CN117721186A - 一种低丰度lncRNA的RT-qPCR检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低丰度lncRNA的RT‑qPCR检测方法。该方法为：在待检样本RNA的两端加入接头序列，其中3'端接头序列含有随机6碱基序列，5'端通过T4RNA连接酶或者SMARTScribeTM逆转录酶加上接头序列；然后进行反转录，反转录的双链cDNA模板进行PCR预扩增，预扩增产物再进行RT‑qPCR检测。本发明对常规RT‑qPCR技术进行改进，使得血浆小型胞外囊泡低丰度的lncRNA能够被检测出来，不仅降低了临床医疗生物样本收集难度，也减少患者额外的痛苦，为血浆小型胞外囊泡lncRNA在临床诊断、转化医学研究等方面的应用奠定坚实的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种低丰度lncRNA的RT-qPCR检测方法。
背景技术
小型胞外囊泡是直径约为30-150nm，来源于晚期核内体在细胞内进一步组装运输分泌至细胞外环境中的囊泡，又称外泌体。外泌体广泛存在于几乎所有的生物体液中，诸如血液、尿液、胆汁、唾液、胸腔灌洗液、腹水和细胞上清液等中，为细胞与细胞之间、细胞内与细胞外环境之间进行物质运输、信息交流和能量代谢，并参与多种疾病的发生发展。近年来，越来越多的研究表明外泌体具有多种生物功能，如维持细胞稳态、作为疾病早期诊断生物标志物、参与疾病复发耐药进程、作为药物递送载体参与疾病治疗等，而这些功能作用主要依赖于外泌体丰富的核酸、蛋白和脂质等内容物。Bin Hu等人研究结果表明前列腺癌细胞释放外泌体lncPCA3的表达水平明显高于炎性或正常的前列腺组织，可作为有效的前列腺癌诊断生物标志物(PMID：24863945)。但是，由于血浆外泌体中lncRNA(长链非编码RNA，Long non-coding RNA)的含量较低，关于血浆外泌体lncRNA的研究要远远少于血浆外泌体miRNA的研究，目前血浆外泌体lncRNA的研究和应用仍处于起步阶段。
目前，用于检测lncRNA的方法主要包括Northern印迹、基因芯片、RNA-seq、ddPCR和RT-qPCR等。最早使用Northern印迹法检测lncRNA,其利用电泳技术按照片段大小来分离RNA并利用能与目标片段的部分或全部序列互补的探针进行检测，但是处理过程中易导致RNA样本降解，且灵敏度不佳，同时在实验操作过程中设计的相关化学试剂如溴化乙锭、甲醛等对人体有害。基因芯片是由固定在网格中的DNA探针文库组成，能够和转录成的cDNA杂交并与荧光探针结合，但是该技术只能对已知的lncRNA分析检测，另外检测结果可能是因非特异性杂交导致的假阳性信号，且不能鉴定lncRNA的变异类型。RNA-seq技术可能是目前揭示lncRNA存在和量化的最准确的检测技术，可以检测多种lncRNA亚型，以及未知的lncRNA，但是该技术成本昂贵，操作和分析过程复杂。ddPCR由于其较高稳定性、技术可重复性、具有更高灵敏度和准确性等特点，可用于检测低核酸含量的外泌体lncRNA，但是需要进行数据标准化来减少预实验操作、样本收集和数据测量等相关方面的变化。实时荧光定量PCR(Real-Time quantitative PCR,RT-qPCR)是对长链编码RNA(coding RNA)和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)进行定量表达最常用的检测方法。然而，由于血浆小型胞外囊泡(外泌体)本身lncRNA含量较低，常规RNA逆转录成cDNA后直接用于RT-qPCR定量的方法灵敏度较低，特别是对于二代测序每百万比对到参考基因组上的Reads中每千个碱基转录本上的reads数(Transcripts PerKilobase ofexon model per Million mappedreads,TPM)＜100的低丰度lncRNA往往超出常规RT-qPCR的检测范围。而通过增加生物样本投入量以富集到足量的RNA满足RT-qPCR定量检测要求，不仅增加了临床样本收集难度，同时增加了患者的痛苦，更重要的是极大限制了血浆小型胞外囊泡lncRNA在癌症的早期诊断、预后监测等方面的应用。
因此，急需一种操作简单高灵敏度的检测方法来检测血浆外泌体中低丰度的lncRNA，助力外泌体lncRNA在疾病诊断方面的应用。
发明内容
本发明的目的是，提供一种低丰度lncRNA的检测方法。旨在解决现有技术中RT-qPCR方法难以检测到低丰度lncRNA的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种低丰度lncRNA的检测方法，该方法为：在待检样本RNA的两端加入接头序列，其中3'端接头序列含有随机6碱基序列，5'端通过T4 RNA连接酶或者SMARTScribeTM逆转录酶加上接头序列；然后进行反转录，反转录的双链cDNA模板进行PCR预扩增，预扩增产物再进行RT-qPCR检测。
作为优选实施方案，所述接头序列是依据碱基平衡和引物特异性原则设计的长度20-40碱基的序列。
作为优选实施方案，所述待检样本RNA为血浆外泌体lncRNA。
作为优选实施方案，所述待检样本RNA的两端加入接头序列的方法为：利用商品化的包含随机6碱基引物的SMART Pico Oligos Mix或包含LAN-TSO接头的TemplateSwitching Oligo Mix加入接头序列。SMART Pico Oligos Mix可采用Clontech公司的635005试剂盒产品；包含LAN-TSO接头的Template Switching Oligo Mix可采用Takara或表观生物公司的商品化产品。使用商品化的接头序列，需要与其试剂盒产品中的引物配套使用。
本发明还提供一种低丰度lncRNA的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
步骤1，向待检测RNA样本中加入SMART Pico Oligos Mix，混匀，70-75℃孵育2-4min进行退火，结束后置于-5-5℃；
步骤2，向步骤1反应结束后的体系中加入一链合成混合液合成cDNA，所述一链合成混合液的组成为：5X一链缓冲液、模板切换Oligo Mix、RNase抑制剂、SMARTScribe逆转录酶；
步骤3，向步骤2的cDNA产物体系中加入配制好的PCR扩增混合液和引物进行cDNA模板预扩增，所述PCR扩增混合液的组成为：2X SeqAmp PCR缓冲液、SeqAmp DNA聚合酶、无酶水；
步骤4，设计低丰度lncRNA引物，以步骤3的cDNA模板预扩增产物为模板，配制RT-qPCR反应体系，进行扩增检测。
作为优选实施方案，所述方法用于检测血浆外泌体中的SNHG8或FGD5-AS1。
作为优选实施方案，检测SNHG8基因的引物为SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQID NO:2所示的下游引物。
作为优选实施方案，检测FGD5-AS1基因的引物为SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明对常规RT-qPCR技术进行改进，使得血浆小型胞外囊泡低丰度的lncRNA能够被检测出来，不仅降低了临床医疗生物样本收集难度，也减少患者额外的痛苦，为血浆小型胞外囊泡lncRNA在临床诊断、转化医学研究等方面的应用奠定坚实的基础。
2，本发明发现血浆小型胞外囊泡SNHG8和FGD5-AS1无法通过常规RT-qPCR检测出来；通过本发明检测方法则能够检出SNHG8和FGD5-AS1。
附图说明
图1为本发明实施例1中小型胞外囊泡的透射电镜图。
图2为本发明实施例1中为小型胞外囊泡的NTA数据分析结果图。
图3为本发明实施例1中采用反转录试剂盒(A28007，Applied BiosystemsTM，USA)检测SNHG8的扩增曲线图。
图4为本发明实施例1中采用反转录试剂盒(A28007，Applied BiosystemsTM，USA)检测FGD5-AS1的扩增曲线图。
图5为本发明实施例1中UC-NA组SNHG8的扩增曲线图。
图6为本发明实施例1中UC-NA组FGD5-AS1的扩增曲线图。
图7为本发明实施例1中UC-A组SNHG8的扩增曲线图。
图8为本发明实施例1中UC-A组FGD5-AS1的扩增曲线图。
图9为本发明实施例1中小型胞外囊泡lncRNA中SNHG8和FGD5-AS1的CT值结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
(1)样本收集和实验分组
共收集17例健康人的血液样本，分离好血浆后全部混匀再分装用于后续血浆小型胞外囊泡的分离和RNA的抽提。血浆小型胞外囊泡的分离采用UC法，根据RNA逆转录成cDNA模板的方式实验分为2组：无预扩增(UC-NA)组、预扩增(UC-A)组，每组三次重复。
(2)血浆样本分离
所有健康人的血液样本均采集到10ml抗凝血的真空采血管中(REF367525,BD,USA)，随后样本在4℃低温条件下寄送。对收到的血样首先在4℃条件下1600g离心10min，去除细胞或细胞碎片，其次转移上清液在4℃条件下16000g离心15min，离心后转移上清液到50ml的离心管中，混匀后分装成每管1ml，-80℃冰箱中保存待用。
(3)血浆小型胞外囊泡的分离及特征鉴定
1)血浆小型胞外囊泡的分离
将分装保存的血浆样本取出，待在37℃水浴锅中至完全融化后，4℃条件下12000g离心10min，离心结束后将血浆转移到新的0.45μm管过滤器(Costar,CLS8163-100EA,Corning,USA)中，在4℃条件下12000g离心5min收集过滤液，转移过滤液到0.22μm管过滤器(Costar,CLS8161-100EA,USA)中，同样在4℃条件下12000g离心5min收集过滤液。将过滤液加入到超速离心管(332245A，Hitachi Koki,Japan)中，同时每管加入4ml PBS，并用PBS配平，配平后放置到超速离心机中，设置离心条件120000g，4℃离心2h，离心结束后弃上清，加入200μL PBS重悬。该实施例中采用的PBS均为0.01M、PH7.4的缓冲液。
2)血浆小型胞外囊泡的特征鉴定
采用透射电镜检测血浆小型胞外囊泡形态，利用纳米颗粒跟踪分析仪(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)检测血浆小型胞外囊泡的粒径分布。
血浆小型胞外囊泡形态特征鉴定：首先将获得的血浆小型胞外囊泡用PBS重悬，其次加入4％多聚甲醛对血浆小型胞外囊泡进行固定，将血浆小型胞外囊泡滴到碳包覆的200目电子显微镜铜网上。用PBS清洗铜网2次，用含甘氨酸(50mM)的PBS清洗铜网3min，用含0.5％BSA的PBS再次清洗铜网10min，最后用2％醋酸铀酰对铜网进行染色，染色完成后采用透射电镜(H-7650,Hitachi High-Technologies,Japan)对血浆小型胞外囊泡形态进行特征分析。参见图1，为小型胞外囊泡的透射电镜图。图1的透射电镜结果显示：能看到小型胞外囊泡典型的“马蹄状”形态。
血浆小型胞外囊泡粒径分布检测：首先将血浆小型胞外囊泡用PBS稀释到1*10^7-1*10^9/ml，吹打混匀。随后，打开NTA(NanoSight NS300,Malvern,UK)仪器将稀释后的样本注入样本室，使用488nm激发模块，设置照相机的镜头参数，快门值选择890，增益值选择146，检测阈值设置为7。每个视频至少分析和获得200个完整的轨道。最后，使用NTA分析软件(version 2.3)对血浆小型胞外囊泡的纳米粒子跟踪数据进行分析。参见图2，为小型胞外囊泡的NTA数据分析结果图。NTA结果显示，血浆小型胞外囊泡平均粒径为128nm，符合小型胞外囊泡的粒径分布。
(4)血浆小型胞外囊泡RNA抽提及质控
血浆小型胞外囊泡总RNA的抽提采用miRNeasy Micro Kit(217084,Qiagen,Shanghai,China)，具体的实验流程参考试剂盒说明书。采用安捷伦2100分析仪及AgilentRNA 6000Pico Kit(5067-1513,Agilent,USA)检测血浆小型胞外囊泡总RNA的浓度及片段分布特征。
(5)血浆小型胞外囊泡RNA反转录和低丰度lncRNA RT-qPCR检测
1)无预扩增血浆小型胞外囊泡RNA反转录(UC-NA组)
从-80℃冰箱中取出RNA样本置于冰上溶解，取7μL的RNA样本，加入配制的基因组去除混合液3μL(2μL 5X gDNA Eraser Buffer和1μL gDNA Eraser)，PCR仪中42℃反应2min去除基因组DNA。将配制的逆转录混合液10μL(1μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、1μL RTPrimer Mix、4μL 5X PrimeScript Buffer2(for Real Time)和4μL RNase Free H2O)加入上步反应体系中，PCR仪中37℃反应15min、85℃反应5sec、4℃保持5min进行逆转录反应。逆转录产物cDNA-20℃保存，备用。
2)预扩增血浆小型胞外囊泡RNA反转录(UC-A组)
预扩增血浆小型胞外囊泡RNA反转录采用Stranded Total RNA-SeqKit-Pico Input Mammalian试剂盒(635005，Clontech，USA)在待检样本RNA的两端加入接头序列并进行反转录，同时对反转录的双链cDNA模板进行PCR预扩增。而另外一款相似原理的外泌体长链RNA微量扩增试剂盒(R1801-24，Epibiotek，Guangzhou，China)同样可在待检样本RNA的两端加入接头序列随后进行反转录和模板预扩增。但是针对小片段miRNA进行预扩增的反转录试剂盒(A28007，Applied BiosystemsTM，USA)不适用于血浆小型胞外囊泡lncRNA的预扩增。参见图3和图4，其中图3是采用反转录试剂盒(A28007，AppliedBiosystemsTM，USA)检测SNHG8的扩增曲线图；图4是采用反转录试剂盒(A28007，AppliedBiosystemsTM，USA)检测FGD5-AS1的扩增曲线图。由图3和4可以看到：预扩增后的cDNA模板(UC-A(ABI))不能检测到SNHG8的荧光信号，而FGD5-AS1的CT值为38.207。
Clontech试剂盒预扩增血浆小型胞外囊泡RNA反转录的流程如下：从-80℃冰箱中取出RNA样本置于冰上溶解，取8μL的RNA样本，加入1μL SMART Pico Oligos Mix(635005，Clontech，USA)，移液器吹打混匀，短暂离心，PCR仪中72℃孵育3min进行退火，结束后立即置于冰上2min。配制11μL体系的一链合成混合液，该混合液组成为：4μL5X First-StrandBuffer(RNase-Free，(635005，Clontech，USA))、4.5μL Template Switching Oligo Mix(TSO mix，(635005，Clontech，USA))、0.5μL RNase Inhibitor(2313A，Takara，USA)、2μLSMARTScribe Reverse Transcriptase(639537，Clontech，USA)。添加11μL混合液至上步退火后每个反应管中，移液器吹打混匀，短暂离心，PCR仪中42℃反应90min、70℃反应10min、4℃保持5min，合成的cDNA产物在4℃储存过夜。cDNA产物体系中加入配制好的28μL PCR扩增混合液(2μL无酶水、25μL 2X SeqAmp PCR缓冲液、1μL SeqAmp DNA聚合酶)，正向和反向PCRPrimer HT(Clontech，634420，USA)各加入1μL，移液器轻轻混匀，短暂离心，PCR仪中94℃1min、循环10次(98℃15sec、55℃15sec、68℃30sec)、68℃2min、4℃保持5min进行cDNA模板预扩增，扩增产物-20℃保存。
3)低丰度lncRNA RT-qPCR检测
采用RT-qPCR检测小型胞外囊泡低丰度lncRNA的相对表达。低丰度lncRNA引物在NCBI上设计，在英潍捷基(上海)贸易有限公司合成引物序列。根据exoRBase 2.0数据库RNA-seq的结果挑选在健康人胞外囊泡低表达的SNHG8(TPM平均值是90)和FGD5-AS1(TPM平均值是100)2个lncRNA，具体引物序列信息见表1。
表1
以cDNA或扩增产物为模板，采用2X SYBR Green Mix(1708882AP,Bio-Rad,CA,USA)配置RT-qPCR反应体系：总体系为15μL，包含7.5μL 2X SYBR Green Mix、0.45μL上下游Primer Mix(10μM)、0.5μL cDNA或扩增产物、6.55μL ddH2O，每个实验反应重复3孔。最后采用ABI 7500进行荧光定量，程序设置如下：94℃3min、循环40次(94℃20sec、60℃30sec、72℃30sec)，最后一步熔解曲线为95℃15sec、60℃1min、95℃30sec、60℃15sec。
扩增结果参见图5-8，其中，图5为UC-NA组SNHG8的扩增曲线图；图6为UC-NA组FGD5-AS1的扩增曲线图；图7为UC-A组SNHG8的扩增曲线图；图8为UC-A组FGD5-AS1的扩增曲线图。扩增曲线的结果表明，预扩增UC-A组在40个循环内均能检测到SNHG8、FGD5-AS1的荧光信号，而UC-NA组在40个循环内均未检测到SNHG8、FGD5-AS1的荧光信号。参见图9，为小型胞外囊泡lncRNA中SNHG8和FGD5-AS1的CT值结果图。从lncRNA CT值的结果来看，预扩增UC-A组均能检测到低丰度SNHG8、FGD5-AS1的CT值，而无预扩增UC-NA组检测不到低丰度lncRNASNHG8、FGD5-AS1的CT值。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (8)
1.一种低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于，该方法为：在待检样本RNA的两端加入接头序列，其中3'端接头序列含有随机6碱基序列，5'端通过T4 RNA连接酶或者SMARTScribeTM逆转录酶加上接头序列；然后进行反转录，反转录的双链cDNA模板进行PCR预扩增，预扩增产物再进行RT-qPCR检测。
2.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：所述接头序列是依据碱基平衡和引物特异性原则设计的长度20-40碱基的序列。
3.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：所述待检样本RNA为血浆外泌体lncRNA。
4.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于，所述待检样本RNA的两端加入接头序列的方法为：利用商品化的包含随机6碱基引物的SMART Pico Oligos Mix或包含LAN-TSO接头的Template Switching Oligo Mix加入接头序列。
5.根据权利要求1所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
步骤1，向待检测RNA样本中加入SMART Pico Oligos Mix，混匀，70-75℃孵育2-4min进行退火，结束后置于-5-5℃；
步骤2，向步骤1反应结束后的体系中加入一链合成混合液合成cDNA，所述一链合成混合液的组成为：5X一链缓冲液、模板切换Oligo Mix、RNase抑制剂、SMARTScribe逆转录酶；
步骤3，向步骤2的cDNA产物体系中加入配制好的PCR扩增混合液和引物进行cDNA模板预扩增，所述PCR扩增混合液的组成为：2X SeqAmp PCR缓冲液、SeqAmp DNA聚合酶、无酶水；
步骤4，设计低丰度lncRNA引物，以步骤3的cDNA模板预扩增产物为模板，配制RT-qPCR反应体系，进行扩增检测。
6.根据权利要求1-5任一项所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：所述方法用于检测血浆外泌体中的SNHG8或FGD5-AS1。
7.根据权利要求6所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：检测SNHG8基因的引物为SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。
8.根据权利要求6所述的低丰度lncRNA的检测方法，其特征在于：检测FGD5-AS1基因的引物为SEQ ID NO:3所示的上游引物和SEQ ID NO:4所示的下游引物。
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