CN117737041A - 一种内切纤维素酶突变体及其应用 - Google Patents
一种内切纤维素酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种内切纤维素酶突变体及其应用，属于酶制剂技术领域。本发明所述突变体为：如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第105位、第205位、第233位中的任意一位或几位氨基酸位点发生取代突变后的氨基酸序列。本发明采用NDT密码子和单点突变技术，基于Caver的隧道工程指导和Hotspot精准预测技术相结合的方式，发现了酶结构中的关键结构(Tunnel)对酶催化性能的影响，获得了一类酶活显著提高的持续性内切纤维素酶突变体。本发明所述的持续性内切纤维素酶的突变体具有较高的催化活性，为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性。
Description
技术领域
本发明涉及酶制剂技术领域，尤其涉及一种内切纤维素酶突变体及其应用。
背景技术
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，利用酶将纤维素降解为可发酵性糖是实现纤维素资源化利用的关键之一。然而，目前纤维素降解过程中需要的酶种类多、用量大，从而导致了酶应用成本过高，酶制剂成本在整个纤维乙醇生产成本中占30％以上，严重制约了纤维素生物炼制过程，是纤维乙醇和高值化学品商业化的瓶颈因素。
与普通的纤维素降解酶系相比，近年来发现的持续性内切纤维素酶展现了诸多优势，在纤维素低成本生物转化领域有着巨大的潜在应用价值。持续性内切纤维素酶具有双功能性，既表现出内切葡聚糖酶(内切酶)的特征，同时又具有外切葡聚糖酶(外切酶)的持续水解能力。持续性内切葡聚糖酶仅与β-葡萄糖苷酶协同作用即可持续降解纤维素。并且，持续性内切葡聚糖酶相比于外切葡聚糖酶，没有Loop结构，酶结构上的差异使得持续性内切纤维素酶往往具有更高的热稳定性。此外，持续性内切葡聚糖酶对产物纤维二糖的反馈抑制作用不敏感。可见，持续性内切葡聚糖酶具有的独特优势和巨大应用潜力。
尽管国内外研究者通过蛋白质工程改造技术提高纤维素酶催化活性的研究已经取得了非常显著的进展。然而，目前对持续性内切葡聚糖酶的持续性机制仍缺乏整体系统的理论认识，难以满足持续性内切葡聚糖酶的定向设计与改造的需求，因此，本发明以隧道工程(Caver)和热点残基(Hotspot)指导的酶改造方法为基础，筛选关键位点突变体文库并进行分子改造，提供了一类酶活显著提高的持续性内切纤维素酶突变体，为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内切纤维素酶突变体及其应用，解决现有内切纤维素酶活性低，制约纤维素原料的工业化生物转化的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种内切纤维素酶突变体，所述突变体为：如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第105位、第205位、第233位中的任意一位或几位氨基酸位点发生取代突变后的氨基酸序列。
优选的，所述第105位的氨基酸取代突变是氨基酸序列第105位的天冬酰胺由丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸或组氨酸中的任意一种氨基酸取代；
所述第205位的氨基酸取代突变是氨基酸序列第205位的苏氨酸由精氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸中的任意一种氨基酸取代；
所述第233位的氨基酸取代突变是氨基酸序列第233位的天冬氨酸由丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或亮氨酸中的任意一种氨基酸取代。
优选的，所述突变体为：如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第105位的天冬酰胺由组氨酸取代、第205位的苏氨酸由丝氨酸取代和第233位的天冬氨酸由亮氨酸取代后的氨基酸序列。
优选的，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.9中任一项所示。
本发明提供了编码所述突变体的核苷酸序列。
本发明提供了包含所述核酸序列的表达载体。
本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了所述的突变体，或所述的核苷酸序列，或所述的表达载体，或所述的宿主细胞在纤维素生物降解中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用NDT密码子和单点突变技术，基于Caver的隧道工程指导和Hotspot精准预测技术相结合的方式，发现了酶结构中的关键结构(Tunnel)对酶催化性能的影响，获得了一类酶活显著提高的持续性内切纤维素酶突变体。本发明所述的持续性内切纤维素酶的突变体具有较高的催化活性，为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例2中各突变体的电泳结果，其中，M为蛋白marker，泳道1～26分别为突变体H36A、W40A、A65A、Y67A、I103A、L104A、N105A、G107A、N142A、G143A、T177A、S179A、Q180A、T205A、H206A、G207A、Q208A、F209A、L210A、D233A、A234A、S235A、G236A、N263A、K267A、E269A的纯化酶；
图2为实施例3中24个关键氨基酸位点的丙氨酸突变对可溶性底物CMC的相对水解活性；
图3为实施例3中24个关键氨基酸位点的丙氨酸突变对不溶性底物Avicel的相对水解活性；
图4为实施例3中突变体对CMC和Avicel的相对水解活性；
图5为实施例3中各组合突变体对CMC(A)和Avicel(B)底物的相对水解活性；
图6为实施例4中突变体和原始酶的最适反应温度(图左)和温度稳定性(图右)测定结果；
图7为实施例4中突变体和原始酶的最适pH(图左)和pH稳定性(图右)测定结果；
图8为实施例5中原始酶EG5C-1与最佳突变体的持续性能力；
图9为实施例6中原始酶EG5C-1与最佳突变体的水解情况，其中，G1为葡萄糖，G2为纤维二糖，G3为纤维三糖，G4为纤维四糖，G5为纤维五糖；图左中M为产物标准样品，孔道1和8为对照，孔道2、3、4为EG5C-1分别对CMC、Avicel、PASC的水解产物，孔道5、6、7为N105H/T205S/D233L分别对CMC、Avicel、PASC的水解产物；图右中M为产物标准样品，孔道1、2、3、4为EG5C-1分别对纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖的水解产物，孔道5、6、7、8为N105H/T205S/D233L分别对纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖的水解产物；
图10为实施例7中原始酶EG5C-1与最佳突变体对滤纸的水解性能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1基于Caver和Hotspot为指导的关键氨基酸残基的筛选
通过BsCel5A催化模块的同源性模型预测野生型EG5C-1的晶体结构(PDB ID：3PZT)，使用Autodock软件在底物通道对接纤维六糖。将同源模型使用CaverDock 1.1软件进行分析，以催化活性位点E140和E228为中心点，获得隧道Tunnel1、Tunnel2、Tunnel3。随后以各个隧道的中心，筛选隧道周围的氨基酸残基，分别为H36、W40、R63、A65、Y67、H102、I103、L104、N105、G107、N139、E140、N142、G143、T177、W178、S179、Q180、H200、F201、W202、T205、H206、G207、Q208、F209、L210、E228、D233、A234、S235、G236、W262、N263、K267、E269。
将获得的同源模型结构输入Hotspot预测酶-底物相互作用中的热点残基，并以突变分数为依据，筛选分数中等(Moderate)和高等(High)的氨基酸位点，分别为H36、W40、A65、Y67、I103、L104、N105、G107、N142、G143、T177、S179、Q180、T205、H206、G207、Q208、F209、L210、D233、A234、S235、G236、N263、K267、E269。
最后选取两种方式的交集作为最终的关键氨基酸，分别为H36、W40、A65、Y67、I103、L104、N105、G107、N142、G143、T177、S179、Q180、T205、H206、G207、Q208、F209、L210、D233、A234、S235、G236、N263、K267、E269。
实施例2持续性内切葡聚糖酶突变体的构建
对实施例1获得的突变位点进行丙氨酸突变和定点突变(NDT密码子)，采用BinWu(Biotechnology for Biofuels，2018，11:20)公开的方法，构建含有SEQ ID NO.2(原始酶核酸序列)的重组质粒，以SEQ ID NO.2所示的序列为模板，参照Vazyme生物产品及操作手册，利用如下设计的相应突变引物，全质粒扩增出定点突变序列，所用引物如表1和SEQ IDNO.10～SEQ ID NO.99所示。
表1突变位点的相应突变引物
其中，NDT对应不同氨基酸的密码子如下：TTT(Phe)、CTG(Leu)、ATT(Lle)、GTT(Val)、TAT(Tyr)、CAT(His)、AAT(Asn)、GAT(Asp)、TGT(Cys)、CGT(Arg)、TCA(Ser)、GGC(Gly)；AHN为与NDT配对的简并密码子；在序列表中NDT和AHN均用NNN代替。
PCR反应体系如下：Primer-F 1μL，Primer-R 1μL，Template 1μL，ddH2O9.5μL，2×Phanta Max MasterMix 12.5μL
PCR程序设定如下：95℃，3min；95℃，15s；60℃，15s；72℃，8min；30个循环；72℃，10min；4℃，Hold。
全质粒扩增完成后，取2μL PCR产物进行核酸电泳验证。验证结束后，使用DpnI消化酶，降解初始模板。
消化体系如下：PCR产物1μL，DpnI酶1μL，10×QuickCut Buffer 2μL。
消化程序如下：37℃，30min。
消化结束后，将PCR产物采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21(DE3)，并涂布于含有100μg/mL硫酸卡那霉素LB琼脂平板上，37℃培养15h。经序列测定(由安徽通用生物公司完成)验证突变结果，获得相应突变体。
分别将上述构建的突变体以及原始酶EG5C-1接种至50mL的LB液体培养基中，加入硫酸卡那霉素，使其终浓度为100μg/mL，180rpm，37℃过夜培养；以2％的接种量将过夜培养的种子液接种至新鲜的50mL的LB液体培养基中，180rpm，37℃恒温培养至OD600为0.8时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.1mmol/L)，25℃诱导表达24h。取诱导表达的发酵液，12000rpm离心20min，弃去上清，然后用50mM Na2HPO4-KH2PO4(pH 6.0)缓冲液重悬菌体，然后超声破碎上清液经0.22μm滤膜过滤后即得粗酶液，然后使用(GE Healthcare，Fairfield，USA)镍柱进行目的蛋白的分离纯化，获得各突变体。对各突变体进行电泳和氨基酸测序，电泳结果如图1所示，可见，诱导后的突变体在33.4kDa处都有明显的条带，测序结果显示突变体序列正确，表明持续性内切葡聚糖酶突变体成功诱导表达。
实施例3持续性内切纤维素酶最优突变体的筛选
将实施例2获得的突变体以羧甲基纤维素钠CMC和微晶纤维素Avicel为底物测定突变体酶活变化，24个关键氨基酸位点(由于位点A65和A234本身就是丙氨酸，没有进行突变，因此没有对其进行活性检测)的丙氨酸突变对可溶性底物CMC的相对水解活性如图2所示，对不溶性底物Avicel的相对水解活性如图3所示。
由图2和图3可知，绝大多数位点丙氨酸突变后失去活性，表明该位点对酶催化活性的重要性。少数位点丙氨酸突变后活性显著增强，另有少数位点突变后活性没有发生显著变化。
随后选择未进行突变的位点以及活性增强或者降低大于20％的位点进行进一步的研究，位点分别为H36、W40、A65、Y67、I103、L104、N105、G107、N142、Q180、T205、H206、L210、D233、A234、G236、K267、E269。以NDT密码子对上述18个位点进行突变，突变使用的引物同实施例2，突变体对CMC和Avicel的相对水解活性如图4所示(由于位点H36、W40、I103、L104、N142、Q180、H206、A234、G236、K267、E269经NDT密码子饱和突变后几乎完全失去活性，因此图4中未示出)。
由图4可知，位点A65、Y67、G107、L210突变体的相对活性相比于原始酶没有显著提高，而突变体N105、T205S和D233L的相对活性相比于原始酶有所提高，其中N105H(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、T205S(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)、D233L(氨基酸序列如SEQID NO.5所示)的活性最高。其对于可溶性底物CMC的活性分别平均提高了21％、23％和96％，对于不溶性底物Avicel的活性分别提高了25％、21％和30％。
最后基于各个突变体文库中较好的突变体，设计组合突变体：N105H/T205S(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)、N105H/D233L(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)、T205S/D233L(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)、N105H/T205S/D233L(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)，测定其对于CMC和Avicel底物的相对水解活性，结果如图5所示。由图5可知，组合突变体的活性相比于原始酶均不同程度的提高，其中组合突变体N105H/T205/D233L的活性相比于原始酶，对于CMC底物的水解活性提高了2.1倍，对于Avicel底物的水解活性提高了1.25倍。
实施例4持续性内切葡聚糖酶突变体的酶学性质
持续性内切葡聚糖酶突变体水解活力测定方法：
酶活力单位定义：一个酶活力单位即为在60℃，pH 6.0条件下，每分钟由底物产1mmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
(1)内切纤维素酶(Endo-glucanase)：准确称取1g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶于100mL的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(50mM，pH 6.0)中，搅拌混匀，准确吸取1.5mL加入试管作为酶反应底物，60℃预热5min后加入已适当稀释的蛋白酶液0.5mL，放入60℃的水浴摇床反应10min，加入3mL的DNS试剂，沸水浴反应5min后迅速冷却至室温，以灭活的酶反应液为对照测定540nm波长下的吸光度值。
(2)外切纤维素酶(Exo-glucanase)：准确称取10g微晶纤维素(Avicel)溶于100mL的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(50mM，pH 6.0)中，搅拌混匀，准确吸取1.5mL加入试管作为酶反应底物，60℃预热5min后加入已适当稀释的蛋白酶液0.5mL，放入60℃的水浴摇床反应30min，离心吸取上清液，加入3mL的DNS试剂，沸水浴反应5min后迅速冷却至室温，以灭活的酶反应液为对照测定540nm波长下的吸光度值。
(3)滤纸酶活(FPase)：准确称取0.5g烘干滤纸(FP)，加入1.5mL Na2HPO4-KH2PO4缓冲液(50mM，pH 6.0)中，60℃预热5min后加入已适当稀释的蛋白酶液0.5mL，放入60℃的水浴摇床反应30min，离心吸取上清液，加入3mL的DNS试剂，沸水浴反应5min后迅速冷却至室温，以灭活的酶反应液为对照测定540nm波长下的吸光度值。
比酶活X＝[还原糖含量/180/10(30)]/n
其中，X为比酶活，U/mg；180指还原糖从毫克转换为微摩尔；10(30)为反应时间；n为反应蛋白含量，mg。
1.最适反应温度和温度稳定性
将原始酶(SEQ ID NO.2)和实施例3得到的N105H/T205S/D233L突变体酶液按照一定浓度稀释并吸取500μL加入装有1.5mL CMC底物的试管中，并分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下反应10min，反应结束后加入3mL DNS溶液煮沸5min，测定其酶活。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制酶活随着温度变化的曲线。
为了测定N105H/T205S/D233L突变体和原始酶的温度稳定性，将稀释的酶液分别放入30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中孵育2h，然后按照测定内切纤维素酶活力的方式测定其剩余的酶活力。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。
结果如图6所示，其中，图6左为突变体和原始酶的最适反应温度测定结果，右为突变体和原始酶的温度稳定性测定结果。可以看出，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1与突变体N105H/T205S/D233L的最适反应温度均为60℃，当温度在30℃～60℃时，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及突变体的酶活逐渐升高，当温度高于60℃时，EG5C-1及其突变体的酶活均显著下降。持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其突变体N105H/T205S/D233L在低于50℃条件下保温2h，仍然保留了超过80％以上的酶活力，表明突变体酶在酶活与温度稳定性上得到了平衡，没有因为酶活的提高而导致温度稳定性的下降。
2.最适pH和pH稳定性
配制不同pH的缓冲和底物：柠檬酸-柠檬酸钠(pH 3.0～6.0)、Na2HPO4-KH2PO4(pH6.0～8.0)、甘氨酸-氢氧化钠(pH 8.0～9.0)，分别配制不同pH条件下的1％的CMC底物反应液。
将原始酶和实施例3得到的N105H/T205S/D233L突变体酶液按照一定的浓度稀释并吸取500μL加入装有1.5mL不同pH缓冲配制的CMC底物反应液中，60℃反应10min，反应结束后加入3mL DNS溶液煮沸5min，测定其酶活。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制酶活随着底物pH变化而变化的曲线。
将稀释的酶液用不同pH的缓冲进行稀释，置于冰上4℃孵育2h，然后按照测定内切纤维素酶活力的方式测定其酶活力。以最高的酶活为100％，依次计算相对酶活，绘制不同孵育条件下酶活的变化曲线。
结果如图7所示，其中，图7左为突变体和原始酶的最适pH测定结果，右为突变体和原始酶的pH稳定性测定结果。持续性内切葡聚糖酶EG5C-1与突变体N105H/T205S/D233L的最适反应pH均为pH 6.0，持续性内切葡聚糖酶EG5C-1及其突变体在pH6.0条件下，具有最高水解活性，随着pH的升高或降低，其酶活性均减少。持续性内切葡聚糖酶EG5C-1与突变体N105H/T205S/D233L在pH5.0-9.0之间的稳定性较为平稳，在各个条件下孵育2h后均能保留70％以上的酶活力，而在pH3.0～5.0之间，持续性内切葡聚糖酶及其突变体的稳定性均下降。
实施例5持续性内切葡聚糖酶最佳突变体的持续性能力
持续性内切葡聚糖酶的持续性是通过检测降解再生无定形纤维素(PASC)所产生的可溶性还原端与不可溶性还原端的比例确定的。测定步骤如下：
(1)将实施例3得到的N105H/T205S/D233L突变体酶液按照一定的浓度稀释(稀释至浓度0.007mg/mL左右)并吸取500μL加入装有1.5mL 1％的PASC底物(w/v)的试管中混匀；
(2)试管于60℃下反应30min、60min、120min、180min后取出，立即用沸水煮沸5min，终止反应；
(3)将反应物离心，12000rpm，10min；
(4)将沉淀用Na2HPO4-KH2PO4缓冲液反复清洗离心至少3遍，然后加入等上清液体积的缓冲液重悬沉淀，得到不溶性还原糖；
(5)根据DNS法分别测定上清液与沉淀中还原糖的含量并计算不同反应时间段的还原端比例。
结果如图8所示，可以看出，当反应时间由0.5h延长至3h时，原始酶EG5C-1所产生的可溶性与不溶性还原糖的比值由2.22增加至3.30，最佳突变体N105H/T205S/D233L酶解PASC产生的可溶性还原糖和不溶性还原糖的比值则随着时间的延长而不断增加，0.5h比值为2.69，3h后增加至3.66。由此可知，最佳突变体N105H/T205S/D233L在内切酶和外切酶活性提高的同时其持续性能力也得到了加强。
实施例6持续性内切葡聚糖酶最佳突变体的水解产物
根据实施例3获得N105H/T205S/D233L突变体的纯化酶液体，以CMC、Avicel、PASC以及纤维寡糖(纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖)为底物进行产物水解分析，具体步骤如下：
(1)吸取适当稀释的纯化酶液与底物CMC、Avicel、PASC，按照1：1的比例混合均匀；
(2)反应液置于45℃下反应6h(CMC、Avicel、PASC)和3h(纤维寡糖)后，煮沸反应液使酶灭活；
(3)将反应液离心，12000rpm，10min，弃去沉淀收集上清酶解产物；
(4)水解产物中加入预冷的乙醇，过夜沉淀除去杂质后烘干；
(5)加入适当的蒸馏水使产物溶解，即得水解产物。
薄层层析法(TLC)检测：
(1)将薄板置于120℃烘箱(除去挥发性杂质和水分，提高分离效率)中1h活化并置于干燥器中备用；
(2)配制展开剂(约60mL)：按正丁醇：乙酸：水＝3：2：1混合，实验前加入展层缸中约20min，防止边缘效应；
(3)点样：标准品点样量为1μL(葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖)，各个样品点样量为2μL；
(4)将展层缸置于通风橱中，室温下展层两次，每次约1.5h；
(5)样品显色：配制显色剂(约20mL)：按浓硫酸：乙醇＝1：9(v：v)混合，将显色剂均匀的喷洒在薄板表面并用吹风机烘干，然后放入120℃烘箱中显色5min；
(6)根据标准品判断EG5C-1与各个突变体的水解产物情况。
实验结果如图9所示，可以看出，持续性内切纤维素酶EG5C-1与最佳突变体N105H/T205S/D233L对于CMC、Avicel和PASC底物的水解产物主要以纤维二糖和纤维三糖为主。EG5C-1与突变体N105H/T205S/D233L对于纤维寡糖的水解模式相同，能够水解纤维三糖、四糖、五糖，但不能水解纤维二糖。
实施例7持续性内切纤维素酶最佳突变体对滤纸的水解性能
将2.5％(w/v)的烘干滤纸(cytiva)与Na2HPO4-KH2PO4(50mM，pH6.0)混合，分别加入40μg/mL的持续性内切纤维素酶EG5C-1及其最佳突变体N105H/T205S/D233L酶液，将混合物于200rpm，45℃下振荡24h，以无酶液的混合液做对照，研究原始酶与突变体对滤纸的水解性能。水解效果如图10所示。可以看出，除对照组外，滤纸溶液都出现了浑浊现象且滤纸呈现出细小纤维的状态，其中突变体组的滤纸在24h后几乎完全水解为滤渣，表明突变体相比于原始酶具有更高的水解性能。
由以上实施例可知，本发明提供了一种内切纤维素酶突变体及其应用，获得的持续性内切纤维素酶突变体的酶活显著提高，具有较高的催化活性，为纤维素原料的工业化生物转化提供新的可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种内切纤维素酶突变体，其特征在于，所述突变体为：如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第105位、第205位、第233位中的任意一位或几位氨基酸位点发生取代突变后的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述第105位的氨基酸取代突变是氨基酸序列第105位的天冬酰胺由丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸或组氨酸中的任意一种氨基酸取代；
所述第205位的氨基酸取代突变是氨基酸序列第205位的苏氨酸由精氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸中的任意一种氨基酸取代；
所述第233位的氨基酸取代突变是氨基酸序列第233位的天冬氨酸由丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或亮氨酸中的任意一种氨基酸取代。
3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体为：如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第105位的天冬酰胺由组氨酸取代、第205位的苏氨酸由丝氨酸取代和第233位的天冬氨酸由亮氨酸取代后的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.9中任一项所示。
5.编码权利要求1～4任一项所述突变体的核苷酸序列。
6.包含权利要求5所述核酸序列的表达载体。
7.包含权利要求6所述表达载体的宿主细胞。
8.权利要求1～4任一项所述的突变体，或权利要求5所述的核苷酸序列，或权利要求6所述的表达载体，或权利要求7所述的宿主细胞在纤维素生物降解中的应用。
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