步骤(2)中提高转速至400rpm，提高通气量至0.5vvm，使溶氧量为30-40％。
对比例6
本对比例与实施例1的区别在于步骤(4)中降低转速至200rpm，降低通气量至0.5vvm，使溶氧量为10-20％。
对比例7
本对比例与实施例1的区别在于步骤(3)中补料的速率为4g/L·h。
对比例8
本对比例与实施例1的区别在于步骤(4)中补料的速率为8g/L·h。
对比例9
(1)从平板上挑取产丁二酸的菌株CEN.PK2 SE11单菌落接种到含有5mLYPD培养基的试管中，于30℃、220rpm摇床培养24h，待菌液OD600达到5-8之间，控制初始OD600为0.05转接至含有100mLVerduyn培养基的500mL锥形瓶中，继续于30℃、220rpm摇床培养24h，得到种子液，按5％(v/v)的接种量将种子液接种到Verduyn培养基中，用NAOH调节发酵液的pH维持在5.5；调转速为400rpm，通气为0.5vvm，控制初始溶氧为90％以上，使菌株处于耗氧发酵状态；
(2)发酵过程中随着菌株的生长，溶氧逐渐降低，待溶氧骤降到30％时调转速到500rpm，通气为1.0vvm，使溶氧升至50％左右，继续发酵，溶氧再次开始逐渐降低；
(3)当溶氧骤然回升至70％以上时，表明发酵体系中无葡萄糖、乙醇等碳源，此时开始流加补料，补料液为600g/L的葡萄糖，补料速率为2g/L h，此时溶氧开始下降；
(4)当溶氧开始回升，表明菌株进入快速生长阶段，此时2g/Lh的补料速率无法满足菌株的生长需求，此时将调控方式设为溶氧-转速联控模式使得溶氧维持在50％左右，从而使菌株处于耗氧状态，该状态下菌株快速生长；同时以4g/Lh的速率补料，菌株持续生成丁二酸，持续发酵。
测试例1
耗氧-厌氧双阶段发酵调控方式的发酵结果见表1。
表1
a表示丁二酸的转化率，定义为丁二酸的产量(g)与葡萄糖产量(g)的比值。
由表1可知，本发明的方法能够显著提高丁二酸的产率，通过发酵调控，乙醇产量由9.30g/L降低至0.47g/L，丁二酸的产率由0.14g/g提升至0.26g/g，丁二酸产率提升了1.9倍。对比例1和2改变发酵液pH，结果丁二酸产量和转化率略有下降，说明对于该菌株，pH 5-6是发酵适宜范围，pH环境的改变会对该菌株的发酵造成会负面影响；对比例3-4改变了步骤(1)中的通气和转速，步骤(1)的溶氧量在30-60％之间，低溶氧下菌株生长缓慢，导致产酸能力下降；对比例5改变了步骤(2)中的通气量，导致乙醇无法有效控制，说明该阶段的通气量对于菌株发酵状态控制及乙醇生成至关重要；对比例6改变步骤(4)中转速和通气量，结果乙醇含量上升，说明通气量提升无法控制菌株的微厌氧发酵状态，从而无法控制乙醇的生成；对比例7改变步骤(3)补料速率，结果乙醇含量上升，说明对于丁二酸的生产该菌株的耗糖速率需严格控制，当补糖过量时，菌株优先进入发酵途径而产生大量乙醇；对比例8改变步骤(4)加料速率，结果丁二酸产量略有上升但丁二酸转化率下降，说明在微厌氧阶段菌株耗糖能力有限，菌株无法消耗过量补充的糖，因此丁二酸转化率反而下降。对比例9采用现有技术常规方法，结果乙醇含量为9.30g/L，说明本发明方法能够明显在生产丁二酸过程中降低乙醇含量。
综上所述，本发明的方法解决了酿酒酵母发酵产丁二酸过程中，副产物乙醇、生物量偏高的问题，提升丁二酸产率并降低下游丁二酸的分离纯化成本，有利于促进微生物发酵法生产丁二酸产业的发展。以葡萄糖为原料发酵生产丁二酸时，通过发酵调控，乙醇产量在0.5g/L以下，丁二酸产量在35g/L以上，转化率在24％以上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将产丁二酸菌株的种子液接种至培养基进行发酵，发酵初始溶氧量为90％以上；
(2)持续发酵至溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的20％-30％，提高转速和通气量使溶氧升至步骤(1)发酵初始溶氧量的50％-60％；
(3)继续发酵至溶氧回升至步骤(1)发酵初始溶氧量的70％以上后以0.1-2g/L h的速率补料，持续发酵至溶氧回升；
(4)溶氧回升后降低转速和通气量使溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的0-0.5％，以3-5g/L h的速率补料，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵的pH为5-6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子液接种的接种量为培养基体积的3％-10％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述种子液的制备方法包括：
接种产丁二酸菌株的单菌落于培养基进行培养，待菌液OD600达到5-8时转移至新的培养基继续培养，即得所述种子液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养和继续培养的温度各自独立地为25-35℃，转速各自独立地为200-250rpm，时间各自独立地为12-48h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵的转速为400-500rpm，所述发酵的通气量为0.5-1.0vvm；
步骤(2)中所述提高转速和通气量为提高转速至500-600rpm，提高通气量至1.0-1.5vvm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述补料的料液为400-700g/L的葡萄糖溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述降低转速为降低转速至200-300rpm；
步骤(4)中所述降低通气量为降低通气量至0.05-0.1vvm；
步骤(4)中所述补料的料液为400-700g/L的葡萄糖溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)接种产丁二酸菌株的单菌落于培养基进行25-35℃、200-250rpm培养12-48h，待菌液OD600达到5-8时转移至新的培养基继续25-35℃、200-250rpm培养12-48h，得到种子液；将种子液接种至培养基进行发酵，所述发酵的pH为5-6，初始溶氧量为90％以上；
(2)持续发酵至溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的20％-30％，提高转速和通气量使溶氧升至步骤(1)发酵初始溶氧量的50％-60％；
(3)继续发酵至溶氧回升至步骤(1)发酵初始溶氧量的70％以上后以0.1-2g/L h的速率补料，持续发酵至溶氧回升；
(4)溶氧回升后降低转速和通气量使溶氧降低至步骤(1)发酵初始溶氧量的0-0.5％，以3-5g/L h的速率补料，持续发酵至丁二酸产量不再增高。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在制备丁二酸中的应用。
CN202410120732.8A 2024-01-29 2024-01-29 一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法 Pending CN117737143A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410120732.8A CN117737143A (zh) 2024-01-29 2024-01-29 一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410120732.8A CN117737143A (zh) 2024-01-29 2024-01-29 一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117737143A true CN117737143A (zh) 2024-03-22

Family

ID=90261101

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410120732.8A Pending CN117737143A (zh) 2024-01-29 2024-01-29 一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117737143A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100427605C (zh) 一种由粗淀粉原料生产1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的方法
Krouwel et al. Continuous isopropanol-butanol-ethanol fermentation by immobilized Clostridium beijerinckii cells in a packed bed fermenter
CN104024209B (zh) 用于回收和纯化丙酸的方法
CN109652472A (zh) 一种长碳链二元酸生物发酵制备方法
CN102321680B (zh) 一种二元醇与有机酸联产与分离方法
CN106467919B (zh) 一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法
CN113621658B (zh) 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法
CN1246465C (zh) 微生物两段发酵法由甘油生产1，3－丙二醇和2，3－丁二醇
Choudhury et al. Lactic acid fermentation in cell-recycle membrane bioreactor
CN117737143A (zh) 一种在发酵生产丁二酸中降低发酵副产物乙醇生成的方法
CN110029134B (zh) 一种生产和提取谷氨酸的工艺
CN111748480A (zh) 一种维斯假丝酵母及其应用
WO2010024714A2 (en) Process for production of organic solvents
FI85501B (fi) Foerfarande foer framstaellning av polyoler genom pao industriell skala baserad fermentation av socker.
CN102747114B (zh) 一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法
CN113667709B (zh) 一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法
CN1524961A (zh) 微生物连续催化法生产丙烯酰胺
Shah et al. Improvement of productivity in acetic acid fermentation with Clostridium thermoaceticum
CN112626136A (zh) 一种利用酒糟水发酵生产丁酸的方法
KR101204971B1 (ko) 젖산 암모늄을 포함하는 젖산 발효액으로부터 젖산을 정제하는 방법
WO2010095976A2 (en) Process for production of organic solvents
CN114891835B (zh) 一种高产葡萄糖酸的方法
CN114958928B (zh) 一种基因工程菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的方法
CN113087615A (zh) 一种从乳酸发酵液中分离乳酸的方法
CN117305374A (zh) 一种解脂耶氏酵母发酵产β-法尼烯的补料方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination