CN117717624A

CN117717624A - 一种ros敏感的纳米颗粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117717624A
Application number: CN202311474755.0A
Authority: CN
Inventors: 范丽霞; 汪军; 王瑞雪; 杨画
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2023-11-07
Filing date: 2023-11-07
Publication date: 2024-03-19

Abstract

本发明公开了一种ROS敏感的纳米颗粒及其制备方法和应用，按以下步骤进行制备：S1：合成二碲二丙酸；S2：制备二碲交联的纳米颗粒：在氮气环境中，将二碲二丙酸和N‑羟基琥珀酰亚胺溶于二氯甲烷中，然后在冰浴中，将1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的二氯甲烷溶液滴加到混合溶液中，并在室温下搅拌混合物4h；加入水经过萃取、蒸发，得到黄色固体；将其溶于丙酮中，即得二碲二丙酸活性酯溶液；将二碲二丙酸活性酯溶液缓慢加入含有氨基的聚合物的水溶液中，在室温下搅拌3h后离心收集纳米颗粒，即得。该制备方法制得的ROS敏感的纳米颗粒ROS敏感性强，且生物相容性和生理稳定性良好。

Description

一种ROS敏感的纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米复合材料技术领域，特别涉及一种ROS敏感的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

目前，化疗仍是临床治疗肿瘤的重要手段。然而，药物在杀灭癌细胞的同时杀灭大量的正常细胞，导致治疗效果较差，形成严重的毒副作用。为了克服这些问题，在过去的几十年中，研究人员已经开发了包括脂质体、胶束、纳米凝胶和其他纳米颗粒的各种纳米尺寸的药物递送系统，显著改善了药物的溶解度、稳定性和血液循环时间。基于增强的渗透和保留(EPR)效应，这些药物递送系统可以在肿瘤组织处积聚并增加药物浓度。在这些药物递送系统中，具有交联的三维网络的刺激响应性聚合物纳米颗粒作为药物载体已经引起了人们的很多关注，其具有优异的生理稳定性并能够响应细胞内刺激从而在肿瘤部位有效释放药物，例如，pH、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)和酶等。ROS是最重要的生理刺激之一，其与多种疾病相关，包括癌症、类风湿性关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病。高的ROS水平在几乎所有类型的癌症中都很常见，并在癌症的发生和传播中发挥重要作用。此外，ROS还参与细胞信号通路，可通过各种途径穿透细胞膜，由于分子氧的不完全还原，细胞内的ROS主要由线粒体产生。过氧化氢(H₂O₂)是细胞中存在的最丰富、最稳定的非自由基ROS。正常组织中的H₂O₂浓度在20nM左右，而癌症组织中的H₂O₂浓度由于H₂O₂的产生和积累过多而高达50-100μM。于是研究人员利用这种显著的H₂O₂浓度差异设计和制备了ROS敏感的纳米药物载体，在肿瘤细胞内刺激下，结构发生改变，以达到特定部位高效输送药物的目的。

氧化还原反应是过去几十年中最常用的方法之一，并且是实现肿瘤细胞内可控制药物释放的理想选择。二硫键是常用的还原敏感键之一，在血液循环和细胞外环境中足够稳定，但由于细胞外区域和细胞内区域中谷胱甘肽浓度梯度显著，二硫键在细胞内还原环境中裂解产生两个硫醇基团。因此，研究人员已经将二硫键引入载体中制备了许多聚合物纳米颗粒。受二硫键成功的启发，近年来二碲键的材料引起了极大的兴趣，碲元素作为氧族元素中的第四个成员，与硫相比，碲具有更大的原子半径和更低的电负性，使得碲参与形成的化学键键能更低，低价态的含碲分子对氧化刺激更加敏感，由于这些独特的特征，研究人员已经开发出用于生物医学应用的各种碲纳米材料。例如，张乐帅教授课题组合成了含二碲键的两亲性的聚醚氨酯。这些自组装胶束表现出氧化响应性药物的快速释放。殷黎晨教授课题组利用二碲交联的聚乙烯亚胺包裹siVCAM-1，在发炎的内皮细胞中，也就是高的ROS环境中，其降解成低分子量片段，以促进细胞内siVCAM-1释放并增强VCAM-1沉默效率。但是，胶束在低浓度下易于解离，稳定性较低。此外，核交联聚合物胶束和纳米凝胶是合成材料，需要复杂的合成步骤，甚至包含光辐射过程。

天然多糖，如壳聚糖和透明质酸，是一类多功能的丰富的可再生生物聚合物。由于其具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，已被广泛应用于生物医学领域，主要应用于口服药物、基因药物、蛋白药物以及疫苗的体内外递送研究中，也可用于制备缓释和靶向制剂，如包载胰岛素、紫杉醇、环孢素、DNA和siRNA、白细胞介素、5-氟尿嘧啶等。壳聚糖是一种独特的碱性天然多糖，由葡糖胺和N-乙酰氨基葡糖胺构成，壳聚糖提供了多种含有氨基的官能团，可以通过交联来构建水凝胶和纳米颗粒。然而，壳聚糖分子链上的氨基和羟基容易形成强的分子内和分子间氢键，难以在水和多数有机溶剂中溶解，这极大地限制了其应用，因此常常需要对壳聚糖进行化学改性。使用含有氨基的聚合物(如壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、明胶、牛血清白蛋白、血清白蛋白等)可以克服这一限制，它仍然具有生物降解性、生物兼容性和无毒性的优点，它在药物传递系统中的应用更加广泛，可以制成纳米粒、微球、胶束、智能水凝胶等多种形式。尽管近年来已经使用羧甲基壳聚糖作为原料制备了各种纳米颗粒，但是相应的二碲纳米颗粒很少有报道，可能是因为纳米颗粒的尺寸难以控制。因此，迫切需要开发简单且有效的方法制备二碲交联的天然高分子基纳米颗粒。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，该制备方法工艺简单，通过将3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)与含有氨基的聚合物的交联反应制备得到的纳米颗粒，ROS敏感性强，且生物相容性和生理稳定性良好。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

S1：合成二碲二丙酸；

S2：制备二碲交联的纳米颗粒：在氮气环境中，将二碲二丙酸和N-羟基琥珀酰亚胺溶于二氯甲烷中，然后在冰浴中，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的二氯甲烷溶液滴加到混合溶液中，并在室温下搅拌混合物4h；加入水经过萃取、蒸发，得到黄色固体，即3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)；将其溶于丙酮中，即得二碲二丙酸活性酯溶液；将二碲二丙酸活性酯溶液缓慢加入含有氨基的聚合物的水溶液中，在室温下搅拌3h后离心收集纳米颗粒，即得。

相比于现有技术，本发明采用简单的方法步骤首次制备得到二碲交联的纳米颗粒，通过3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSeDPA-NHS)与含有氨基的聚合物的交联反应即可制得纳米颗粒，方法步骤简单，且不需要任何催化剂和乳化剂。采用该制备方法制得的二碲交联的纳米颗粒中的二碲键可以在高氧化还原和ROS水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，在作为药物载体时有利于药物的快速释放。选择含有氨基的聚合物作为纳米颗粒的骨架，不仅提高了纳米载体的生物相容性，而且增强了生理稳定性。可见，该方法具有明显的成本效益和操作便利性，可促进高分子的二碲纳米材料的发展。

进一步地，步骤S1中，采用以下方法合成二碲二丙酸：在氮气环境中，将碲粉悬浮在水中，然后将硼氢化钠的水溶液逐渐加入碲粉悬浮液中；当溶液澄清后，加入碲粉并在100℃下搅拌30min；然后，将3-氯丙酸的水溶液加入到混合溶液中，并在室温下搅拌反应24h，过滤除去沉淀物，将溶液酸化后收集得到黄色沉淀物，并在乙酸乙酯中重结晶。

进一步地，步骤S2中，所述二碲二丙酸活性酯溶液中3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的浓度为6～9mg/mL。

进一步地，步骤S2中，所述二碲二丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的摩尔比为2:5:5。

进一步地，步骤S2中，步骤S2中，所述含有氨基的聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、明胶、牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的任一种。这些聚合物含有氨基，氨基可以与3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)反应从而交联成纳米颗粒。

优选的的，步骤S2中，所述含有氨基的聚合物为羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖水溶液的浓度为10～25mg/mL。

进一步地，步骤S2中，离心转数为10000～12000rpm，离心时间为10min。

进一步地，步骤S1中，所述碲粉悬浮液中的碲粉与所述硼氢化钠的水溶液中的硼氢化钠的摩尔比为1:2；当溶液澄清后加入的碲粉和所述3-氯丙酸的水溶液中的3-氯丙酸的摩尔比为1:2。

本发明还提供采用上述制备方法制备得到的ROS敏感的纳米颗粒。

本发明还提供上述ROS敏感的纳米颗粒在作为药物载体时的应用。尤其是作为化疗药物的载药材料时，二碲键可以在高氧化还原和ROS水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，伴随着化疗药物的快速释放。

本发明还提供一种载阿霉素纳米颗粒，其采用上述ROS敏感的纳米颗粒作为阿霉素的载体。优选的，该载阿霉素纳米颗粒可以采用以下方法制得：将阿霉素溶液加入到ROS敏感的纳米颗粒的悬浮液中，在室温下暗处搅拌12h后，将悬浮液以1×10⁴rpm离心10分钟，之后将沉淀真空干燥，即得载阿霉素纳米颗粒。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过简单的方法步骤制得二碲交联的纳米颗粒，纳米颗粒中的二碲键可以在高氧化还原和ROS水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，在作为药物载体时有利于药物的快速释放。同时，其生物相容性和生理稳定性强，有利于其在作为化疗药物载体时的应用。

(2)本发明的制备方法不需要任何催化剂和乳化剂，其成本低廉且操作方便，具备良好的经济效益和大规模生产前景，这将促进高分子的二碲纳米材料的发展。

(3)经过实验可以验证，作为阿霉素的载体时，本发明提供的二碲交联的纳米载体ROS敏感强，不仅提高了生理稳定性，而且能有效抑制DOX的释放。

附图说明

图1为实施例1制得的二碲二丙酸的¹H NMR图；

图2为对比例1制得的DS-CMC NPs(a)和实施例1制得的DTe-CMC NPs(b)的粒径分布和透射电镜图；

图3为应用对比例制得的DS-CMC/DOX NPs(a)和应用实施例制得的DTe-CMC NPs(b)在不同pH值下的DOX释放曲线图；

图4为应用对比例制得的DS-CMC/DOX NPs和应用实施例制得的DTe-CMC NPs在100μM H₂O₂中的DOX释放曲线图；

图5为对比例1制得的DS-CMC NPs(a)和实施例1制得的DTe-CMC NPs(b)对HepG2细胞和H22细胞的细胞毒性柱状图

图6为游离DOX、应用对比例制得的DS-CMC/DOX NPs(a)和应用实施例制得的DTe-CMC/DOX NPs对HepG2细胞(a)和H22细胞(b)的细胞毒性柱状图

图7为HepG2细胞中游离DOX、应用对比例制得的DS-CMC/DOX NPs和应用实施例制得的DTe-CMC/DOX NPs 4h的CLSM图像(a)及流式细胞仪检测HepG2细胞中DOX的水平曲线图(b)。

现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种ROS敏感的纳米颗粒、制备方法和应用进行具体说明。

在本发明的一些实施方式中提供了一种ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

S1：合成二碲二丙酸；

在本发明的一些实施方式中，步骤S1可采用以下方法合成二碲二丙酸：在氮气环境中，将碲粉悬浮在水中，然后将硼氢化钠的水溶液逐渐加入碲粉悬浮液中；当溶液澄清后，加入碲粉并在100℃下搅拌30min；然后，将3-氯丙酸的水溶液加入到混合溶液中，并在室温下搅拌反应24h，过滤除去沉淀物，将溶液酸化后收集得到黄色沉淀物，并在乙酸乙酯中重结晶。该方法步骤操作简单，没有严苛的实验条件或复杂的操作流程，具有较好的经济效益和推广前景。

在本发明的一些实施例中，步骤S2中二碲二丙酸活性酯溶液中3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的浓度优选为6～9mg/mL。

在本发明的一些实施例中，步骤S2中的含有氨基的聚合物可以选择壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、明胶、牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的任一种，在本发明的优选实施例中，选择羧甲基壳聚糖与3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)反应，羧甲基壳聚糖的水溶液的浓度为10～25mg/mL。

在本发明的一些实施例中，步骤S2中，离心处理步骤的优选条件为：离心转数为10000～12000rpm，离心时间为10min。

在本发明的一些实施例中，步骤S1中，碲粉悬浮液中的碲粉与硼氢化钠的水溶液中的硼氢化钠的摩尔比为1:2；当溶液澄清后加入的碲粉和所述3-氯丙酸的水溶液中的3-氯丙酸的摩尔比为1:2。

本发明还提供了上述任一实施方式制得的ROS敏感的纳米颗粒，其较高的ROS敏感性可以在载药领域得到广泛应用。

在本发明的一些实施例中，提供了ROS敏感的纳米颗粒在作为药物载体时的应用。优选地，ROS敏感的纳米颗粒在作为化疗药物的载药材料时具有明显优势，其二碲键可以在高氧化还原和ROS水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，伴随着化疗药物的快速释放。

在本发明的一些实施例中，提供了一种载阿霉素纳米颗粒，其采用上述任一实施方式制得的ROS敏感的纳米颗粒作为阿霉素的载体。优选的，该载阿霉素纳米颗粒可以采用以下方法制得：将阿霉素溶液加入到ROS敏感的纳米颗粒的悬浮液中，在室温下暗处搅拌12h后，将悬浮液以1×10⁴rpm离心10分钟，之后将沉淀真空干燥，即得载阿霉素纳米颗粒。该载阿霉素纳米颗粒的ROS敏感强，生理稳定性高，且能有效抑制DOX在生理条件下的泄露，在肿瘤部位，ROS水平高，二碲键断裂，纳米颗粒结构破坏，药物快速释放；正常组织ROS水平低，纳米颗粒未被破坏，药物释放缓慢，避免对正常组织带来不良反应，达到精准治疗的目的。

下面通过具体实施例以及附图对本发明作进一步阐释，但是本发明的技术方案不以具体实施例为限。

实施例1ROS敏感的纳米颗粒(二碲交联的羧甲基壳聚糖纳米颗粒DTe-CMC NPs)的制备

本实施例采用以下方法制备ROS敏感的纳米颗粒：

S1：合成二碲二丙酸(DTeDPA)：

在氮气的环境中，将碲粉(1.27g,10mmol)悬浮在10mL水中。然后将溶解于5mL水中的硼氢化钠(0.75g，20mmol)逐渐加入碲粉悬浮液中。当溶液澄清后，加入碲粉(1.27g,10mmol)，并在100℃下搅拌持续30分钟。然后，将溶于10mL水(pH 9-10)中的3-氯丙酸(2.15g，20mmol)加入到混合溶液中，并在室温下搅拌反应24h，过滤除去沉淀物，并用4MHCl将溶液酸化。收集得到黄色沉淀物，并在乙酸乙酯中重结晶。

S2：制备二碲交联的纳米颗粒(DTe-CMC NPs)

在氮气的环境中，向带有磁力搅拌器的烧瓶中加入DTeDPA(0.8g，1.6mmol)、NHS(0.47g，4mmol)和10mL二氯甲烷。然后，在冰浴中，将溶解在5mL二氯甲烷中的EDC(0.79g，4mmol)滴加到溶液中，并在室温下搅拌混合物4h。加入水萃取、蒸发，得到黄色固体，即3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)；然后在10mL丙酮中溶解，获得的活性酯溶液(DTeDPA-NHS的丙酮溶液)可供进一步使用。

将溶于4mL丙酮中的DTeDPA-NHS(16mg)缓慢加入2mL CMC(10mg/mL)的水溶液中。在室温下搅拌3h后，将悬浮液以1000rpm离心10分钟以收集纳米颗粒，即得DTe-CMC NPs。

实施例2ROS敏感的纳米颗粒的制备

本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于本实施例中步骤S2中加入到2mL CMC(10mg/mL)的水溶液中的DTeDPA-NHS的用量为12mg。

实施例3ROS敏感的纳米颗粒的制备

本实施例与实施例1基本相同，区别仅在于本实施例中步骤S2中加入到2mL CMC(10mg/mL)的水溶液中的DTeDPA-NHS的用量为18mg。

对比例1二硫交联的纳米颗粒(DS-CMC NPs)的制备

本对比例采用以下方法制备二硫交联的纳米颗粒(DS-CMC NPs)：

将溶于4mL丙酮中的DSDPA-NHS(8mg，市购可得)缓慢加入2mL CMC(10mg/mL)的水溶液中。在室温下搅拌3h后，将悬浮液以1000rpm离心10分钟以收集纳米颗粒，即得DS-CMCNPs。

应用实施例载阿霉素纳米颗粒DTe-CMC/DOX NPs的制备

本应用实施例采用以下方法制得载阿霉素纳米颗粒DTe-CMC/DOX NPs：

将2mL DOX溶液(2mg/mL)加入到5mL实施例1制得的DTe-CMC NPs悬浮液(2mg/mL)中，在室温下暗处搅拌12h后，将悬浮液以1×10⁴rpm离心10分钟，之后将沉淀真空干燥，干燥彻夜后即可得到需要的载药纳米颗粒。

应用对比例载阿霉素纳米颗粒DS-CMC/DOX NPs的制备

本应用对比例采用以下方法制得载阿霉素纳米颗粒DS-CMC/DOX NPs：

将2mL DOX溶液(2mg/mL)加入到5mL DS-CMC NPs(2mg/mL)中。在室温下暗处搅拌12h后，将悬浮液以1×10⁴rpm离心10分钟，之后将沉淀真空干燥，干燥彻夜后即可得到需要的载药纳米颗粒。

测试例1ROS敏感的纳米颗粒的表征

请参阅图1，实施例1制得的二碲二丙酸的结构通过氢谱((¹H NMR)进行分析确认。¹H NMR在Broker Advance-400核磁共振波谱仪上测量，溶剂为氘代二甲亚砜(DMSO-d6)，以四甲基硅烷CTMS)为内标。使用Brookaven 90Plus动态光散射仪(DLS)测量了不同纳米颗粒的粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位。

对比例1和实施例1分别将不同交联剂DSDPA-NHS和DTeDPA-NHS加入羧甲基壳聚糖共价交联，分别得到DS-CMC NPs和DTe-CMC NPs。最初，CMC很好地溶解在水中，然后将含有DSDPA-NHS或DTeDPA-NHS的丙酮缓慢加入到CMC水溶液中。这使得CMC链更加紧密。当丙酮加入量达到一定程度时，溶液变成乳白色，呈现出胶状颗粒的形成。同时，用DSDPA-NHS或DTeDPA-NHS交联胶体粒子。实施例中制备这些纳米颗粒的方法非常简单，不需要任何催化剂和乳化剂。

在制备纳米颗粒的过程中，本测试例研究了交联剂用量和CMC浓度(10-25mg/mL)对纳米颗粒物理特性的影响，纳米颗粒的粒径随着交联剂用量的增加而减小，这是由于纳米颗粒的高交联度造成的。进一步增加交联剂的用量，由于纳米粒子之间的交联，纳米颗粒的粒径增大。此外，随着CMC浓度的增加，可以得到粒径合适、收率较高的纳米颗粒。但进一步增加CMC的浓度，会得到较大的颗粒或析出物。因此，实施例1为所得纳米颗粒尺寸和性能最佳的实施例。

测试例2DOX的负载和体外释放

标准曲线的测定：称取一定量的盐酸阿霉素，用缓冲液配制成1mg/mL的盐酸阿霉素母液，然后用缓冲液稀释成浓度为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL和3.125μg/mL的不同浓度的标准样，分别取200μL标准样用酶标仪检测吸光度，检测波长为481nm，以对照品浓度与吸光度进行回归处理，得标准曲线为一直线，r＝0.9999，结果表明，在3.125μg/mL～100μg/mL浓度范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系。

将应用实施例和应用对比例所制得的DTe-CMC/DOX NPs和DS-CMC/DOX NPs离心后使用波长为481nm的酶标仪来测定上清液游离DOX的吸光度，带入标准曲线方程求得上清液中DOX的含量，使用以下公式计算载药量(DLC)和包封率(DLE)：

DLC(％)＝(NPs中DOX的重量)/(负载DOX的NPs的重量)×100％

DLE(％)＝(NPs中DOX的重量)/(总DOX的重量)×100％。

经过计算，得到如表1所示的数据，可以看出应用实施例所制得的DTe-CMC/DOXNPs的载药量较高，可达到25％，远高于现有材料的载药量(5～15％)。同时通过激光粒度仪检测纳米颗粒的粒径以及分散系数。

表1负载DOX的DS-CMC NPs和DTe-CMC NPs的表征

分别在不同pH环境(pH 7.4,6.5,5.5,100μM H₂O₂)中测定DS-CMC/DOX NPs和DTe-CMC/DOX NPs的药物释放曲线。简而言之，将1mL装载DOX的纳米颗粒悬浮液(DOX,0.5mg/mL)加入透析袋中，与5mL相应的PBS进行透析，并以100rpm的速度在37℃的避光环境中缓慢摇晃，在0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120h时，对透析液进行取样5mL，并用5mL透析空白溶液代替，所有样品设定三个平行样，用酶标仪在481nm处测定透析液中DOX含量。使用以下公式计算累计释放度：

式中：V0为释放介质的总体积，Cn为各时间点测得的药物浓度，V为每次取样体积，W为投入药物总质量。

在不同的pH值(5.5、6.5和7.4)的溶液中测定DS-CMC/DOX NPs和DTe-CMC/DOX NPs的药物释放能力，如图3所示。对于DS-CMC/DOX NPs，其在pH 7.4、pH 6.5和pH 5.5时120h内DOX的累计释药量分别为19.3％、57.4％和90.3％。DS-CMC/DOX NPs和DTe-CMC/DOX NPs的DOX释放显示出类似的pH依赖性分布，这归因于两个效应：低pH的DOX质子化效应，以及DOX与CMC之间的静电相互作用下降。此外，DS-CMC/DOX NPs和DTe-CMC/DOX NPs在不同pH值下的DOX释放没有明显差异。

进一步对DS-CMC/DOX NPs和DTe-CMC/DOX NPs的ROS触发的药物释放进行测试。如图4所示，在与100μM H₂O₂孵育72小时后，DTe CMC/DOX NPs的累积DOX释放增加到97.9％。而DS-CMC/DOX NPs的药物释放率小于20％，这是由于二碲键的ROS敏感性更高。二碲键在100μM H₂O₂中迅速断裂，产生亲水性碲酸，这也导致了纳米颗粒的解离。结果表明DTe-CMC NPs的ROS敏感更强。因此，二碲交联的纳米载体不仅提高了生理稳定性，而且能有效抑制DOX的释放。

测试例3负载DOX的纳米颗粒的细胞毒性和细胞摄取实验

细胞毒性检测：采用标准MTT法检测空白纳米颗粒、裸药DOX、应用对比例制得的DS-CMC/DOX NPs和应用实施例制得的DTe-CMC/DOX NPs的细胞毒性。将细胞接种到96孔板中，培养以进行增殖，并与不同样品共孵育24h。加入含MTT(0.5mg/mL)的新鲜培养基，继续培养4h。然后撤掉旧培养基，每孔加入150μL DMSO。然后用酶标仪测定实验数据(吸收值)。如图5和图6所示，从图中可以看出，即使是每孔的空白粒子浓度达到1mg/mL，细胞的存活率也在95％以上，表明材料无毒，且生物相容性好。制得的载药颗粒都呈现出浓度依赖性杀伤效果，即随着阿霉素浓度升高，细胞的存活率降低。其中，应用实施例制得的载药粒子的毒性低于裸药(DOX)，这主要是载药粒子的药物释放行为导致的。另外，DS-CMC/DOX NPs的细胞毒性低于DTe-CMC/DOX NPs，这是由于二碲交联的纳米颗粒的药物释放速率较二硫交联的纳米颗粒快。

用CLSM观察载有药物的纳米颗粒的细胞内释放行为。将细胞加入到每孔底部含有显微镜盖玻片的6孔板(每孔1×10⁵个细胞)中。在37℃的细胞培养箱里中留24h后，用2mL含有裸药DOX或者载有DOX的纳米颗粒(药物剂量：8μg/mL)的新鲜培养基更换旧培养基，混匀后共培养4h。除去培养基并用PBS(pH 7.4,10mM)洗涤细胞两次，并用4％甲醛溶液固定10min。对细胞核进行染色，然后用PBS洗涤两次。用CLSM观察两种细胞的摄取情况。

使用流式细胞仪进一步研究负载DOX的纳米颗粒的细胞摄取和细胞内药物释放。将细胞以每孔1x10⁵个细胞的密度接种到6孔板上并使其粘附24h。除去培养基，用PBS洗涤细胞两次，然后加入裸药DOX，保持DOX的浓度8μg/mL，在37℃培养箱培养4h。除去含药物的培养基并用PBS洗涤细胞两次。通过与胰蛋白酶溶液温育5分钟消化细胞，并将细胞悬液以1000rpm离心10分钟。随后，除去上层培养基，用1mL PBS重悬细胞。

如图7所示，从图中可以看出，DTe-CMC/DOX NPs比DS-CMC/DOX NPs具有更强的红色信号，这主要是因为DTe-CMC/DOX NPs更快的药物释放导致的。

综上，上述实施方式通过3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSeDPA-NHS)与羧甲基壳聚糖的交联反应即可制得纳米颗粒，方法步骤简单，且不需要任何催化剂和乳化剂。制得的二碲交联的纳米颗粒中的二碲键可以在高氧化还原和ROS水平的环境下，发生纳米颗粒的解离，在作为药物载体时有利于药物的快速释放。选择羧甲基壳聚糖等含有氨基的聚合物作为纳米颗粒的骨架，不仅提高了纳米载体的生物相容性，而且增强了生理稳定性。可见，该方法具有明显的成本效益和操作便利性，可促进其他含氨基的高分子的二碲纳米材料的发展，如选择乙二醇壳聚糖，明胶，聚赖氨酸等含氨基的聚合物作为纳米材料的骨架，亦可采用与本发明相似的方法制得二碲纳米颗粒。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

Claims

1.一种ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：合成二碲二丙酸；

2.根据权利要求1所述的ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤S1中，采用以下方法合成二碲二丙酸：在氮气环境中，将碲粉悬浮在水中，然后将硼氢化钠的水溶液逐渐加入碲粉悬浮液中；当溶液澄清后，加入碲粉并在100℃下搅拌30min；然后，将3-氯丙酸的水溶液加入到混合溶液中，并在室温下搅拌反应24h，过滤除去沉淀物，将溶液酸化后收集得到黄色沉淀物，并在乙酸乙酯中重结晶。

3.根据权利要求1所述的ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述二碲二丙酸活性酯溶液中3,3'-二碲二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的浓度为6～9mg/mL。

4.根据权利要求1所述的ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述二碲二丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的摩尔比为2:5:5。

5.根据权利要求1所述的ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述含有氨基的聚合物为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、乙二醇壳聚糖、明胶、牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的任一种。

6.根据权利要求5所述的ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述含有氨基的聚合物为羧甲基壳聚糖，羧甲基壳聚糖的水溶液的浓度为10～25mg/mL。

7.根据权利要求1所述的ROS敏感的纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述碲粉悬浮液中的碲粉与所述硼氢化钠的水溶液中的硼氢化钠的摩尔比为1:2；当溶液澄清后加入的碲粉和所述3-氯丙酸的水溶液中的3-氯丙酸的摩尔比为1:2。

8.一种ROS敏感的纳米颗粒，其特征在于：采用如权利要求1～7任一项所述制备方法制备而成。

9.如权利要求8所述的ROS敏感的纳米颗粒在作为药物载体时的应用。

10.一种载阿霉素纳米颗粒，其特征在于，采用以下方法制得：将阿霉素溶液加入到如权利要求8所述的ROS敏感的纳米颗粒的悬浮液中，在室温下暗处搅拌12h后，将悬浮液以1×10⁴rpm离心10分钟，之后将沉淀真空干燥，即得载阿霉素纳米颗粒。