CN117721092A - Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒 - Google Patents
Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117721092A CN117721092A CN202410092366.XA CN202410092366A CN117721092A CN 117721092 A CN117721092 A CN 117721092A CN 202410092366 A CN202410092366 A CN 202410092366A CN 117721092 A CN117721092 A CN 117721092A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- dna polymerase
- primer
- bst dna
- lamp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 67
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 title claims abstract description 67
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 120
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 65
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 21
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 6
- 229910001413 alkali metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 4
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- -1 ammonium ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 2
- 101150063938 ply gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CN1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O OHVLMTFVQDZYHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Chemical group 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700043004 Streptococcus pneumoniae plY Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 150000004694 iodide salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒，涉及生物技术领域。该Bst DNA聚合酶突变体含有如下突变：对应于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，存在T186L、G311K、T488E和E557R突变。该Bst DNA聚合酶突变体具有高活性，高产物得率的优点，使用突变后Bst DNA聚合酶，可以将LAMP扩增反应时间显著缩短，有效地提高了反应效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒。
背景技术
肺炎链球菌(S.Pneumoniae)为革兰阳性球菌，常成对或成短链状排列，是上呼吸道正常的寄居菌群，当免疫力降低时入侵机体，引起肺炎、脑膜炎、中耳炎等侵袭性疾病。全球每年有160万人死于肺炎链球菌性疾病，其中70-100万例为5岁以下儿童，占5岁以下儿童死亡总数的11％。因此快速准确的临床检测，对于后期的治疗和康复起到了十分重要的作用。
在患病早期，通过及时快速的诊断出病原体，及早反应出临床感染，对于患者的后期治疗提供正确的方向。然而，目前实验室检测肺炎链球菌的为病原体分离培养、血清学检测和分子生物学检测。已知，肺炎链球菌的生长和鉴定通常需要两天以上，操作复杂，尤其在患病初期，极有可能因为病原体数量较少出现假阴性，这种延误的诊断可能会导致患者的预后不佳。病原体血清抗原检测因此灵敏度低，限制了其在临床实验室的广泛应用。PCR技术因高敏感性和高特异性等优点，快速成为首推的重要的检测手段之一，但是由于PCR技术依赖特定场所，仪器，以及需要专业的操作人员等问题，不适合病原体检测的常规开展。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种体外恒温扩增技术，利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，和传统核酸技术相比，避免常规PCR对温度循环的特殊要求、高效灵敏，其在60min扩增效率可达109-1010个数量级、特异性强，费用低、操作简单等优点，在病原微生物的快速检测等领域显示出巨大的应用潜力。但是目前的Bst DNA聚合酶还存在链置换能力弱，产物得率低等问题，
同时，LAMP产物的结果判读形式多样化，且不同的判读方法有或多或少的问题存在。检测手段主要包括琼脂糖凝胶电泳、焦磷酸镁浊度检测、荧光定量检测和目测等。其中琼脂糖凝胶电泳需要开盖检测，容易造成气溶胶污染。荧光定量检测则需要特殊仪器，检测成本较高。浊度检测同样需要浊度检测仪的辅助进行结果判读。
综上所述，现有的肺炎链球菌的传统检测方式存在检测速度慢、灵敏度较差、操作繁琐复杂、场地依赖及专业性限制性强等劣势，改进上述缺陷是目前肺炎链球菌检测产品亟需解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Bst DNA聚合酶突变体，以缓解现有技术中Bst DNA聚合酶链置换能力弱，产物得率低等问题，以及基于该Bst DNA聚合酶突变体的应用和LAMP扩增反应试剂或试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种肺炎链球菌LAMP检测试剂盒，以缓解前述肺炎链球菌检测产品中的至少一种缺陷。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
第一方面，提供了一种Bst DNA聚合酶突变体，该Bst DNA聚合酶突变体含有如下突变：对应于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，存在T186L、G311K、T488E和E557R突变。
可选的实施方式中，所述Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，还提供了第一方面的Bst DNA聚合酶突变体在LAMP扩增反应，或制备用于实现LAMP扩增反应的试剂或试剂盒中的应用。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增反应的目的片段来源于肺炎链球菌。
第三方面，还提供了一种LAMP扩增反应试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒包含用于LAMP扩增反应的反应组分，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包含第一方面的Bst DNA聚合酶突变体。
可选的实施方式中，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包括所述Bst DNA聚合酶突变体、钾离子、镁离子、铵离子、表面活性剂、dNTPs、颜色指示剂和碱；
可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒包括Bst DNA聚合酶突变体0.3～0.75U/μL，KCl 50～100mM，(NH4)2SO4 10～20mM，MgSO4 8～15mM，Tween-20 0.1～0.2％v/v，dNTPs1.4～3.0mM，酚红0.05～0.2mM和KOH 1.5～2mM。
可选的实施方式中，所述用于LAMP扩增反应的反应组分为预混试剂2×LAMP mix，其含有0.6～1.5U/μL，KCl 100～200mM，(NH4)2SO4 20～40mM，MgSO4 16～30mM，Tween-200.2～0.4％v/v，dNTPs 2.8～6.0mM，酚红0.1～0.4mM和KOH 3～4mM。
第四方面，还提供了一种肺炎链球菌LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包含第一方面的Bst DNA聚合酶突变体和用于LAMP扩增的引物组合物；
所述引物组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的内引物FIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的环引物Loop F，和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的环引物Loop B；
可选的实施方式中，外引物F3和外引物B3的浓度分别独立的为0.2～1.6μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度分别独立的为0.2～3.2μM，环引物Loop F和环引物Loop B的浓度分别独立的为0.2～3.2μM。
可选的实施方式中，所述的肺炎链球菌LAMP检测试剂盒还包括第三方面中的用于LAMP扩增反应的反应组分，优选包括所述预混试剂2×LAMP mix。
第五方面，还提供了一种非诊断和治疗目的的肺炎链球菌的检测方法，所述检测方法包括采用LAMP扩增待测样本，LAMP扩增中使用第一方面的Bst DNA聚合酶突变体催化反应。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应时间为10～20min，反应温度为60～65℃。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应条件为65℃反应15min。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应试剂中含有颜色指示剂，根据反应体系的颜色变化直接裸眼判断结果。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增中使用第四方面中所述的用于LAMP扩增的引物组合物扩增靶基因。
可选的实施方式中，使用第四方面的肺炎链球菌LAMP检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的Bst DNA聚合酶突变体具有高活性，高产物得率的优点，使用突变后Bst DNA聚合酶，可以将LAMP扩增反应时间显著缩短，有效地提高了反应效率。
基于Bst DNA聚合酶突变体本发明还提供了LAMP扩增反应试剂或试剂盒和肺炎链球菌LAMP检测试剂盒。肺炎链球菌LAMP检测试剂盒以肺炎链球菌的ply基因的保守序列设计并筛选出一组LAMP引物，能够在短时间内对肺炎链球菌进行有效扩增，具有特异性好的优点，且可以检测的模板量低至皮克级别，还具有灵敏度高的优点。
在优选的方案中，使用优化的含有颜色指示剂的LAMP扩增反应试剂，还具有如下优势：(1)能有效避免假阳性干扰：反应体系中包含颜色指示剂，不影响扩增效率，既可以裸眼观察反应结果，又避免了开盖检测带来的气溶胶污染，从而有效避免了假阳性的干扰。(2)结果鉴定便捷、精准：采用优化后的含有最佳浓度比的颜色指示剂的反应组分，阴性和阳性的结果颜色区分明显，可以准确判读结果。
综上所述，本发明通过提供一种高活性，高产物得率的Bst DNA聚合酶突变体，提高了LAMP扩增反应的反应效率，基于该Bst DNA聚合酶突变体的检测方法和检测产品不需要复杂的仪器和操作，无场地依赖性及专业性，可以在恒温反应中快速、特异、灵敏地检测靶物质，在优选的含有颜色指示剂的反应体系中，还具有结果判读简便的优势。基于该BstDNA聚合酶突变体的检测方法和检测产品可用于检测肺炎链球菌的方法以辅助诊断，便于及时快速的诊断病原体、及早反映出临床感染，为预后提供及时有效的措施提供准确判断依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中分别使用野生型和突变型Bst DNA聚合酶扩增待测样品的扩增曲线；
图2为实施例4中不同Mg2+浓度的反应体系反应后产物照片，其中C1(C1、1-1～3)Mg2+浓度为9mM，C2(C2、2-1～3)Mg2+浓度为10mM，C3(C3、3-1～3)Mg2+浓度为12mM，C4(C4、4-1～3)Mg2+浓度为14mM，C5(C5、5-1～3)Mg2+浓度为16mM，C6(C6、6-1～3)Mg2+浓度为18mM，C7(C7、7-1～3)Mg2+浓度为20mM，C8(C8、8-1～3)Mg2+浓度为24mM，C9(C9、9-1～3)Mg2+浓度为30mM，其中C1～9为阴性对照；
图3为实施例4中不同KOH浓度的反应体系反应后产物照片，其中C1(C1、1-1～3)KOH浓度为3mM，C2(C2、2-1～3)KOH浓度为3.2mM，C3(C3、3-1～3)KOH浓度为3.4mM，C4(C4、4-1～3)KOH浓度为3.6mM，C5(C5、5-1～3)KOH浓度为3.8mM，C6(C6、6-1～3)KOH浓度为4mM，其中C1～6为阴性对照；
图4为实施例4中不同Bst DNA聚合酶突变体浓度的反应体系反应后产物照片，其中，1为Bst DNA聚合酶突变体浓度0.6U/μL，2为Bst DNA聚合酶突变体浓度0.8U/μL，3为BstDNA聚合酶突变体浓度1.0U/μL，4为Bst DNA聚合酶突变体浓度1.5U/μL，C为阴性对照；
图5为实施例5肺炎链球菌灵敏度检测中不同DNA模板量的反应后产物照片，其中1-1～3的DNA模板量为10ng/μL，2-1～3的DNA模板量为1ng/μL，3-1～3的DNA模板量为100pg/μL，4-1～3的DNA模板量为10pg/μL，5-1～3的DNA模板量为1pg/μL，6-1～3的DNA模板量为0.1pg/μL，其中C1～6为阴性对照；
图6为肺炎链球菌特异性检测中，不同呼吸道细菌的反应后产物照片，其中1为肺炎克雷伯杆菌，2为流感嗜血杆菌，3为铜绿假单胞菌，4为肺炎链球菌，C为阴性对照；
图7为实施例7中荧光定量的方法检测肺炎链球菌的扩增曲线；
图8为实施例7中酚红染料可视化LAMP检测方法检测肺炎链球菌的检测结果，其中1-1～3的DNA模板量为10ng/μL，2-1～3的DNA模板量为1ng/μL，3-1～3的DNA模板量为100pg/μL，4-1～3的DNA模板量为10pg/μL，C-1～4为阴性对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
第一方面，提供了一种Bst DNA聚合酶突变体，该Bst DNA聚合酶突变体含有如下突变：对应于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，存在T186L、G311K、T488E和E557R突变，即将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上的第186位的苏氨酸突变为亮氨酸，第311位的甘氨酸突变为赖氨酸，第488位的苏氨酸突变为谷氨酸，第557位的谷氨酸突变为精氨酸。
本文中所述的对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，指的是当将Bst DNA聚合酶突变体与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列进行比对，以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中位点的位点序数确定的氨基酸残基。比如当Bst DNA聚合酶突变体的氮端一个或几个氨基酸残基的缺失，Bst DNA聚合酶突变体对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的某一氨基酸残基在SEQ ID NO.1中位点的序数和在Bst DNA聚合酶突变体的位点的序数不同，例如，当Bst DNA聚合酶突变体的氮端缺失N个氨基酸残基时，一氨基酸残基在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中位于第i位，在Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列中位于第i-N位。本文中以氨基酸残基在对应于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的位置对其进行限定，而非在Bst DNA聚合酶突变体中的位置。
可选的实施方式中，所述Bst DNA聚合酶突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的Bst DNA聚合酶，经T186L、G311K、T488E和E557R突变，且在此基础上保持SEQ ID NO.1所示的Bst DNA聚合酶其他氨基酸序列不变后得到的突变体，所述Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，还提供了第一方面的Bst DNA聚合酶突变体在LAMP扩增反应，或制备用于实现LAMP扩增反应的试剂盒中的应用。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术是一种核酸扩增方法，其至少需要2对引物，包括外引物组和内引物组；也可以是3对引物，多1对环引物，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下发生DNA链的置换和环化，在等温条件下进行高效高灵敏度高特异性的扩增目的片段。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增反应的目的片段来源于肺炎链球菌。
第三方面，还提供了一种LAMP扩增反应试剂或试剂盒，该LAMP扩增反应试剂或试剂盒包含用于LAMP扩增反应的反应组分，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包含第一方面的Bst DNA聚合酶突变体，其余组分可选自本领域可接受的任意的常规组分，包括但不限于引物、dNTPs、缓冲组分、溶剂、盐或金属离子、pH调节剂和表面活性剂中的一种或多种。
可选的实施方式中，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包括所述Bst DNA聚合酶突变体、钾离子、镁离子、铵离子、表面活性剂、dNTPs、颜色指示剂和碱。
本文中，钾离子、镁离子和铵离子可以由本领域可接受的盐提供，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和卤盐(氯盐、氟盐、溴盐或碘盐)。
本文中颜色指示剂指的是能随着反应体系中物质组成的改变发生颜色变化，在反应体系中添加颜色指示剂，能够根据反应后反应体系的颜色变化，直接裸眼判断结果。颜色指示剂可选择本领域已知的，常规的颜色指示剂，例如自发光荧光和嵌合型荧光为主的荧光染料(例如HNB和钙黄绿素)和以pH指示剂为主的比色染料。pH指示剂优选包括酚红。
可选的实施方式中，以工作浓度计，Bst DNA聚合酶突变体的浓度为0.3～0.75U/μL，例如可以为但不限于为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.75U/μL。
可选的实施方式中，以工作浓度计，镁离子浓度为8～15mM，例如可以为但不限于为8、9、10、11、12、13、14或15mM。
可选的实施方式中，以工作浓度计，碱提供1.5～2mM的碱金属离子，例如可以为但不限于为提供1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mM的碱金属离子。
可选的实施方式中，以工作浓度计，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包括BstDNA聚合酶突变体0.3～0.75U/μL，KCl 50～100mM，(NH4)2SO4 10～20mM，MgSO4 8～15mM，Tween-20 0.1～0.2％v/v，dNTPs 1.4～3.0mM，酚红0.05～0.2mM和KOH 1.5～2mM。
上述反应组分中，Bst DNA聚合酶突变体浓度例如可以为但不限于为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.75U/μL；KCl浓度例如可以为但不限于为50、60、70、80、90或100mM；(NH4)2SO4浓度例如可以为但不限于为10、15或20mM；MgSO4浓度例如可以为但不限于为8、9、10、11、12、13、14或15mM；Tween-20浓度例如可以为但不限于为0.1、0.15或0.2％v/v；dNTPs浓度例如可以为但不限于为1.4、1.5、2.0、2.5或3.0mM；酚红浓度例如可以为但不限于为0.05、0.1、0.15或0.2mM；KOH浓度例如可以为但不限于为1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mM。
本文中工作浓度指的是各组分在反应体系初始时的浓度，即配制反应体系时所需的浓度。
可选的实施方式中，所述用于LAMP扩增反应的反应组分中的上述各组分可以分别独立包装，或其中部分预混为预混试剂，或上述全部组分预混为预混试剂。
可选的实施方式中，所述用于LAMP扩增反应的反应组分为预混试剂LAMP mix，所述预混试剂LAMP mix为倍数工作浓度的储备试剂，例如可以但不限于2倍、5倍或10倍工作浓度的储备试剂。
可选的实施方式中，所述用于LAMP扩增反应的反应组分为预混试剂2×LAMP mix(2倍工作浓度的预混试剂)，其含有0.6～1.5U/μL，KCl 100～200mM，(NH4)2SO4 20～40mM，MgSO4 16～30mM，Tween-20 0.2～0.4％v/v，dNTPs 2.8～6.0mM，酚红0.1～0.4mM和KOH 3～4mM。
第四方面，还提供了一种肺炎链球菌LAMP检测试剂盒，该肺炎链球菌LAMP检测试剂盒包含第一方面的Bst DNA聚合酶突变体和用于LAMP扩增的引物组合物。
该引物组合物是根据肺炎链球菌特异性保守序列ply基因设计的，能够用于肺炎链球菌的鉴定。该引物组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的内引物FIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的环引物Loop F，和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的环引物Loop B。
可选的实施方式中，以工作浓度计：外引物F3的浓度为0.2～1.6μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.2或1.6μM；外引物B3的浓度为0.2～1.6μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.2或1.6μM；内引物FIP的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM；内引物BIP的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM；环引物Loop F的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM；环引物Loop B的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM。
可选的实施方式中，以工作浓度计，外引物F3和外引物B3的浓度为0.2μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度为1.6μM，环引物Loop F和环引物Loop B的浓度为0.6μM。
可选的实施方式中，上述各可以分别独立包装，或其中部分引物预混为预混试剂，或上述全部引物预混为预混试剂。
可选的实施方式中，肺炎链球菌LAMP检测试剂盒还包括第三方面中的用于LAMP扩增反应的反应组分。
可选的实施方式中，肺炎链球菌LAMP检测试剂盒还包括第三方面中的预混试剂2×LAMP mix，其含有0.6～1.5U/μL，KCl 100～200mM，(NH4)2SO4 20～40mM，MgSO416～30mM，Tween-20 0.2～0.4％v/v，dNTPs 2.8～6.0mM，酚红0.1～0.4mM和KOH 3～4mM。
第五方面，还提供了一种非诊断和治疗目的的肺炎链球菌的检测方法，该检测方法包括采用LAMP扩增待测样本，LAMP扩增中使用第一方面的Bst DNA聚合酶突变体催化反应。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应时间为10～20min，例如可以为但不限于为15、16、17、18、19或20min；反应温度为60～65℃，例如可以为但不限于为60、61、62、63、64或65℃。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应条件为65℃反应15min。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应试剂中含有颜色指示剂，根据反应体系的颜色变化直接裸眼判断结果。
可选的实施方式中，所述颜色指示剂包括酚红。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增的反应体系中含有Bst DNA聚合酶突变体、钾离子、镁离子、铵离子、表面活性剂、dNTPs、颜色指示剂和碱。
可选的实施方式中，反应体系中Bst DNA聚合酶突变体的浓度为0.3～0.75U/μL，例如可以为但不限于为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.75U/μL。
可选的实施方式中，反应体系中镁离子浓度为8～15mM，例如可以为但不限于为8、9、10、11、12、13、14或15mM。
可选的实施方式中，反应体系中碱提供1.5～2mM的碱金属离子，例如可以为但不限于为提供1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mM的碱金属离子。
可选的实施方式中，反应体系中包括Bst DNA聚合酶突变体0.3～0.75U/μL，KCl50～100mM，(NH4)2SO4 10～20mM，MgSO4 8～15mM，Tween-20 0.1～0.2％v/v，dNTPs1.4～3.0mM，酚红0.05～0.2mM和KOH 1.5～2mM。
可选的实施方式中，所述LAMP扩增中使用如下引物组合物扩增：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的外引物F3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的内引物FIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的环引物Loop F，和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的环引物LoopB。
可选的实施方式中，反应体系中外引物F3的浓度为0.2～1.6μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.2或1.6μM；外引物B3的浓度为0.2～1.6μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.2或1.6μM；内引物FIP的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM；内引物BIP的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM；环引物Loop F的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM；环引物Loop B的浓度为0.2～3.2μM，例如可以为但不限于为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或3.2μM。
可选的实施方式中，反应体系中外引物F3和外引物B3的浓度为0.2μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度为1.6μM，环引物Loop F和环引物Loop B的浓度为0.6μM。
可选的实施方式中，使用第四方面的肺炎链球菌LAMP检测试剂盒检测肺炎链球菌。
在一个具体的实施方式中，所述肺炎链球菌的检测方法包括：
(a)获取待测样本核酸；
(b)将待测样本核酸与肺炎链球菌LAMP检测试剂盒中的用于LAMP扩增反应的反应组分混合并进行LAMP扩增；
(c)根据上述反应后混合液的颜色变化，直接裸眼判断结果。颜色指示剂以酚红为例，反应后混合液颜色变黄，则说明肺炎链球菌阳性。
非诊断和治疗目的的肺炎链球菌的检测方法的实例包括但不限于菌种鉴定、菌株筛选、非疾病样本中肺炎链球菌检测，例如筛选抗肺炎链球菌的药物的样本。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
Bst DNA聚合酶重组突变体确定
本实施例提供一种Bst DNA聚合酶突变体，主要是基于野生型Bst DNA聚合酶的原始氨基酸序列进行理性设计(Swiss Model建模分析)分析其构想差异，在其功能结构域上对Thr186、Gly311、Thr488、Glu557位点进行突变，提高了Bst DNA聚合酶的扩增性能，缩短了其在LAMP法中的检测时间。其中野生型Bst DNA聚合酶的原始氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变的Bst DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
野生型：
AEGEKPLEEMEFAIVDVITEEMLADKAALVVEVMEENYHDAPIVGIALVNEHGRFFMRPETALADSQFLAWLADETKKKSMFDAKRAVVALKWKGIELRGVAFDLLLAAYLLNPAQDAGDIAAVAKMKQYEAVRSDEAVYGKGVKRSLPDEQTLAEHLVRKAAAIWALEQPFMDDLRNNEQDQLLTKLEQPLAAILAEMEFTGVNVDTKRLEQMGSELAEQLRAIEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPHHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTGKVHTMFNQALTQTGRLSSAEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIADDDNLIEAFQRDLDIHTKTAMDIFHVSEEEVTANMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGVKQYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLAARLKEEQLQARLLLQVHDELILEAPKEEIERLCELVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGPTWYDAKGSGS(SEQ IDNO.1)。
突变体：
AEGEKPLEEMEFAIVDVITEEMLADKAALVVEVMEENYHDAPIVGIALVNEHGRFFMRPETALADSQFLAWLADETKKKSMFDAKRAVVALKWKGIELRGVAFDLLLAAYLLNPAQDAGDIAAVAKMKQYEAVRSDEAVYGKGVKRSLPDEQTLAEHLVRKAAAIWALEQPFMDDLRNNEQDQLLLKLEQPLAAILAEMEFTGVNVDTKRLEQMGSELAEQLRAIEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPHHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTKKVHTMFNQALTQTGRLSSAEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIADDDNLIEAFQRDLDIHTKTAMDIFHVSEEEVTANMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGVKQYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDIESRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLAARLKEEQLQARLLLQVHDELILEAPKEEIERLCRLVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGPTWYDAKGSGS(SEQ IDNO.2)。
实施例2
肺炎链球菌LAMP检测试剂中特异引物设计
从基因序列数据库Genbank中，检索下载肺炎链球菌ply基因，利用PeimerExplorer V4软件(日本荣研株式会社)进行引物设计，6条引物中2条为外引物(F3和B3)，2条为内引物(FIP和BIP)，另外2条为环引物(Loop F和Loop B)。具体的引物序列信息如下表1所示：
表1引物信息
实施例3
使用荧光定量的方法确定实施例1突变体是否可以更加快速检测肺炎链球菌，反应体系为：引物F3和B3 0.2μM，引物FIP和BIP 1.6μM，引物Loop F和Loop B 0.6μM，待测样品基因组模板1μL，10×LAMP buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶(野生型或实施例1突变体)1μL，SYTO-9 1μL。将反应液混匀后在荧光定量PCR仪器上进行反应。实验结果如图1所示，结果表明，在达到相同扩增产物量的情况下，野生型Bst需要30个循环，即约30min，而突变型Bst在15个循环内即可达到要求，即约15min，相比之下更为快速、便捷。
实施例4
可视化肺炎链球菌LAMP检测方法的建立
可视化LAMP检测肺炎链球菌的试剂盒主要由2×LAMP mix和LAMP引物组预混液组成，其中2×LAMP mix主要由实施例1提供的Bst DNA聚合酶突变体、酚红(pH染料)、等温扩增缓冲液组成。
1.检测方法的初步建立
初始反应体系为：引物F3和B3 0.2μM，引物FIP和BIP 1.6μM，引物Loop F和Loop B0.6μM，待测样品基因组模板1μL，2×LAMP mix 12.5μL(包括Bst DNA聚合酶0.6U/μL，KCl100mM，(NH4)2SO4 20mM，MgSO4 16mM，Tween-20 0.2％，dNTPs 2.8mM，酚红0.1mM，KOH 3mM)。初始反应条件为：65℃恒温反应15min。
2.可视化肺炎链球菌LAMP检测方法最佳反应体系和反应条件确立
该步骤针对2×LAMP中的组分进行依次优化：
(1)在初始反应体系的基础上，Mg2+浓度分别为9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM、24mM和30mM，反应结果如图2所示。
(2)在初始反应体系的基础上，KOH的浓度分别为3mM、3.2mM、3.4mM、3.6mM、3.8mM和4mM，反应结果如图3所示。
(3)在初始反应体系的基础上，Bst DNA聚合酶突变体的浓度分别为0.6U/μL、0.8U/μL、1.0U/μL和1.5U/μL，反应结果如图4所示。
确定最佳反应体系如下：
初始反应体系为：引物F3和B3 0.2μM，引物FIP和BIP 1.6μM，引物Loop F和Loop B0.6μM，待测样品基因组模板1μL，2×LAMP mix 12.5μL(包括Bst DNA聚合酶0.6～1.5U/μL，KCl 100mM，(NH4)2SO4 20mM，MgSO4 24mM，Tween-20 0.2％，dNTPs1.6mM，酚红0.1mM，KOH4mM)。
实施例5
可视化肺炎链球菌LAMP检测方法灵敏度检测
磁珠法提取的肺炎链球菌标准菌株基因组DNA，进行10倍梯度稀释，分别得到浓度为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.1pg/μL的肺炎链球菌基因组DNA。将不同浓度的DNA按照最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应。酚红显色结果显示10ng/μL-10pg/μL的肺炎链球菌LAMP反应液均由红色变为黄色，1pg/μL的浓度下，由红色变为橘色，如图5所示。
实施例6
可视化肺炎链球菌LAMP检测方法特异性检测
选取多种呼吸道细菌(肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌)的基因组DNA，以肺炎链球菌基因组DNA为阳性对照，以RNase-free water为阴性对照，根据最佳反应体系和反应条件进行LAMP反应，结果显示只有肺炎链球菌LAMP反应液由红色变为黄色，表明阳性扩增，其余均无颜色变化，结果如图6所示。
实施例7
肺炎链球菌检测的不同方法
除了使用上述酚红染料可视化LAMP检测方法检测肺炎链球菌外，同样使用荧光定量的方法检测肺炎链球菌(DNA模板量分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL和10pg/μL)，反应体系为：引物F3和B3 0.2μM，引物FIP和BIP 1.6μM，引物Loop F和Loop B 0.6μM，待测样品基因组模板1μL，10×LAMP buffer 2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，SYTO-9 1μL。将反应液混匀后在荧光定量PCR仪器上进行反应。结果表明(图7和图8)，根据表2数据显示，两种方法均可在15min左右完成反应，但是使用酚红染料法可以直接裸眼观察颜色变化进行实验结果判读，不需要通过专门的仪器辅助进行结果判读，相比之下更为便捷。
表2荧光法检测肺炎链球菌数据
实施例8
本实施例提供了一种肺炎链球菌可视化检测试剂盒，包括肺炎链球菌LAMP检测试剂中特异引物，引物工作浓度如下：外引物F3和外引物B3的浓度为0.2μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度为1.6μM，环引物Loop F和环引物Loop B的浓度为0.6μM。还包括2×LAMP mix，其含有0.6U/μL，KCl 100mM，(NH4)2SO4 20mM，MgSO4 24mM，Tween-20 0.2％v/v，dNTPs2.8mM，酚红0.1mM和KOH 4mM。
反应条件为65℃恒温反应15min。
取肺炎链球菌基因组DNA和其他呼吸道细菌基因组DNA各10pg，分别加入到对应的反应管中，并依次加入2×LAMP mix和引物，65℃孵育15min后，进行颜色判读。结果显示只有肺炎链球菌LAMP反应液由红色变为黄色，表明阳性扩增，其余均无颜色变化。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种Bst DNA聚合酶突变体，其特征在于，含有如下突变：对应于SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，存在T186L、G311K、T488E和E557R突变。
2.根据权利要求1所述的Bst DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的Bst DNA聚合酶突变体在LAMP扩增反应，或制备用于实现LAMP扩增反应的试剂或试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述LAMP扩增反应的目的片段来源于肺炎链球菌。
5.一种LAMP扩增反应试剂或试剂盒，其特征在于，包含用于LAMP扩增反应的反应组分，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包含权利要求1或2所述的Bst DNA聚合酶突变体。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包括所述Bst DNA聚合酶突变体、钾离子、镁离子、铵离子、表面活性剂、dNTPs、颜色指示剂和碱；
优选地，Bst DNA聚合酶突变体的浓度为0.3～0.75U/μL；
优选地，镁离子浓度为8～15mM；
优选地，碱提供1.5～2mM的碱金属离子；
优选地，所述颜色指示剂包括酚红；
优选地，所述用于LAMP扩增反应的反应组分包括Bst DNA聚合酶突变体0.3～0.75U/μL，KCl 50～100mM，(NH4)2SO4 10～20mM，MgSO4 8～15mM，Tween-20 0.1～0.2％v/v，dNTPs1.4～3.0mM，酚红0.05～0.2mM和KOH 1.5～2mM；
优选地，所述用于LAMP扩增反应的反应组分为预混试剂2×LAMP mix，其含有0.6～1.5U/μL，KCl 100～200mM，(NH4)2SO4 20～40mM，MgSO4 16～30mM，Tween-200.2～0.4％v/v，dNTPs 2.8～6.0mM，酚红0.1～0.4mM和KOH 3～4mM。
7.一种肺炎链球菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的Bst DNA聚合酶突变体和用于LAMP扩增的引物组合物；
所述引物组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的外引物F3，核苷酸序列如SEQID NO.4所示的外引物B3，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的内引物FIP，核苷酸序列如SEQID NO.6所示的内引物BIP，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的环引物Loop F，和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的环引物Loop B；
优选地，外引物F3和外引物B3的浓度分别独立的为0.2～1.6μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度分别独立的为0.2～3.2μM，环引物Loop F和环引物Loop B的浓度分别独立的为0.2～3.2μM；
进一步优选地，外引物F3和外引物B3的浓度为0.2μM，内引物FIP和内引物BIP的浓度为1.6μM，环引物Loop F和环引物Loop B的浓度为0.6μM。
8.根据权利要求7所述的肺炎链球菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，还包括权利要求6中所述的用于LAMP扩增反应的反应组分，优选包括所述预混试剂2×LAMP mix。
9.一种非诊断和治疗目的的肺炎链球菌的检测方法，其特征在于，包括采用LAMP扩增待测样本，LAMP扩增中使用权利要求1或2所述的Bst DNA聚合酶突变体催化反应；
优选地，所述LAMP扩增的反应时间为10～20min，反应温度为60～65℃；
优选地，所述LAMP扩增的反应条件为65℃反应15min。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应试剂中含有颜色指示剂，根据反应体系的颜色变化直接裸眼判断结果；
优选地，所述LAMP扩增中使用权利要求7中所述的用于LAMP扩增的引物组合物扩增靶基因；
优选地，使用权利要求7或8所述的肺炎链球菌LAMP检测试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410092366.XA CN117721092A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410092366.XA CN117721092A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117721092A true CN117721092A (zh) | 2024-03-19 |
Family
ID=90205516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410092366.XA Pending CN117721092A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117721092A (zh) |
-
2024
- 2024-01-22 CN CN202410092366.XA patent/CN117721092A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhu et al. | Multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with nanoparticle-based lateral flow biosensor for the diagnosis of COVID-19 | |
| CN109825616B (zh) | 用于检测b族链球菌的引物组及其用途 | |
| CN110804669B (zh) | 用于肺炎支原体的crispr检测引物组及其用途 | |
| CN108796131A (zh) | 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用 | |
| CN110878343A (zh) | 一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
| CN110791578B (zh) | 用于百日咳博德特氏杆菌的crispr检测引物组及其用途 | |
| CN110577987B (zh) | 一种fmr1基因cgg重复序列的检测方法及其应用 | |
| CN113718045B (zh) | 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用 | |
| CN109913565B (zh) | 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法 | |
| CN111500778A (zh) | 逆转录环介导等温扩增结合金纳米生物传感检测2019新型冠状病毒的方法 | |
| CN111876502B (zh) | 双重实时荧光定量pcr鉴定布鲁氏菌s2疫苗株的方法及其使用的成套试剂 | |
| CN111088380A (zh) | 布鲁氏菌lf-rpa检测引物和探针及检测试剂盒 | |
| CN112646932B (zh) | 一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒 | |
| CN102154487A (zh) | 检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法 | |
| CN116042873A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测幽门螺杆菌的试剂盒及方法 | |
| CN117721092A (zh) | Bst DNA聚合酶突变体和应用、肺炎链球菌检测试剂盒 | |
| CN116004874A (zh) | 一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒 | |
| CN113265479B (zh) | 检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用 | |
| CN115992273A (zh) | 用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒及检测方法 | |
| KR102076343B1 (ko) | 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| CN114807435A (zh) | 一种用于呼吸道合胞病毒检测的试剂盒及其应用 | |
| CN114085926A (zh) | Abcb1基因c3435t的snp位点多态性的引物和探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN102952897A (zh) | 一种风疹病毒rt-pcr荧光检测试剂盒及检测方法 | |
| Chen et al. | Novel detection of norovirus and double Clostridium difficile in a closed cartridge system | |
| Jia et al. | Multiple cross displacement amplification combined with nanoparticle-based lateral flow biosensor for rapid and sensitive detection of Epstein-Barr virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |