CN117736891A - 一株可降解氨基甲酸乙酯的酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents

一株可降解氨基甲酸乙酯的酿酒酵母菌株及其应用 Download PDF

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张惠玲
潘琳
李奎
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Abstract

本发明涉及一种通过降解氨基甲酸乙酯提高葡萄酒质量安全的酿酒酵母菌及其应用，属于酿造酒技术领域。所述菌株具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NXDXJZ2，保藏编号CGMCC No.25237。该菌株具有突出的降解氨基甲酸乙酯的性能，EC降解率达到59.92％，同时具有优良的酿酒特性，颜色饱满协调，香气纯正、优雅，口感圆润，酒体饱满，结构丰富，酸度适中，回味悠长，且理化指标与商业酿酒酵母制备的葡萄酒无明显差异，将其应用于葡萄酒的酿造中能够极大的降解对人体有害的氨基甲酸乙酯，提高葡萄酒产品的安全性能。

Description

一株可降解氨基甲酸乙酯的酿酒酵母菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及一种通过降解氨基甲酸乙酯提高葡萄酒质量安全的酿酒酵母菌，属于酿造酒技术领域。
背景技术：
随着人们的生活水平提高，对食品安全的意识也不断上升，特别是近年来对酒类安全的关注意识日益增强。氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)是2A类致癌物，在酵母菌发酵食品中或多或少会产生，主要是由乙醇与部分氨基酸形成，在酒类产品中常见。联合国粮农组织规定葡萄酒中EC不得超过20μg/L，否则存在安全隐患。因此，本研究通过筛选获得一株宁夏本土优良葡萄酒酿酒酵母，其兼有可降解EC的特点，并将其在葡萄酒酿造中进行应用，为酿造宁夏本土特色葡萄酒和宁夏葡萄酒的安全控制提供支撑。
发明内容：
为解决上述问题，本发明通过分离得到一株可降解氨基甲酸乙酯的酿酒酵母菌，本申请利用YPD、WL培养基初步从宁夏产区的葡萄中取样分离出若干株酿酒酵母，并分别以氨基甲酸乙酯(EC)为唯一碳源和氮源的培养基进一步筛选出可降解EC的酿酒酵母菌株，通过耐受性、EC降解能力实验、18S rDNA分子鉴定获得一株性能优越的酿酒酵母，之后进行葡萄酒发酵实验，结合GC-IMS及感官分析，进一步确定其产酒特性。
本发明提供的技术方案之一，是一株可降解氨基甲酸乙酯的酿酒酵母，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NXDXJZ2。该菌株已于2022年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.25237。
所述菌株NXDXJZ2具有如下特性：
(1)能够降解氨基甲酸乙酯(EC)，EC降解率达到59.92％；
(2)既可以EC为碳源也可以EC为氮源进行生长；
(3)酒精耐受性：能够耐受16％以上的乙醇；
(4)高糖耐受性：葡萄糖耐受浓度为320mg/L以上；
(5)二氧化硫耐受性：二氧化硫耐受浓度为300mg/L。
本发明提供的技术方案之二，是方案一所述酿酒酵母NXDXJZ2的应用；特别是在葡萄酒酿造中的应用，更特别的是在氨基甲酸乙酯降解中的应用。
有益效果：
本发明经过筛选获得的一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NXDXJZ2，该菌株具有突出的降解氨基甲酸乙酯的性能，EC降解率达到59.92％，同时具有优良的酿酒特性，颜色饱满协调，香气纯正、优雅，口感圆润，酒体饱满，结构丰富，酸度适中，回味悠长，且理化指标与商业酿酒酵母制备的葡萄酒无明显差异，将其应用于葡萄酒的酿造中能够极大的降解对人体有害的氨基甲酸乙酯，提高葡萄酒产品的安全性能。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。本发明中未进行特说明的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1可降解氨基甲酸乙酯(EC)酿酒酵母菌筛选
筛选流程：采样→初筛→复筛→可降解(EC)酿酒酵母菌→耐受性实验→菌种鉴定→酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NXDXJZ2。
1、初筛
取样品(葡萄)进行破碎处理，分别进行自然发酵72h后取样，依次稀释为10-1～10-8后取1ml接种于WL固体培养基上进行涂布，28℃下进行培养36h。选择奶油色、形态呈球型凸起，表面光滑、不透明、奶油状菌落特征的为酵母菌。
初筛结果：符合以上菌落形态要求，获得了10株酵母菌株。
2、复筛
将初筛获得的10株酵母菌株分别接在EC为唯一氮源、碳源培养基上，28℃下进行培养。如果在两个培养基上都长出明显的单菌落，并且可以使含有溴甲酚紫的EC培养基颜色由黄变紫，说明该菌株可降解EC，选择该菌株进一步进行耐受性、降解力实验，从中筛选优良酿酒酵母。
其中：
EC为唯一氮源培养基(g/L)：氨基甲酸乙酯2.5，葡萄糖2.0，磷酸二氢钾2.0，乙酸钠2.0，氯化钠2.0，溴甲酚紫0.001，琼脂20.0，其余为水。
EC为唯一碳源培养基(g/L)：氨基甲酸乙酯2.5，磷酸氢二胺2.5，磷酸二氢钾2.5，乙酸钠2.0，氯化钠2.0，溴甲酚紫0.001，琼脂20.0，其余为水。
3、降解率高的酵母菌筛选
对上述筛选获得的能够代谢EC的8株菌进行EC降解率测定。将8株酵母菌株分别接种在添加EC浓度为10μg/mL的YPD液体培养基中，28℃下进行培养。72小时后，测定EC含量，选择EC降解率高的的3株菌进一步做耐受性试验。EC含量的测定：参照国标GB5009.223-2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》。
其中，EC降解率(％)＝(培养基中原始EC含量－残留EC含量)/培养基原始中EC含量。结果如表1所示：
表1 EC降解率比较
菌株编号 降解率％
菌株1 33.21％
菌株2 59.92％
菌株3 34.74％
菌株4 30.54％
菌株5 21.11％
菌株6 24.93％
菌株7 32.98％
菌株8 32.01％
4、酵母菌耐受性实验
(1)乙醇耐受性能的测定
选择EC降解率高的3株酵母菌(菌株1、2、3)经过增殖培养后菌浓达到107CFU/mL，按2％的接种量接入含不同浓度乙醇的YPD培养基中，放入28℃培养箱培养24h，在600nm下测定OD值。结果如下表2所示：
表2乙醇耐受性培养结果(OD600)
乙醇浓度 4％ 8％ 12％ 14％ 16％
菌株1 +++ +++ +++ +++ ++
菌株2 +++ +++ +++ +++ +++
菌株3 +++ +++ +++ +++ +
注：+++，代表耐受性最好，菌浓度均在106CFU/mL以上；++代表菌浓度均在104—106CFU/mL，+代表耐受性差，菌浓度均在103CFU/mL以下。
(2)葡萄糖耐受性能的测定
将复筛得到的3株酵母菌(菌株1、2、3)经过增殖培养后菌浓达到107CFU/mL，按2％的接种量接入含不同浓度葡萄糖的YPD培养基中，放入28℃培养箱培养24h，在600nm下测定OD值。结果如下表3所示：
表3葡萄糖耐受性培养结果(OD600)
葡萄糖浓度 160mg/L 200mg/L 240mg/L 280mg/L 320mg/L
菌株1 +++ +++ +++ +++ +
菌株2 +++ +++ +++ +++ +
菌株3 +++ +++ +++ +++ +
注：+++，代表耐受性最好，菌浓度均在106CFU/mL以上；++代表菌浓度均在104-106CFU/mL，+代表耐受性差菌浓度均在103CFU/mL以下。
(3)二氧化硫耐受性能的测定
将复筛得到的3株酵母菌(菌株1、2、3)经过增殖培养后菌浓达到107CFU/mL，按2％的接种量接入含不同浓度SO2的YPD培养基中，放入28℃培养箱培养24h，在600nm下测定OD值。结果如下表4所示：
表4 SO2耐受性培养结果(OD600)
葡萄糖浓度 70mg/L 200mg/L 230mg/L 260mg/L 300mg/L
菌株1 +++ +++ +++ +++ ++
菌株2 +++ +++ +++ +++ +++
菌株3 +++ +++ +++ ++ ++
注：+++，代表耐受性最好，菌浓度均在106CFU/mL以上；++代表菌浓度均在104-106CFU/mL，+代表耐受性差菌浓度均在103CFU/mL以下。
综合以上实验结果，筛选出1株乙醇、葡萄糖耐受、二氧化硫耐受性好的酵母菌株-菌株2，具体结果如下：
乙醇耐受性：乙醇浓度16％以上；
二氧化硫耐受浓度为300mg/L以上；
葡萄糖耐受浓度为320mg/L。
EC降解率59.92％。
5、菌种鉴定：
通过以上实验，对可降解(EC)且具有良好耐受性的优良酵母菌株2进行18S rDNA分子鉴定。
基因组提取：将筛选得到的菌株接入YPD液体培养基中静止培养16h，通过离心获得上清，收集菌体。使用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母基因组。
18S rDNA序列扩增(25L)：DNA提取1μL、NS上下游引物各1μL(NS1GTAGTCATATGCTTGTCTC/NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC)、双蒸水9.5μL、PER Mix混合液12.5μL、PCR扩增条件为：25L反应体积，95℃预变性5min，95℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min。取3μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，条带清晰，送上海生工生物工程股份有限公司测序。
18S rDNA序列如下(SEQ ID NO.1)：
TTGGGCCTTCCAAGAATCCAAGAATCCCCGAATTCCGCCATTCCCCTTACCT
ATCCCATTTCCCTGCCTTCCTCCTCCATGCCAAAACCCAGAAATCCCTTGGT
GGAAGTTTTTAATATTTTAAAATCTTCAGTTACGAAAATTCTTGTGTTGACA
AATTTATGATAATAAATTGTTTGTGTTGTTACCTCTGGGCCCCATTCCTCAAT
GCCCAGAAAAAGTTGCAAAGATATGAAACTCACATGTGTTGTATTGAAACG
GTTTTAATTGTCCTATACCAAGCACGAAATCTCTCACCGTTTGGATAGCAGA
AAGAAACTACAGCCTAGCAGAACGCGCACTAAGCGCAGCTGCTGGACTCT
CATCCTGGCTCTGGCAGTAAGCTTCATGCCTGCAACAAATCATTCATATAAT
CTTATGATCTCGCAGTCCTACGAGTAGATCATAGATGATACTTGAATGATTTG
TGCAGCATGAGCTTACTGCAGAGACAAGTGAGTCAGCGCTGCTATGCGCTC
AGCTTAATCCTGCTACACTGATCGCTGTAGCATACGTACTGATCACTGCATT
GC
18S rDNA序列与NCBI数据库中进行BLAST比对，选择序列相似度为99％菌，利用Mega 5.0软件进行系统发育进化树绘制，并用Bootstrap对进化树进行1000次置信度分析。确定上述菌株2为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，遂将该菌命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NXDXJZ2，并于2022年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.25237。
实施例2酿酒酵母NXDXJZ2在葡萄酒酿造中的应用
1、发酵用菌株的培养
(1)酿酒酵母NXDXJZ2扩大培养
将酿酒酵母NXDXJZ2和市面上的其他10株商业酿酒酵母菌株分别接种至50mL(YPD+葡萄汁)混合培养基28℃培养24h后，测定菌体细胞浓度达107CFU/mL，进行以下酿酒实验。
YPD+葡萄汁培养基:1％酵母膏，2％蛋白陈，2％葡萄糖，10％葡萄汁；若制固体培养基，加入2％琼脂粉。
(2)商业葡萄酒酿造专用乳酸菌活化
按照商业乳酸菌说明书，取干粉乳酸菌，加入10倍纯净水，37℃下30分钟即可。
2、葡萄酒酿造工艺流程
红葡萄除梗破碎→三角瓶中→加果胶酶、亚硫酸→接种发酵→测定残糖→取样测定。
具体如下：
取赤霞珠葡萄破碎入三角瓶中，加入SO2 60mg/L和果胶酶40mg/L，调整pH 3.3，8h后，按1％的接种量将步骤1获得的酿酒酵母NXDXJZ2及其他10株商业酿酒酵母菌株菌液分别接入，在28℃恒温箱中酒精发酵，当残糖小于1％时，酒精发酵结束，之后将发酵液皮渣分离，接种0.1％乳酸菌(步骤1制备)，在21℃进行苹果酸-乳酸发酵，当测定酒中苹果酸已经被乳酸菌消耗完，结束发酵。取样测定感官评分、降解EC情况、相关理化指标、葡萄酒挥发性成分。具体结果如下：
(1)感官评价
NXDXJZ2菌株酿造出的红葡萄酒颜色饱满协调，香气纯正、优雅，口感圆润，酒体饱满，结构丰富，酸度适中，回味悠长优于其他菌株。
(2)菌株NXDXJZ2与商业酿酒酵母酿造葡萄酒理化指标、EC含量比较，结果见表5。
表5 NXDXJZ2与商业酿酒酵母酿造葡萄酒理化指标与EC含量比较
由表5所示，酿酒酵母NXDXJZ2酿造的红葡萄酒在酒精度、总糖、pH值方面与商业酿酒酵母酿造的红葡萄酒无明显差异，但在葡萄酒的EC含量方面有较大的差异，商业酵母酿造的红葡萄酒中EC含量明显高于NXDXJZ2酿造的红葡萄酒。说明NXDXJZ2菌株能够较好的降解葡萄酒中的EC，效果显著。
综上所述，本申请筛选获得的可降解EC的酿酒酵母菌NXDXJZ2，通过各项实验指标比较，该菌不但具有优异的降解EC的能力，而且酿造葡萄酒性能良好，可广泛应用于葡萄酒的酿造中。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

Claims (4)

1.一株可降解氨基甲酸乙酯的酿酒酵母，其特征在于，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NXDXJZ2，保藏编号CGMCC No.25237。
2.权利要求1所述酿酒酵母NXDXJZ2的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是在葡萄酒酿造中的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，是在氨基甲酸乙酯降解中的应用。
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