CN117720636A - 一种来自菊头蝠的间隙链接蛋白基因编码序列、蛋白序列及其在听障和皮肤疾病治疗领域的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菊头蝠间隙连接蛋白成员β6（GJB6）基因的完整编码序列及其对应的蛋白质序列和应用。该发明提供了一种全新的方法，通过设计简并引物和RACE引物，成功从马铁菊头蝠的组织样本中克隆出该间隙链接蛋白基因的完整cDNA编码序列，并通过分析获得对应的蛋白connexin30的完整序列。进一步研究揭示，这种基因在蝙蝠的听力和皮肤组织中发挥关键作用。因此，本发明的成果对于治疗听力障碍和皮肤疾病具有重大的产品开发应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及本发明涉及基因和蛋白质序列，特别是与菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因相关的核苷酸和氨基酸序列，以及其在治疗听力障碍和皮肤疾病中的应用。
背景技术
GJB6基因，也被称为间隙连接蛋白成员β6，属于间隙连接蛋白家族的β亚类。该基因的主要功能是编码间隙连接蛋白30（connexin30），这是一个30kDa的蛋白，在相邻细胞间起着重要的通道作用，允许分子和信号在细胞间进行交换和传递。自从1996年被发现以来，大量研究表明GJB6基因在人体中扮演着关键角色，对于维持细胞的正常生理功能和信号转导至关重要。此外，GJB6基因已被证实与多种耳聋和皮肤疾病有紧密联系，包括但不限于先天性耳聋、多汗性外胚层发育不良、角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征以及非综合性常染色体显性遗传听力障碍等。
蝙蝠，也被称为翼手目哺乳动物，是唯一真正能够飞行的哺乳动物。它们的飞行能力和回声定位能力使它们能够适应各种环境，不仅在全球范围内分布广泛，而且具有独特的生态位。蝙蝠的回声定位系统是一个高度复杂且进化的系统，通过发出超声波并分析返回的回声来感知周围环境。
菊头蝠中的马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）属于小蝙蝠亚目菊头蝠属，主要分布在天然溶洞的缝隙里。尽管蝙蝠的回声定位技术已被广泛应用于潜水、航空和夜间探测等领域的发明中，如雷达，但对与回声定位相关的基因应用仍处在起步阶段。
综上所述，来自菊头蝠属的马铁菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因在听力障碍和皮肤疾病的治疗中具有巨大的商业潜力和广阔的应用前景。然而，目前对该基因的开发和应用仍处在初级阶段，需要进一步的研究和探索。
发明内容
本发明提供的核苷酸和氨基酸序列，以及其在听力障碍和皮肤疾病中的重要功能，这为开发新的治疗听障和皮肤疾病新的方法提供了可能。
为达到上述目的，本发明实施了一种技术方案：
首先，本发明提供一种编码具有特定氨基酸序列的蛋白质的cDNA序列。该氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，或者在SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的基础上，通过添加、删除或替换一个或多个氨基酸，形成的与原蛋白具有相同功能的变异体。这种cDNA编码序列可用于表达所述蛋白质，并进一步用于治疗听力障碍或皮肤疾病。
为了获得这种cDNA序列，本发明还提供了一种通过设计简并引物和RACE引物，从一种菊头蝠的组织样本中扩增得到该间隙链接蛋白β6的cDNA完整序列的方法。该方法步骤如下：1) 根据哺乳动物间隙链接蛋白成员β6基因的保守区核酸序列设计简并引物用于扩增得到菊头蝠该基因的部分cDNA序列；2) 由1）所得序列设计马铁菊头蝠GJB6基因的RACE引物，并通过RACE扩增得到马铁菊头蝠该基因的5‘端和3‘端完整序列，最后通过序列拼接得到该基因完整cDNA序列。通过这些步骤，本发明成功获取了一种菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因的cDNA完整编码序列。
此外，本发明还揭示了来自马铁菊头蝠该基因在听障和皮肤病中的重要作用。该基因及其编码的蛋白质在听障和皮肤病的治疗中具有广泛的应用前景，包括但不限于：马铁菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因序列和蛋白质序列在听力障碍治疗中的应用；菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因序列和蛋白序列在皮肤疾病治疗中的应用
与现有技术相比，本发明的优点在于：从具有独特飞行和回声定位能力的一种菊头蝠组织样本中成功获得了一种间隙链接蛋白成员β6基因的全长编码序列，并通过深入分析揭示了其蛋白connexin30的序列以及在蝙蝠听力和飞行能力中的重要功能信息。菊头蝠GJB6基因序列及蛋白质序列为听障和皮肤病治疗技术领域提供了全新的思路及方向。更重要的是，马铁菊头蝠的该基因序列和蛋白序列具备后续改造的条件，具有作为产品开发的应用价值。
本发明不仅提供了一种新的基因和蛋白质资源，而且为听障和皮肤病的治疗提供了新的策略及方向。通过深入研究马铁菊头蝠GJB6基因及其编码的蛋白质connexin30，我们可以更好地理解其在听力障碍和皮肤疾病中的作用机制，从而为开发新的治疗方法提供有力支持
附图说明
为了更好地阐述本发明实施例或现有技术方案，以下将详细描述所需的附图。需要强调的是，以下附图仅为记录在本发明中的部分实施例，而对于该领域的专业技术人员，他们无需创造性劳动即可根据这些附图获得其他附图。
图1：基于哺乳动物间隙链接蛋白成员β6基因的MrBayes树（节点数值为后验概率值）。
图2：哺乳动物中的间隙链接蛋白成员β6基因的选择压力分析结果。
图3：哺乳动物间隙链接蛋白成员β6基因的编码区移动框分析结果。
实施例1 一种菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因全长编码序列的获得
制备扩增模板
将液氮中保存的马铁菊头蝠组织样本研磨成粉状，并加入RNAiso Reagent试剂以提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，得到合格的组织样本总RNA。接着，使用StrataScript Reverse Transcriptase试剂盒反转录得到cDNA第一链。
设计扩增引物：
基于Genbank等数据库中已知的哺乳动物GJB6基因编码区序列的保守区，设计了用于扩增菊头蝠该基因编码区的部分序列的引物F1和R1。再根据该序列设计RACE引物F2和R2，用于RACE扩增得到菊头蝠GJB6基因5’端和3’端完整序列。所有引物由上海生工合成，具体序列依次如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示。
PCR实验：
用PCR仪(BIO RAD)完成扩增反应，具体的反应条件为：95℃变性5分钟，一个循环；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，32个循环；72℃，延伸10分钟。具体的10μL反应体系为: 灭菌蒸馏水4.1μL、上游引物F1 0.2μL、下游引物R1 0.2μL、扩增模板0.5μL和ExTaq mix 5μL。
RACE实验：
根据Invitrogen的RACE扩增试剂盒说明书进行RACE扩增，反应程序为：94℃30sec，72℃ 3min，5cycle；94℃ 30sec，70℃ 30sec，72℃ 3min，5cycle；94℃ 30sec，68℃30sec，72℃ 3分钟，25cycle；72℃ 10min，反应体系为：5’/3’ RACE Ready cDNA，0.5μL；PCR-Grade water，6.9μL；10×Advantage 2 PCR buffer，1μL；GPS primer 0.2μL ；d NTPMix，0.2μL；50×advantage 2 polymerase mix，0.2μL；10×UMP，1μL。取5ul所得连接产物，经42℃，90s热激转入50μLTop10感受态细胞，加950μ LB-培养液，于37℃摇床180rpm，90min复苏细胞后，均匀涂布于琼脂平板，37℃恒温培养箱过夜。
扩增产物回收转化及阳性克隆测序
将PCR和RACE实验得到的产物进行凝胶电泳并切下含有目的条带的胶块，使用TaKaRa 胶回收试剂盒回收纯化胶块中的目标DNA。回收DNA与载体PMT-19T过夜连接，连接体系为：回收DNA，4.5μL、PMD-19 T载体， 0.5μL、Solution I ，5μL；连接条件为16℃。取连接好的产物5μL放入50μLTop10感受态细胞，在42℃，90s的条件下热激，补950μL的 LB液体培养基，37℃摇床180rpm复苏90min后，涂布于IPTG琼脂板，37℃细菌培养箱过夜。第二天挑取阳性克隆，常规PCR反应鉴定后，将有目的条带的克隆送上海生工有限公司测序。选择双向测序多个阳性克隆，以避免DNA聚合酶引起的随机错配。
经过对测序结果的深入分析，我们发现，本实施例所采用的方法能够成功的获得完整的菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因的蛋白编码序列全长。经过详细的核苷酸序列分析，其DNA序列如SEQ ID NO：5所示。同时，对氨基酸序列的解析也得到了相应的结果，具体如SEQ ID NO:7所示。
实施例2 基于菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因编码序列的功能和进化分析
哺乳动物间隙链接蛋白成员β6基因序列的比对分析
通过实施例1，我们已经成功获得菊头蝠GJB6基因的完整cDNA序列。为了更深入了解其特性，我们将此序列与其他30种哺乳动物的GJB6基因序列进行了比对。利用Clustalx软件进行初步比对后，我们再利用Mega软件对其核苷酸和氨基酸差异进行了详细分析。结果显示，该基因在蝙蝠中的保守位点明显高于其他哺乳动物，暗示其在蝙蝠听力和皮肤系统中可能具有特别的功能。
特别地，我们注意到一个属于翼手目特有的位于间隙链接蛋白第二和第三跨膜区之间的胞内环的蛋白位点（Arg131）。这个区域对PH值及细胞离子通道门户的敏感性至关重要。这一发现可能为未来研究该基因与特定生理功能之间的关系提供线索。
构建哺乳动物间隙链接蛋白成员β6基因系统发生树
为了明确间隙链接蛋白成员β6在哺乳动物中的进化历程，我们使用MrBayes软件基于GJB6基因全长编码序列构建了系统发生树（图1）。通过模拟计算，我们观察到该基因在翼手目中的分布与物种树高度一致，但在其他物种中的聚类则有所不同。这一结果为理解该基因在不同物种中的进化路径提供了宝贵的信息。
分析哺乳动物间隙链接蛋白成员β6基因经历的选择压力
为了进一步探究GJB6基因在不同哺乳动物中的进化模式，我们利用PAML4软件包中的CODEML程序进行了选择压力分析。通过点特异模型、自由比率模型、枝特异模型等多种模型的测试，我们发现该基因在蝙蝠中主要受到纯化选择的作用，所有模型均未发现明显的正选择位点。这一结果提示我们，该基因在蝙蝠中相较其他物种中具有更重要的功能限制。
4、间隙链接蛋白成员β6移动框分析
为了揭示间隙链接蛋白成员β6不同功能区域中的进化特点，我们利用SWAAP软件进行了移动框分析。分析结果显示，该基因的胞质环和碳端区域相对于其他功能区更为多变。这一发现为进一步研究这些区域的生物学功能和进化提供了重要线索。
综上所述，本实施例通过多种方法和软件的结合，对菊头蝠间隙链接蛋白β类成员6（GJB6）基因的序列进行了深入的分析。这些结果不仅揭示了该基因在蝙蝠中的特殊地位和功能，也为未来的研究提供了宝贵的资料和研究方向。
对于本领域的专业技术人员来说，本发明显然不仅仅局限于上述示范实施例所详述的细节。在保持本发明精神和基本特性不变的前提下，本发明可以采用多种不同的具体形式来实现。因此，示范实施例应当被视为是示例性质的，而非对本发明进行限制。本发明的范围由所附的权利要求来确定，并不仅仅局限于上述说明内容。
另外，需要注意的是尽管本说明书以实施方式进行描述，但这并不意味着每个实施方式仅代表一个独立的技术方案。说明书采用这种方式进行叙述主要是为了便于理解。本领域的专业技术人员应当将说明书视为一个整体来理解，通过将各实施例中的技术方案进行适当组合，可以形成其他可供本领域技术人员理解的新实施方式。
Claims (5)
1.一种间隙链接蛋白成员蛋白，其特征在于，该蛋白具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的基础上，通过添加、删除或替换一个或多个氨基酸，形成的与原蛋白具有相同功能的变异体
根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该蛋白是马铁菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因的产物。
2.一种编码如权利要求1或2所述的蛋白的cDNA编码序列，其特征在于，该cDNA编码序列具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，或者在SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列的基础上，通过添加、删除或替换一个或多个核苷酸，形成的与原cDNA序列具有相同编码功能的变异体。
3.根据权利要求3所述的cDNA编码序列，其特征在于，该cDNA编码序列是马铁菊头蝠间隙链接蛋白成员β6基因完整的基因编码序列。
4.如权利要求4所述的cDNA编码序列在哺乳动物的听力和皮肤组织中的应用。
5.如权利要求4所述的cDNA编码序列在开发治疗听力障碍或皮肤疾病的药物或疗法中的应用。
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