CN110272475A - 光肩星天牛气味结合蛋白obp45、obp46及其在筛选引诱剂中的应用 - Google Patents

光肩星天牛气味结合蛋白obp45、obp46及其在筛选引诱剂中的应用 Download PDF

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王菁桢
骆有庆
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Abstract

本发明公开了光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46及其基因。本发明还公开了基于光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的引诱剂筛选方法。本发明将光肩星天牛气味结合蛋白OBPs同源模建、计算机虚拟筛选和荧光竞争实验结合起来，大大提高了气味分子的筛选效率，为光肩星天牛嗅觉引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。本发明利用荧光竞争结合的方法，对34种光肩星天牛寄主主要挥发物和7种信息素分子进行了结合能力的测定，将荧光竞争的IC50值<20μmol/L，或解离常数KD为<20μmol/L的化合物，确定为适合光肩星天牛的嗅觉引诱剂。

Description

光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46及其在筛选引诱剂中 的应用
技术领域
本发明属于昆虫引诱剂技术领域，具体涉及光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46及其在筛选引诱剂中的应用。
背景技术
光肩星天牛Anoplophora glabripennis(Motschulsky)属鞘翅目Coleoptera，天牛科Cerambycidae，沟胫天牛亚科Lamiinae，星天牛属Anoplophora，为林木重要的蛀干害虫。该虫在我国分布广泛、危害严重，近20年来，光肩星天牛急剧向我国西北、东北的纵深地区扩散、定殖并产生严重危害(刘昭阳，2016)。随着国际贸易往来的愈加频繁，已经成为重要的国际性有害生物，目前已在北美多个地区的定殖并严重危害；在欧洲，该虫也已经在部分国家定殖成功(EPPO历年报告，截至2019年6月)。我国作为其原始的分布区域之一，在进出口贸易中，面临来自美国和欧洲更为严格的检疫标准，对我国的外贸出口有严重的影响。
由于林木蛀干害虫主要以幼虫营隐蔽生活，且能随木材运输而传播，监测和防治难度非常大。目前，国内外对光肩星天牛的监测，主要还是通过肉眼观察树木是否有刻槽、排粪孔和羽化孔等危害状来判断其危害，在欧洲，经过训练的嗅探犬也被用于光肩星天牛的早期监测当中(Makarow et al.,2019)，上述方法需要花费大量的人力物力。
化学通讯一般被认为是昆虫最广泛的通讯方式，昆虫寻找寄主、觅偶、交配、产卵等行为离不开化学通讯的调控，大部分的昆虫主要依靠高度种特异的种内信息素通讯来寻找配偶，完成种群繁衍。因此通过筛选对害虫有活性的引诱剂，已经成为重要的监测和防治手段而受到了广泛的关注(Bigiani et al.,2005；Leal,2017)。
CN201710383640.9公开了一种筛选光肩星天牛引诱成分及制备光肩星天牛引诱剂的方法，利用Agla-OBP1、Agla-OBP2这两个气味不同的气味结合蛋白，通过荧光竞争结合的方法，验证了已报道的糖槭挥发物和光肩星天牛聚集信息素的结合能力，从而提出基于这些已公开报道化合物的引诱剂配方。但是对光肩星天牛有引诱效果的新的化合物，并不具有高效筛选的能力。
传统的昆虫引诱剂筛选方法主要是从昆虫、寄主植物中分离活性成分，通过气相色谱-触角电位偶联(GC-EAD)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)等一系列的分析和鉴定，筛选能够引起昆虫触角电位反应进而产生昆虫行为反应的活性物质。然而实践表明，在对活性物质进行分析鉴定的过程中，常常会忽略掉很多的微量活性化合物，而很多筛选出来的化合物，其产生的电信号并不一定能够引导产生相应的行为反应。
研究者从光肩星天牛的雌雄虫体、幼虫粪便、寄主植物挥发物等材料，以及雌虫产卵等过程中，提取并分析了能诱导其产生行为反应的活性化学物质(Zhang et al.,2003；Ali et al.,2017；Makarow et al.,2019)。部分引诱剂也已经进行监测效果试验，但是引诱效果并不理想(多个年份、多个诱捕数量不超过100头，或平均每周每个诱捕器的诱捕量小于5头，而其他近缘属如墨天牛属的引诱剂诱捕数量可达2000头以上)(Nehme et al.,2010；Nehme et al.,2014)。因此，亟待寻求新的途径筛选开发更为有效的活性化学物质。
发明内容
本发明的目的在于提供两种光肩星天牛的气味结合蛋白及其编码基因。
本发明的目的还在于提供利用两种蛋白的三维结构高通量筛选光肩星天牛引诱剂的方法。
光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：
1)自序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列；
2)将自序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有气味结合活性的蛋白质。
所述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的基因序列分别如序列表SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
一种含上述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的基因载体。
含有上述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的基因载体的工程菌。
扩增上述的光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46基因中任一片段的引物。
一种基于光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的引诱剂筛选方法，按照如下步骤进行：
(1)基于光肩星天牛AglaOBP45和AglaOBP46的氨基酸序列，利用Blast程序在蛋白质结构数据库中比对，选择已获得晶体结构且氨基酸序列一致性大于30％的OBPs为模板，用于AglaOBP45和AglaOBP46的三维结构建模；
(2)使用MODELLER9.15程序将光肩星天牛AglaOBP45和AglaOBP46的氨基酸序列与模板序列进行比对，生成1000个可能的模建结构，从中选择分值最接近1的一个结果，采用Chimera软件来评估每个蛋白结构中电荷的分配情况，并采用最速下降和共轭梯度法进行结构能量最小化优化；
(3)从ZINC数据库以及Pubchem数据库获得配体分子模型，使用AutoDock Vina和AutoDock分别进行蛋白与气味化合物的对接；获得模拟的引诱剂；
(4)AglaOBP45和AglaOBP46与获得模拟的引诱剂的结合能力测定，荧光竞争的IC50值<20μmol/L，或解离常数KD为<20μmol/L的化合物，确定为适合光肩星天牛的嗅觉引诱剂。
步骤(3)所述对接的操作步骤为：利用AutoDock Vina程序执行自动计算对接，根据结合自由能(△G)的大小来衡量AglaOBP45和AglaOBP46与配体分子亲和度并进行排序，使用AutoDock进一步对接，分析得分小于-7的化合物的结合模式。
本发明的有益效果：传统的化学生态学方法筛选昆虫引诱剂的技术方法比较繁琐，效率较低，并且很可能忽略掉昆虫和寄主植物中一些微量的活性成分。本发明将光肩星天牛气味结合蛋白OBPs同源模建、计算机虚拟筛选和荧光竞争实验结合起来，大大提高了气味分子的筛选效率，为光肩星天牛嗅觉引诱剂配方的筛选和设计提供了新的策略。本发明通过构建AglaOBP45和AglaOBP460蛋白三维结构，结合计算机分子对接分析，可以对化合物进行高效的筛选，发现新的引诱成分，而并非仅局限于已经报道的光肩星天牛寄主植物挥发物和聚集信息素等化合物。本发明利用荧光竞争结合的方法，对34种光肩星天牛寄主主要挥发物和7种信息素分子进行了结合能力的测定，将荧光竞争的IC50值<20μmol/L，或解离常数KD为<20μmol/L的化合物，确定为适合光肩星天牛的嗅觉引诱剂。提出了光肩星天牛嗅觉引诱剂筛选的标准。
附图说明
图1为AglaOBP45、AglaOBP46基因序列电泳检测图；
图中，A为AglaOBP45基因，B为AglaOBP46基因。
图2为AglaOBP45的模建结构。
图3为AglaOBP46的模建结构。
图4为AglaOBP45和AglaOBP46与醇类物质的结合曲线。
图5为AglaOBP45和AglaOBP46与碳烯类物质的结合曲线。
图6为AglaOBP45和AglaOBP46与萜烯类物质的结合曲线。
图7为AglaOBP45和AglaOBP46与酯类物质的结合曲线。
图8为AglaOBP45和AglaOBP46与醛类物质的结合曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1光肩星天牛触角总RNA的提取与反转录
1.1光肩星天牛触角总RNA提取
收集光肩星天牛新羽化雌雄虫的触角，并提取触角的总RNA，使用TRIzol试剂(Ambion)和Rneasy Plus Mini试剂盒(No.74134；Qiagen，Hilden，Germany)按照说明，具体操作步骤如下：
(1)分别取光肩星天牛和星天牛雌雄成虫触角各50-100mg，置于带有研磨珠的2ml的离心管内，加入1ml的Trizol reagent，振荡磨碎细胞；
(2)室温放置30分钟，降低DNA污染；
(3)4℃，12000g，10min离心；
(4)取上清约800入干净的1.5ml的离心管；
(5)用无菌注射器抽射3-5次，剪切基因组DNA和裂解残留细胞；
(6)加入200ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；
(7)4℃，12000g，20min离心；
(8)取上清gDNA eliminator column,1000离心30s；
(9)取收集管中溶液，加入相同体积的70％的乙醇，混合均匀；
(10)将混合液700ul转入Rneasy spin column中，1000g离心15s.
(11)加入700的Buffer RW1,10000g离心15s
(12)加入500ulRPE，10000g离心15s
(13)再次加入500ulRPE，10000g离心2min，换收集管，12000g离心1min.
(14)加入30-60ulRNAfree ddH2O(预热至60℃)10000g离心1min，收集RNA重复一次，提高得率。
分别取两种星天牛雌雄触角RNA样品2μl，运用NanoDrop 8000(Thermo，Waltham，MA，USA)检测RNA的浓度、OD260/OD280值，OD260/OD230值。
1.2反转录合成cDNA第一链
分别以触角总RNA为模板反转录合成cDNA第一链。
降解基因组DNA反应：冰上配置反应混合液(10ul体系)，具体如表1：
表1降解基因组DNA的反应体系
以上反应液轻打混匀，置于PCR反应：42℃2分钟。
反转录总体系为20ul。用移液枪混合均匀，瞬时离心。置于PCR反应，反应程序：37℃，15分钟；85℃，5秒。样品保存于-20℃冰箱中，或在超低温冰箱中长期保存。
表2 cDNA的反转录体系
实施例2光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46基因的克隆
2.1引物设计与PCR反应
根据光肩星天牛触角转录组测序获得的AglaOBP45、AglaOBP46的序列，利用在线软件Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)分别设计以下引物，克隆AglaOBP45和AglaOBP46的整个ORF区域。
AglaOBP45F：GGACAACTGCAACTCTTTGTCG
AglaOBP45R：GAGACCACAGATGGTGATGAGC
AglaOBP46F：GGTTCTGGTGATTGTGTATTTGG
AglaOBP46R：TACTCGCCGGTCCGTAAGATAG
用TAKARA公司的高保真酶进行目的基因PCR扩增，在冰上配置体系，SYBR PremixEx Taq II 12.5μL，正向引物0.75μL，反向引物0.75μL，模板cDNA 1μL，ddH2O 0.75μL，总体积25μL。PCR反应条件为：98℃,10s预变性；55℃ 5s；72℃ 5s，34个循环。产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并将符合目的条带大小的PCR产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序验证，以获得正确的目的条带(图1)。
利用PCR产物纯化试剂盒(EZNA cycle pure,kit vacuum protocal,OMEGA公司)，操作按照试剂盒说明，将回收产物保存于-20℃或直接用于T载体的连接。
2.2连接反应
将回收产物与pEASY-Blunt Simple载体连接，构建AglaOBPs-pEASY-BluntSimple质粒，并将其转化至Trans1-T1感受态中，扩大培养用于测序。反应体系为5μL(纯化后的PCR产物4μL和1μL pEASY-Blunt Simple)，常温放置10min，再转冰上2min。
2.3连接载体的转化及测序
(1)加连接产物于50ul Trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴25min；
(2)42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min；
(3)加入250μL平衡至室温的液体LB培养基，摇匀；
(4)200rpm，37℃，振荡培养1小时；
(5)取200μL菌液涂于含氨苄的LB固体培养基上，37℃培养12h；
(6)挑取若干个单克隆菌分别于5ml LB液体培养基(含氨苄)，摇床200r/min，37℃振荡培养6h；
(7)取适量菌液至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，鉴定目的片段连接是否正确。测序引物用M13F引物测序。
实施例3原核表达载体的构建
3.1目的片段的扩增及重组质粒提取
基于克隆得到的AglaOBP45和AglaOBP46的基因全长序列，去掉信号肽序列，设计了带有酶切位点(NdeI：CATATG，XhoI：CTCGAG)的引物，进行目的片段的扩增，引物序列如下：
AglaOBP45F：ACTTACATATGCTGATAAGATTAGGTGCCGCGTGC
AglaOBP45R：ACTACTCGAGTTATACTAAGAAGTAAGCATCTGGA
AglaOBP46F：ACTTACATATGCTGATAAGATTAGGTGCCGCGTGC
AglaOBP46R：ACTACTCGAGTTACGGATGGGGCAACTTGGGAA
克隆菌株测序验证正确后，进行扩大培养。后用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取质粒，获得带有目的片段的质粒。
3.2克隆质粒和表达载体的双酶切与酶切产物的连接
测序验证正确后，使用TAKARA的限制性内切酶NcoI和XhoI，对AglaOBP45和AglaOBP46克隆质粒和表达载体进行双酶切。AglaOBP46在42℃条件，酶切1h；AglaOBP45在37℃条件，酶切2h。双酶切后，1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，酶切产物切胶回收。用T4连接酶将双酶切得到的目的基因与表达载体分别进行连接，即构建表达载体。连接条件：16℃，过夜连接。连接产物转化至Trans-T1感受态细胞中，进行扩大培养。选择阳性克隆送公司测序，确定目的序列与表达载体连接正确。获得重组质粒AglaOBP45-pET30a、AglaOBP46-pET30a。
3.3重组质粒的诱导表达
将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆于10ml的LB培养基中(含卡那，50ug/ml)，37℃，250r/min，过夜培养。次日，按1:100的比例将以上菌液转入到新鲜的1L的LB培养基中,继续培养1-2h，至OD600值约为0.5-0.7,此时加入1mM的IPTG,37度，200r/m继续诱导表达6h。诱导表达完后,4℃，4000g离心20min收集菌体,然后，在菌液中加入10mM的PBS缓冲液(pH7.4)，室温环境，使用玻璃棒将菌体悬浮，使用超声波破碎仪在冰上将悬浮菌体破碎，后4℃，12000g离心20min。分别收集上清液和沉淀包涵体。进行SDS-PAGE电泳检测，分析AglaOBP45和AglaOBP46的各个蛋白在上清液和包涵体的表达情况。
使用Ni-NTA及蛋白纯化系统，对表达AglaOBP45和AglaOBP46蛋白进行纯化，后经15％的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白单一条带。采用透析方法对蛋白进行复性，使包涵体释放蛋白。复性溶液的配方包括，8mol/L的尿素，0.5mol/L的NaCl，50mmol/L的Tris-HCL，10mmol/L的碳酸盐，0.5mol/L的氧化性谷胱甘肽及5mol/L还原性谷胱甘肽。最后经后经15％的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白单一条带。用分光光度计测定复性后的蛋白的OD值，根据Lambert-Beer方法计算蛋白的浓度。
实施例4AglaOBP45、AglaOBP46的三维建模与配体分子的虚拟筛选
4.1模板选择与蛋白结构模建
基于光肩星天牛AglaOBP45和AglaOBP46的氨基酸序列，利用Blast程序在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)中比对，选择已获得晶体结构且氨基酸序列一致性大于30％的OBPs为模板。用于AglaOBP45和AglaOBP46的三维结构建模。
使用MODELLER9.15程序将光肩星天牛AglaOBP45和AglaOBP46的氨基酸序列与模板序列进行比对。然后，生成1000个可能的模建结构，从中选择分值最优的(最接近1)一个结果，采用Chimera软件来评估每个蛋白结构中电荷的分配情况，并采用最速下降和共轭梯度法进行结构能量最小化优化。
4.2蛋白模型评价
为确保同源模建所获得模型的质量，对三维建模获得的最佳模型结构进行评估，使用UCLA-DOE的SAVES v5.0(http://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)评估各个蛋白模型。Procheck评估模型的几何结构，即所有氨基酸残基的立体化学结构的质量，给出的形式是拉氏图(Ramachandran)；ERRAT分析三维结构中不同原子间的非键作用与高分辨率晶体结构间的差异情况；VERIFY_3D比较模型和氨基酸一级结构的关系，最终综合分析模型各项参数的合理性，确定正确的模建结构(图2、图3)。在MODELLER程序中分别评估AglaOBP45和AglaOBP46结构中保守半胱氨酸残基二硫键的情况。
4.3分子对接
从ZINC数据库(http://zinc.docking.org/)以及Pubchem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得配体分子模型。使用AutoDock Vina和AutoDock分别进行蛋白与气味化合物的对接。首先，AutoDock Vina程序用于执行自动计算对接，根据结合自由能(△G)的大小来衡量AglaOBP45和AglaOBP46与配体分子亲和度并进行排序。使用AutoDock 4.2进一步对接，分析得分小于-7的化合物的结合模式。使用拉马克遗传算法(Lamarckian genetic algorithm)。Swiss-Pdb-Viewer、pymol等进行蛋白质结构显示。
分别获得了两种气味结合蛋白与34种光肩星天牛寄主主要挥发物和7种信息素分子的结合亲和力预测结果(见表3)。
实施例5AglaOBP45、AglaOBP46的荧光竞争结合
5.1AglaOBPs与1-NPN的结合能力测定
将纯化后保存的重组蛋白AglaOBP45和AglaOBP46溶于20mmol/L TrisHC(pH＝7.4)缓冲液中，配制终浓度为1mg/ml。用甲醇(色谱级)溶解荧光探针和配体物质(气味标样)，终浓度为1mmol/L。然后，测定AglaOBPs与1-NPN的结合常数。在96孔荧光板中加入250μl的浓度为20mmol/L的Tris-HCL(pH7.4)缓冲液，然后加入蛋白溶液，使蛋白终浓度为2μM，最后加入溶于甲醇溶液的1-NPN，使1-NPN的浓度从2-20μM按梯度递增。设置激发光波长为337nm，发射波长380nm，终止波长520nm。每次加入1-NPN后，记录其最强荧光值，根据Scatchard方程分别计算AglaOBP45和AglaOBP46与1-NPN的结合常数K1-NPN。K1-NPN值越小结合能力越强。
5.2AglaOBP45和AglaOBP46与气味配体的结合能力测定
在96孔荧光板中加入250ul的浓度为20mmol/L的Tris-HCL(pH7.4)缓冲液，然后加入蛋白溶液，使其终浓度也为2μM，待荧光值稳定后，记录最强荧光值。然后，逐次加入0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、6μl、8μl、12μl、16μl、20μM的气味标样到AglaOBPs与1-NPN的混合溶液中。记录不同浓度时荧光强度的变化情况。每次试验进行三次重复。
假设AglaOBP与具有100％的活性，且与配体物质的结合比例为1:1，根据荧光强度值降低到初始值得一半时配体物质的浓度IC50值，计算AglaOBP与配体的结合常数Ki。计算公式为：Ki＝[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)。[1-NPN]为游离的1-NPN浓度；K1-NPN为AglaOBPs与1-NPN的结合常数(表4，图4-8)。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46及其在筛选引诱剂中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 135
<212> PRT
<213> 光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)
<400> 1
Met Asn Leu Ser Val Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Cys Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Lys Gly Leu Ser Glu Ser Lys Phe Ile Ala Ala Lys Ala Glu Ala
20 25 30
Arg Ala Ala Cys Leu Ala Ser Thr Gly Val Ser Glu Asp Leu Val Met
35 40 45
Asp Ile Asn Arg Asp Gly Lys Phe Ala Asp Asp Glu Asn Leu Lys Cys
50 55 60
Tyr Val Lys Cys Val His Glu Tyr Leu Gly Leu Met Ala Glu Asp Gly
65 70 75 80
Thr Met Asp Tyr Glu Lys Leu Ile Glu Asn Ile Pro Glu Glu Phe Arg
85 90 95
Ile Lys Tyr Ala Ser Arg Ile Arg Ala Cys Gly Thr Ile Tyr Gly Ser
100 105 110
Asp Val Cys Asp Thr Ala Trp Leu Thr Ile Lys Cys Tyr Gly Glu Asn
115 120 125
Ile Pro Lys Leu Pro His Pro
130 135
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> 光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)
<400> 2
Met Leu Ile Arg Leu Gly Ala Ala Cys Gly Cys Val Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Pro Leu Val Leu Ser Ile Ser Glu Glu Leu Gln Glu Leu Val Asp Met
20 25 30
Leu His Asn Thr Cys Val Gly Glu Thr Gly Thr Ser Glu Glu Ala Ile
35 40 45
Glu Asn Ala Lys Lys Gly Asp Phe Ala Asp Asp Glu Lys Phe Lys Cys
50 55 60
Tyr Leu Met Cys Ile Met Val Gln Met Ala Cys Ile Asp Glu Asp Gly
65 70 75 80
Ile Val Asp Val Glu Ala Thr Ile Ala Val Ile Pro Glu Glu Phe Gln
85 90 95
Asp Leu Ala Ala Pro Ile Ile Arg Lys Cys Asp Thr Gln Lys Gly Ser
100 105 110
Thr Pro Cys Glu Ser Ala Trp Leu Thr His Lys Cys Tyr Tyr Asn Glu
115 120 125
Asn Pro Asp Ala Tyr Phe Leu Val
130 135
<210> 3
<211> 408
<212> DNA
<213> 光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)
<400> 3
atgaatctaa gtgtaacttt attatatgtt ctattttgtc tcacctcgat taagggtcta 60
tctgaaagta aatttatagc agctaaagct gaagctcgcg ctgcttgctt agccagcact 120
ggagtctcag aagatttggt tatggatatt aatagagacg gcaagtttgc tgatgacgag 180
aatttgaaat gctacgtaaa atgtgttcac gaatatcttg gattgatggc tgaagatggt 240
actatggatt atgaaaagct tatcgagaac atacctgaag agtttcgaat caagtatgct 300
tctagaattc gagcctgtgg aactatatat gggtcggatg tatgtgacac cgcctggtta 360
accatcaaat gttatggcga aaatattccc aagttgcccc atccgtaa 408
<210> 4
<211> 411
<212> DNA
<213> 光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)
<400> 4
atgctgataa gattaggtgc cgcgtgcggc tgtgtccttt tagttcttcc tctagttctt 60
agcataagtg aagaacttca agagctggtg gacatgcttc acaatacatg cgtaggagag 120
acggggacat cagaagaggc tatagagaac gccaagaagg gagattttgc tgacgatgaa 180
aaatttaaat gctacttgat gtgtattatg gtccaaatgg cttgtataga cgaagacgga 240
atagtagatg tggaggcgac catagcggtc attccagagg aattccagga cctcgcagct 300
ccgattatta gaaaatgcga tacgcaaaag ggatccaccc cttgtgaaag tgcttggctg 360
acgcacaagt gctactacaa cgaaaatcca gatgcttact tcttagtata a 411

Claims (7)

1.光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46，其特征在于，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：
1)自序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列；
2)将自序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有气味结合活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46，其特征在于，所述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的基因序列分别如序列表SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
3.一种含权利要求1所述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的基因载体。
4.含有权利要求3所述光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的基因载体的工程菌。
5.扩增权利要求1所述的光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46基因中任一片段的引物。
6.一种基于光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的引诱剂筛选方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)基于光肩星天牛AglaOBP45和AglaOBP46的氨基酸序列，利用Blast程序在蛋白质结构数据库中比对，选择已获得晶体结构且氨基酸序列一致性大于30％的OBPs为模板，用于AglaOBP45和AglaOBP46的三维结构建模；
(2)使用MODELLER9.15程序将光肩星天牛AglaOBP45和AglaOBP46的氨基酸序列与模板序列进行比对，生成1000个可能的模建结构，从中选择分值最接近1的一个结果，采用Chimera软件来评估每个蛋白结构中电荷的分配情况，并采用最速下降和共轭梯度法进行结构能量最小化优化；
(3)从ZINC数据库以及Pubchem数据库获得配体分子模型，使用AutoDock Vina和AutoDock分别进行蛋白与气味化合物的对接；获得模拟的引诱剂；
(4)AglaOBP45和AglaOBP46与获得模拟的引诱剂的结合能力测定，荧光竞争的IC50值<20μmol/L，或解离常数KD为<20μmol/L的化合物，确定为适合光肩星天牛的嗅觉引诱剂。
7.根据权利要求6所述基于光肩星天牛气味结合蛋白OBP45、OBP46的引诱剂筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述对接的操作步骤为：利用AutoDock Vina程序执行自动计算对接，根据结合自由能(△G)的大小来衡量AglaOBP45和AglaOBP46与配体分子亲和度并进行排序，使用AutoDock进一步对接，分析得分小于-7的化合物的结合模式。
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