CN117706082A - 一种蛋白质-dna-分子复合物及其制备方法 - Google Patents
一种蛋白质-dna-分子复合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种复合物，其包含通过双链DNA与多个分子Y连接的蛋白X分子，其中蛋白X和Y分别通过接头与双链DNA连接，优选分子Y通过线性、四面体、六面体、八面体、十二面体或二十面体构型的双链DNA与蛋白X连接，以及制备所述复合物的方法和包含所述蛋白X和分子Y的试剂盒。
Description
技术领域
本发明免疫及生物检测技术领域，具体涉及信号放大的蛋白质-DNA-分子复合物、尤其是HRP-DNA-IgG复合物及其制备方法。
背景技术
酶免疫分析技术是利用酶标记的抗体或抗原为探针，来检测疾病相关的目标抗原或抗体的生物检测技术，被广泛应用于各种医疗及科研场景。常用的三种免疫学检测方法，免疫组化，Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)均可使用酶标探针进行定位、定性和定量分析。酶标抗体或抗原具有敏感，有效期长，精准特异性好优点。辣根过氧化物酶(HRP)应用最为广泛，其分子量小，催化效率高，对酸碱和温度具有高度稳定性，且价格低廉，可以组合多种比色法、荧光法和发光法底物。
HRP可以直接标记在抗体或抗原上，也可以通过介质载体，将多个HRP和抗体组合起来，达到信号放大的目的。目前市场上的HRP直接标记二抗，每个抗体上HRP标记数量1-3个。此方法成本低，但是灵敏度不高，无法满足一些低丰度样品的检测要求，临床检测上基本已经不再使用。具有信号放大作用的商品化酶标二抗产品，目前主要基于生物素-链霉亲和素技术，葡聚糖技术和聚合物技术，后两者形成了目前临床应用的主要产品。这些技术大大提高了HRP/抗体的标记比例，提高了检测的灵敏度，但是仍然各自存在一定的局限：基于生物素-链霉亲和素的放大系统由于内源性生物素，存在背景干扰；基于葡聚糖技术的放大系统，以链状葡聚糖为骨架，连接多个HRP和多个抗体形成复合物。由于所用葡聚糖本身分子量大(50万)，结构松散，修饰多个HRP和二抗后的复合物具有很大的空间位阻，影响对抗原的高效结合。而目前最为先进的聚合物技术虽然相较于葡聚糖技术降低了空间位阻效应，但是得到的仍然是载体聚合物上负载多个HRP和多个二抗的复合物，没有对单独存在的二抗进行放大酶标，使得二抗实际工作浓度并未达到最优，尤其对于免疫组化(IHC)染色应用，多个串联的二抗不能灵活准确地显示抗原定位及分型。
中国发明专利申请202010769502.6提供了一种基于葡聚糖(Dex)载体的Dex-HRP-IgG结合物，通过对葡聚糖进行氧化或者氧化氨化，然后结合HRP及二抗的方式，提高了酶标二抗信号放大的倍数和检测灵敏度。但是此技术存在三方面不足，一是载体所用的葡聚糖T500分子量为50万，仍然存在较大的空间位阻效应，二是难以控制葡聚糖上连接HRP和二抗的数量，三是HRP经过高碘酸钠氧化后比活会大幅降低，最终影响灵敏度。
中国发明专利申请202110651244.6提供了一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法，此技术有两方面改进：一是采用分子量为常规二抗的10％～20％的纳米抗体做为二抗，减小了二抗的体积，提高了应用于免疫组化时的分子运动能力和穿透能力，进而提高了其染色强度和灵敏度；二是micropolymer为聚酰胺型树枝状高分子化合物或分子量小于40K的氨基葡聚糖、超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯或多聚赖氨酸。纳米抗体和micropolymer均采用异双功能偶联试剂修饰并反应连接。不足之处主要有两点，一是所述的micropolymer虽然基本涵盖了现有技术中的主要门类，但仍存在难以精确控制高分子聚合物上偶联的HRP和抗体的数量的弊端，且专利所述micropolymer HRP复合物中含有2-20个HRP，并未达到很高的信号放大倍数；二是和基于葡聚糖的放大系统一样，得到的仍然是载体聚合物上负载多个HRP和多个二抗的复合物，没有对单独存在的二抗进行放大酶标，使得二抗实际工作浓度并未达到最优，尤其对于免疫组化(IHC)染色应用，多个串联的二抗不能够灵活准确地显示抗原定位及分型。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种复合物，其形式为：蛋白X-DNA-(分子Y)n，其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，其中蛋白X和分子Y分别通过接头与DNA连接，优选分子Y通过线性、四面体、六面体、八面体、十二面体或二十面体、更优选正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体或正二十面体构型的DNA与蛋白X连接。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中分子Y通过接头分别与第一和第二单链DNA(ssDNA)连接，蛋白X通过接头与第三ssDNA连接，其中所述第三ssDNA包含序列B0，所述第一ssDNA包含序列B0’和B1’，所述第二ssDNA包含序列B0和B1，其中：B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，由此与第三ssDNA连接的蛋白X通过交替存在的与分子Y连接的第一和第二ssDNA而与多个分子Y连接形成所述复合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种式(I)所示的复合物，
其中：
蛋白X通过接头与位于ssDNA序列B0的5’或3’端的序列Bx连接形成(B0)BxX，分子Y通过接头分别与位于ssDNA序列(B0BsB1’)的5’或3’端的序列By和位于(B0BsB1)的5’或3’端的序列Bz连接形成(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，
由于交替存在的(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY通过碱基配对形成双链DNA，一个蛋白X分子与多个分子Y连接。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分子Y通过四面体结构的双链DNA分子与蛋白X连接形成的复合物，其中：
分子Y通过接头分别与第一、第二和第三ssDNA连接，然后第一、第二、第三与第四ssDNA通过碱基配对形成的双链DNA形成四面体结构，所述第一、第二、第三和第四ssDNA均包含3个亚序列，其中所述第一、第二、第三和第四ssDNA中每一个ssDNA的所述3个亚序列分别与其余三个ssDNA的所述3个亚序列之一互补，
蛋白X与第五ssDNA通过接头连接，所述第五ssDNA包含序列B0，
所述第四ssDNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
与蛋白X连接的第五ssDNA通过B0与B0’配对形成的双链DNA而与所述四面体结构的双链DNA连接。
在一个方面，本发明提供了一种制备复合物：蛋白X-DNA-(分子Y)n的方法，包括：
-将蛋白X通过接头与单链DNA连接，
-将分子Y通过接头与单链DNA连接，其中与蛋白X连接的单链DNA和与分子Y连接的单链DNA至少部分互补，
-将蛋白X连接的单链DNA与分子Y连接的单链DNA退火，
其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。
在一个实施方案中，本发明提供了制备复合物的方法，包括：
-将分子Y通过接头分别与第一和第二ssDNA连接，
-将蛋白X通过接头与第三ssDNA连接，
-将蛋白X连接的第三ssDNA与分子Y连接的第一ssDNA接触，
-交替加入分子Y连接的第二ssDNA和分子Y连接的第一ssDNA，直至所需数目的分子Y与蛋白X分子连接，
其中：
所述第一ssDNA包含序列B0’和B1’，
所述第二ssDNA包含序列B0和B1，
所述第三ssDNA包含序列B0，
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，
由此与通过交替添加与分子Y连接的第一和第二ssDNA，一个蛋白X分子而与多个分子Y连接形成所述复合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分子Y通过四面体结构的双链DNA分子与蛋白X连接形成复合物的方法，包括：
(a)将分子Y通过接头分别与第一ssDNA、第二ssDNA和第三ssDNA连接；
(b)将(a)获得的第一ssDNA、第二ssDNA、第三ssDNA与第四ssDNA通过碱基配对形成四面体结构的双链DNA，
(c)将蛋白X通过接头与第五ssDNA连接，以及
(d)将(c)获得的第五ssDNA与(b)获得的四面体结构的双链DNA接触，形成所述复合物，
其中：
所述第一ssDNA、第二ssDNA、第三ssDNA和第四ssDNA均包含3个亚序列，其中所述四个ssDNA中每一个ssDNA的所述3个亚序列分别与其余三个ssDNA的所述3个亚序列之一互补，
所述第五ssDNA包含序列B0，
所述第四ssDNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
由此第五ssDNA通过B0与B0’配对形成双链DNA而与所述四面体结构的双链DNA连接，形成所述复合物。
在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含通过接头与单链DNA连接的分子Y和通过接头与单链DNA连接的蛋白X，其中所述与分子Y连接的单链DNA和与蛋白X连接的单链DNA至少部分互补，从而能够通过碱基互补配对形成双链DNA而将蛋白X与分子Y连接在一起。
附图简述
图1为DNA-HRP-IgG复合物不同组装模式的示意图。
图2示出N3/DBCO连接组装的A/B链组装DNA-HRP-IgG复合物与商品化二抗比较结果。
图3示出N3/DBCO连接组装的四面体组装二抗复合物与商品化二抗比较结果。
图4示出SMCC连接组装的二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果。
图5示出四面体组装二抗复合物示意图。
具体实施方式
除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))和Singleton et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.，J.Wiley&Sons(NewYork，NY 1994)；Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY 1989)所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。
本文所用术语“多肽”，“肽”和“蛋白”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其包含经肽键结合的2个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的，分枝的或环状的，可包含天然存在的和/或氨基酸类似物，它可被非氨基酸间断。
在本文中，术语“核酸”，“DNA”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，是指脱氧核糖核酸，主链由脱氧核糖核苷酸(脱氧腺嘌呤核苷酸(A)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(G)、脱氧胞嘧啶核苷酸(C)、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T))通过3’，5’-磷酸二酯键连接形成的线形或环形多聚体，包含单链或双链，线性或圆形。此外，DNA可以包含本领域已知的合适修饰，例如甲基化、硫代和可被非核苷酸组分间断等。
本文中，一般性描述DNA序列时，除非特别限定或者根据上下文可以确定，否则提及核酸序列时不特别限定为5′至3′方向，例如提及DNA序列B0BsB1时，其可以是从5’至3’或从3’至5’方向；提及具体DNA序列(例如TGCACTCGCCAGCACTGTTCG，SEQ ID NO：1)时，从左至右通常为5′至3′方向，除非特别限定(例如3’-ATGC-5’)或者根据上下文可以另外确定。另外，提及DNA序列如B0BsB1时，B0、Bs和B1的相对排列顺序就是提及的相对顺序，即Bs位于B0和B1之间。
本发明基于DNA分子的Watson-Crick碱基配对原理(即A/T、G/C配对)，通过将蛋白X和分子Y分别与ssDNA分子连接，然后通过DNA碱基配对形成双链DNA而将蛋白X与分子Y连接，由于可以调整控制连接位置以及DNA互补配对数量，所以可以精确调控分子Y在DNA载体上的位置和数量。
如本文所用，“互补序列”是指与给定序列能够以相反方向(即5’-3’/3’-5’)以Watson-Crick碱基配对即A-T或G-C形式互补，从而形成双链DNA的序列，例如5’-ATGC-3’和5’-GCAT-3’彼此是互补序列。本文中所用的互补序列的长度可以为任何合适长度，优选为10-30个核苷酸，更优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个方面，本发明提供了一种复合物，其形式为：蛋白X-DNA-(分子Y)n，其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，其中蛋白X和分子Y分别通过接头与DNA连接，优选分子Y通过线性、四面体、六面体、八面体、十二面体或二十面体、更优选正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体或正二十面体结构的DNA与蛋白X连接。在一个实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一个实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，n为3、4、5或6。
本文所述复合物是指蛋白X和分子Y通过接头与DNA的共价键连接形成的分子。所述蛋白X可以与一或多条DNA序列连接，而一条DNA可与一或多个分子Y连接，由此一个蛋白X分子可与多个分子Y形成复合物。例如参见图1。
本文中，所述接头是指能够通过共价键将蛋白分子和DNA分子连接在一起的化学部分，包括例如但不限于聚合物、官能团等。本领域已知多种能够实现本发明目的的接头，例如分别与蛋白的氨基和/或DNA分子的氨基反应形成共价键，从而将蛋白和DNA分子连接在一起。在一个实施方案中，本文所述接头包括如下类型接头：N3/DBCO；SMCC；SPDP；TCO/四嗪(Tetrazine)和HyNic/4FB。所述接头常用于ADC药物中抗体与药物的偶联，具体可参见Beck A等，Strategies and challenges for the next generation of antibody-drugconjugates.Nat Rev Drug Discov.2017May；16(5):315-337。
本文所述“N3/DBCO”是指一对N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯修饰的接头，其中N3接头(如下式所示)是NHS酯修饰的可与蛋白上的NH2基团反应，DBCO(如下式所示)也是NHS酯修饰的可与ssDNA上修饰的NH2反应，而N3可与DBCO进行连接反应，由此将蛋白与ssDNA分子连接在一起。
本文所述“SMCC”为琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(如下式所示)，是SMCC是具有NHS酯和马来酰亚胺基团的异型双功能交联剂，可进行含胺和巯基分子的共价偶联。NHS酯在pH值7～9条件下与伯胺反应形成酰胺键，而马来酰亚胺在pH值6.5～7.5条件下与巯基发生反应，形成稳定的硫醚键。
本文所述“SPDP”为：3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(如下式所示)，是指一种通过胺-胺或胺-巯基交联进行蛋白偶联的多功能交联剂(含4-单元聚乙二醇(PEG)基团和一个可还原(可裂解)二硫键)。
本文所述“TCO/四嗪”，与“N3/DBCO”类似，是指一对NHS酯修饰的接头，其中NHS酯修饰的TCO接头为反式环辛烯(如下式所示)，可与蛋白的NH2连接，四嗪也是NHS酯修饰的(如下式所示)，可与NH2修饰的ssDNA连接，而TCO可与四嗪进行连接反应，由此将蛋白和ssDNA分子连接在一起。
本文所述“HyNic/4FB”，与“N3/DBCO”类似，是指一对NHS酯修饰的接头，其中HyNic接头是NHS酯修饰的琥珀酰亚胺基-6-肼基烟酰胺(如下式所示)，可与蛋白的NH2连接，4FB也是NHS酯修饰的4-甲酰苯甲酰胺(如下式所示)，可与NH2修饰的ssDNA连接，而HyNic可与4FB进行连接反应，由此将蛋白和ssDNA分子连接在一起。
本文中，蛋白可以通过接头与ssDNA的任意合适位点连接，例如在5’或3’端，或者在DNA分子中间位置，优选在DNA的5’或3’端连接。这些连接均在本领域技术人员的知识范围内。
本文中，线性结构的DNA是指在空间结构上为线性而没有形成具有立体结构例如多面体的DNA分子；四面体、六面体、八面体、十二面体或二十面体、正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体、正二十面体等多面体结构的DNA是指碱基配对后形成的双链DNA分子在空间上形成了相应多面体棱的DNA分子。
例如，本发明所述的通过线性DNA分子连接蛋白X和分子Y可以如下：蛋白X通过接头与第一ssDNA连接，其中第一ssDNA包含n个序列Ai(i＝1-n，即A1、A2…Ai…An)，分子Y通过接头与包含Ai’序列的第二ssDNA连接，其中Ai与Ai’为互补序列，其中n为大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多的整数。由此，通过Ai’/Ai互补序列配对形成双链DNA，将多个分子Y与一个蛋白X分子连接。特别地，A1、A2……An序列可以是相同或不全相同或全不相同的序列。优选A1、A2……An序列可以是相同的序列。在一个实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一个实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，n为3、4、5或6。
优选地，本文所述蛋白通过接头与ssDNA的5’或3’末端连接。更优选地，蛋白通过接头与所述DNA上的氨基(NH2)连接。
在一个实施方案中，本文所述接头与蛋白X和/或Y的氨基(NH2)或巯基(SH)连接。更优选地，接头与蛋白的末端氨基和/或赖氨酸侧链的氨基连接。
在另一个实施方案中，本发明所述的通过线性DNA分子连接蛋白X和分子Y可以如下：蛋白X通过接头与第一ssDNA连接，其中第一ssDNA包含序列A，分子Y通过接头分别与包含A’和B’序列的第二ssDNA和包含A和B序列的第三ssDNA连接，其中A与A’、B与B’为互补序列。由此，第一ssDNA通过A’、A互补序列与第二ssDNA连接，而该第二ssDNA通过B’、B互补序列与第三ssDNA连接，接着该第三ssDNA又可以通过A’、A互补序列与第二ssDNA连接，从而通过交替存在的第二和第三ssDNA，可以通过形成的线性DNA分子将所需数目的分子Y与一个蛋白X分子连接。
本文中，交替存在的A和B是指以(AB)n形式存在。由于DNA互补序列的性质，交替存在的具有互补序列的两条ssDNA不在双链DNA的同一条单链上，而是分别在两条链上。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其由式蛋白X-B0/(B0’Bx-分子Y)n表示，其中：B0表示ssDNA序列，B0’表示与B0至少部分序列互补的ssDNA序列，以及“/”表示B0和B0’通过互补碱基配对形成双链DNA，其中蛋白X通过接头与B0连接，分子Y通过接头与B0’Bx连接，其中Bx不存在或是任意核苷酸序列，n为大于等于2的整数，例如大于等于3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多。Bx为分子Y与B0’序列的间隔序列。在一个实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一个实施方案中，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，n为3、4、5或6。
在本文的实施方案中，蛋白与ssDNA连接时，在蛋白和ssDNA用于与其它ssDNA的互补序列配对的互补序列之间可以存在间隔序列，其作用是使蛋白距离形成的双链DNA一定距离，以不影响或最小化影响序列互补配对和/或蛋白的功能或活性。所述间隔序列的长度可以为任何合适长度，例如0-10个核苷酸，优选为2-5个核苷酸；另外，所述间隔序列的核苷酸可以选自例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)中的任何天然核苷酸或非天然核苷酸，例如为胸腺嘧啶(T)。在所述复合物中，所述间隔序列可以单链形式存在，也可以具有特定修饰，例如用于维持稳定性的修饰等。
本文所述“非天然核苷酸”是指除了所述腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)的天然核苷酸之外的核苷酸，其可以与天然核苷酸或与非天然核苷酸连接以形成单链或双链DNA样分子。特别地，本文所述“天然核苷酸”涵盖了未经修饰的和经修饰的天然核苷酸，如本领域已知的任何修饰，只要这种修饰不会使得其丧失配对能力。
另外，在ssDNA序列中的两个互补序列之间也可以存在间隔序列，可以选自例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)中的任何一或多个天然核苷酸或非天然核苷酸，其也可以具有特定修饰，例如用于维持稳定性的修饰等，以及可以为任何所需的合适长度，例如0-10个核苷酸，优选为2-5个核苷酸。
在一个实施方案中，Bx为TTT或TTTTT，最优选为TTT。
在一个实施方案中，B0或B0’的互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中分子Y通过接头分别与第一和第二ssDNA连接，蛋白X通过接头与第三ssDNA连接，所述第三ssDNA包含序列B0，所述第一ssDNA包含序列B0’和B1’，第二ssDNA包含序列B0和B1，其中：
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选地，B0和B0’、B1和B1’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
由此与第三ssDNA连接的蛋白X通过交替存在的与分子Y连接的第一和第二ssDNA而与多个分子Y连接形成所述复合物。
所述B0和B1的序列可以相同或不同。在一个实施方案中，所述B0和B1的序列是不同的。
优选地，
当蛋白X与第三ssDNA的5’端连接时，所述第一ssDNA以5’-3’方向包含序列B1’和B0’，第二ssDNA以5’-3’方向包含序列B1和B0，
当蛋白X与第三ssDNA的3’端连接时，所述第一ssDNA以5’-3’方向包含序列B0’和B1’，第二ssDNA以5’-3’方向包含序列B0和B1。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中复合物如下式(I)所示，
其中：
蛋白X与位于ssDNA序列B0的5’或3’端的序列Bx通过接头连接形成(B0)BxX，分子Y通过接头分别与位于ssDNA序列(B0’BsB1’)的5’或3’端的序列By和位于(B0BsB1)的5’或3’端的序列Bz连接形成(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，以及
Bx、By、Bz是位于蛋白与互补序列之间的间隔序列，可以为任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸。
由于交替存在的(B0’BsB1’)ByY和(B0BsB1)BzY通过B1和B1’以及B0和B1碱基配对形成双链DNA，一个蛋白X分子与所需的多个分子Y连接。在一个实施方案中，一个蛋白X分子与n个分子Y连接，其中n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。
优选地，Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT。
本文中，所述(B0)BxX、(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY以及式(I)中的括号“()”表示Bx位于B0的5’或3’端，Bz位于B0BsB1的5’或3’端，By位于B0’BsB1’的5’或3’端。
另外，序列B0、B0BsB1、B0’BsB1’从左至右的方向可以为5’-3’或3’-5’方向，这根据所需互补序列配对要求可以容易地确定。
在一个优选实施方案中，交替存在的(B0’BsB1’)ByY和(B0BsB1)BzY序列延伸的方向与Bx序列位于B0序列的5’或3’端相反。例如，如果Bx序列位于B0序列的5’，则交替存在的(B0’BsB1’)ByY和(B0BsB1)BzY序列向B0序列的3’方向延伸，而如果Bx序列位于B0序列的3’，则交替存在的(B0’BsB1’)ByY和(B0BsB1)BzY序列向B0序列的5’方向延伸。这样可以避免蛋白X的存在影响DNA双链形成和/或DNA双链影响蛋白X的功能活性。
在一个实施方案中，式(I)中的蛋白X与位于ssDNA序列B0的5’端的序列Bx通过接头连接形成XBxB0(5’-3’方向)，分子Y通过接头分别与位于ssDNA序列B1’BsB0’(5’-3’方向)的5’或3’端、优选5’端的序列By和位于B1BsB0(5’-3’方向)的5’或3’端、优选5’端的序列Bz连接形成(B1BsB0)BzY和(B1’BsB0’)ByY。
在一个实施方案中，式(I)中的蛋白X与位于ssDNA序列B0的3’端的序列Bx通过接头连接形成B0BxX(5’-3’方向)，分子Y通过接头分别与位于ssDNA序列B0’BsB1’(5’-3’方向)的5’或3’端、优选3’端的序列By和位于B0BsB1(5’-3’方向)的5’或3’端、优选3’端的序列Bz连接形成(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY。
本文所述Bx、By、Bz为位于蛋白与所述ssDNA的互补序列之间的间隔序列；Bs为各个互补序列之间的间隔序列，可以为DNA分子提供一定的柔性或者空间距离，以利于互补序列之间的碱基配对以形成双链DNA。由此可见，在本文所述的复合物中，连接蛋白X和分子Y的DNA分子中可以存在未配对的单链部分，并且所述DNA分子可以不是连续的，即存在缺口，例如式(I)中两条相邻的序列(B0’BsB1’)或两条相邻的序列(B0BsB1)的末端之间没有形成磷酸二酯键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中复合物构型如下式(II)所示，
其中：
蛋白X与位于ssDNA序列B0Bx(5’-3’方向)的3’端通过接头连接形成B0BxX，分子Y通过接头分别与ssDNA序列B0’B1’By(5’-3’方向)的3’端和B0B1Bz(5’-3’方向)的3’端连接形成B0B1BzY和B0’B1’ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸。
由于交替存在的B0B1Bz-Y和B0’B1’By-Y通过碱基配对形成双链DNA，一个蛋白X分子与多个分子Y连接。
优选地，
Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT，
B0的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCG(SEQ ID NO：1)，或者
B1的序列为AATACCTATGTGTGGGCCTTG(SEQ ID NO：2)。
更优选地，
B0Bx的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3)，B0’B1’By的序列为CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTTTTTT(SEQ ID NO：4)，或B0B1Bz的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTTTT(SEQ ID NO：5)。
对于多面体结构，可以相应设计ssDNA序列以是使形成的双链DNA分子在空间上形成所述多面体的棱。优选地，在形成多面体棱的双链DNA序列之间可以具有单链部分(例如1-2个选自腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)中的天然核苷酸或非天然核苷酸，优选选自腺苷酸(A))增加DNA分子的柔性以利于DNA分子折叠为所需多面体。
对于不同DNA折纸结构，比如由M13/模板链设计的DNA纳米结构可以使用开源caDNAno软件设计及通用程序退火，小纳米结构的DNA纳米结构可以根据序列互补配对直接设计进行退火，例如参见Paul W.K.Rothemund，Folding DNA to create nanoscaleshapes and patterns，Nature V440：297-302(16March 2006)；R.P.Goodman等，RapidChiral Assembly of Rigid DNA Building Blocks for Molecular Nanofabrication，Science，V310：1661-1664(9December 2005)。
例如，对于四面体，可以设计6条ssDNA序列，每条包含两个亚序列，这两个亚序列分别与另两条ssDNA的两个亚序列之一互补(例如6条序列分别包含A和B、B’和C’、C和D、D’和E’、E和F、F’和A’并适当选择序列的排列方向)，由此这6条ssDNA通过互补亚序列可以形成四面体结构；或者，可以设计4条ssDNA序列，每条包含3个亚序列，这3个亚序列分别与其余3条ssDNA的3个亚序列之一互补，由此这4条ssDNA通过互补亚序列可以形成四面体结构；或者，可以设计3条ssDNA，每条包含4个亚序列，这4个亚序列分别与其余两条ssDNA的4个亚序列中的2个互补(例如一条DNA序列包含亚序列A、B、C和D，则其余两条ssDNA序列分别包含其互补序列A’和B’及C’和D’)，由此这3条ssDNA通过互补亚序列可以形成四面体结构。例如参见图5。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中：
分子Y通过接头分别与第一、第二和第三ssDNA连接并与第四ssDNA通过碱基配对形成的双链DNA形成四面体结构，所述第一、第二、第三和第四ssDNA均包含3个亚序列，其中所述第一、第二、第三和第四ssDNA中每一个ssDNA的所述3个亚序列分别与其余三个ssDNA的所述3个亚序列之一互补，优选所述4个ssDNA的3个亚序列均不相同，
蛋白X与第五ssDNA通过接头连接，所述第五ssDNA包含序列B0，
所述第四ssDNA还包含与B0序列互补的亚序列B0’，
与蛋白X连接的第五ssDNA通过B0与B0’配对形成的双链DNA而与所述四面体结构的双链DNA连接，
优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
如本文所述，每一个ssDNA的所述3个亚序列分别与其余三个ssDNA的3个亚序列之一互补是指对于任意ssDNA，其包含3个亚序列ABC，其余3条ssDNA则分别包含其互补序列A’、B’和C’，即其余3条ssDNA分别包含A’--，B’--和C’--。
在一个实施方案中，在所述ssDNA的任两个互补序列之间存在由一或多个、优选1-2个、更优选1个核苷酸(例如腺苷酸)组成的间隔序列，其不与其它链上的核苷酸配对，从而产生单链部分，增加DNA分子柔性以利于DNA空间折叠。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中蛋白X与ssDNA序列BxB0的5’端通过接头连接形成X-BxB0，分子Y通过接头分别与ssDNA序列B5BsB2’BsB6的3’端、B5’BsB4BsB1’的5’端和B3’BsB4’BsB6’的5’端连接，形成B5BsB2’BsB6-Y(5’-3’方向)、Y-B5’BsB4BsB1’(5’-3’方向)和Y-B3’BsB4’BsB6’(5’-3’方向)，再与ssDNA序列B3BsB2BsB1-B0’通过碱基配对形成四面体构型，由此一个蛋白X分子通过碱基配对形成双链DNA与多个分子Y连接，其中：
Bx是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、B6和B6’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选B0、B1、B2、B3、B4、B5和B6中任一个的序列与其余序列均不相同，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，特别优选为一个核苷酸，例如腺苷酸(A)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种复合物，其中B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、或者B6和B6’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个优选实施方案中，本文所述ssDNA不能够自身形成双链，例如回文结构。如本文所用，回文序列或回文结构是指一段DNA序列，与其互补的序列在以相同方向(例如5’至3’方向)读取时具有相同的序列。例如，5’-ACCTAGGT-3’是回文序列或回文结构。优选地，本文所述ssDNA也不具有两段互补的能够自身形成双链的DNA序列，例如ssDNA具有序列A……B，其中A和B是互补序列，由此该ssDNA自身能够通过A和B互补配对形成双链。
在一个实施方案中，所述Bx的序列为ACGC，和/或B0的序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：6)，和/或B1的序列为AAGATCGCGACCAT(SEQ ID NO：7)，和/或B2的序列为CGAGAGCAAGTGTA(SEQ ID NO：8)，和/或B3的序列为ATGTGGCCAATCAA(SEQ ID NO：9)，和/或B4的序列为TGAGCCTGGACAGG(SEQ ID NO：10)，和/或B5的序列为TGGGATATCTACGG(SEQ IDNO：11)，和/或B6的序列为ACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：12)，和/或Bs的序列为一个“A”。
优选地，BxB0的序列为ACGCTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：13)，B5BsB2’BsB6的序列为TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGAACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：14)，B5’BsB4BsB1’的序列为CCGTAGATATCCCAATGAGCCTGGACAGGAATGGTCGCGATC TT(SEQ ID NO：15)，B3’BsB4’BsB6’的序列为TTGATTGGCCACATACCTGTCCAGGCTC AATAACCAGCTGAAGT(SEQ ID NO：16)，B3BsB2BsB1-B0’的序列为ATGTGGCCAATC AAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：17)。
本文中，所述蛋白X可以是任何希望与多个分子Y连接的蛋白，条件是其具有能够与合适接头连接的部分。
在一个实施方案中，本文所述蛋白X是靶向性蛋白，优选抗体或配体，其可以特异性靶向靶，从而定位或检测所述靶。
在一个实施方案中，靶向性蛋白是抗体或其抗原结合片段，例如Fab、Fab'、单链Fv(scFv)、Fv片段、抗体轻链、抗体重链、单域抗体及线性抗体。常见的靶向部分如Wu,A.M.andP.D.Senter.Nat Biotechnol 23(9):1137-1146(2005)中所述。在进一步的实施方案中，所述靶向性蛋白可以是一抗或二抗。在一个实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，例如羊抗鼠抗体。
本文中，所述分子Y是能够产生可检测信号的分子，例如具有酶、荧光、放射性等活性的分子，或者化学发光标记物质，如吖啶酯类、三联吡啶钌。根据本发明，可以定量地将多个分子Y与一个蛋白X分子连接，从而可控地放大检测信号。
在一个实施方案中，分子Y是酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)。
在一个方面，本发明提供了一种制备复合物：蛋白X-DNA-(分子Y)n的方法，包括：
-将蛋白X通过接头与单链DNA连接，
-将分子Y通过接头与单链DNA连接，其中与蛋白X连接的单链DNA和与分子Y连接的单链DNA至少部分互补，
-将蛋白X连接的单链DNA与分子Y连接的单链DNA退火，
其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。
在一个实施方案中，蛋白X与接头连接时的摩尔比为1:1至1:10，例如约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9，优选为1:2至1:6，更优选为约1:5。
在一个实施方案中，分子Y与接头连接时的摩尔比为1:1至1:10，例如约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9，优选为1:2至1:6，更优选为约1:5。
在一个实施方案中，蛋白X连接的ssDNA分子与每种分子Y连接的ssDNA退火比例为1:1至1:40，例如约1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30或1:35，优选为1:5至1:30，更优选为约1:20。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备复合物的方法，包括：
-将分子Y通过接头分别与第一和第二ssDNA连接，
-将蛋白X通过接头与第三ssDNA连接，
-将蛋白X连接的第三ssDNA与分子Y连接的第一ssDNA接触，
-加入、优选交替加入分子Y连接的第二ssDNA和分子Y连接的第一ssDNA，直至所需数目的分子Y与蛋白X分子连接，
其中：
所述第一ssDNA包含序列B0’和B1’，
所述第二ssDNA包含序列B0和B1，
所述第三ssDNA包含序列B0，
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选地，B0和B0’、B1和B1’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
由此与通过交替添加与分子Y连接的第一和第二ssDNA，一个蛋白X分子而与所需数目的分子Y连接形成所述复合物，
优选地，
当蛋白X与第三ssDNA的5’端连接时，所述第一ssDNA以5’-3’方向包含序列B1’和B0’，第二ssDNA以5’-3’方向包含序列B1和B0，
当蛋白X与第三ssDNA的3’端连接时，所述第一ssDNA以5’-3’方向包含序列B0’和B1’，第二ssDNA以5’-3’方向包含序列B0和B1。
在本文所述方法中，所述方法步骤不必需按照所述前后顺序进行，除非根据所述方案，本领域技术人员可以确定该顺序是需要的。例如，将分子Y与ssDNA连接和将蛋白X与ssDNA连接可以任意顺序进行，而将蛋白X连接的第三ssDNA与分子Y连接的第一ssDNA接触则需在上述连接步骤之后进行。
本文所述“交替加入”是指先加入第一种物质，待反应完成后，再加入另一种物质，反应后再加入第一种物质，如此重复。优选地，在两个加入步骤之间，可以分离获得的产物，并将未反应的残余物除去。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备式(I)所示复合物的方法，包括：
-将分子Y通过接头分别与位于第一ssDNA的5’或3’端的序列By和位于第二ssDNA的5’或3’端的序列Bz连接，将蛋白X通过接头与位于第三ssDNA的5’或3’端的序列Bx连接，所述第一ssDNA包含序列B0’BsB1’，第二ssDNA包含序列B0BsB1，所述第三ssDNA包含序列B0，
-将蛋白X连接的第三ssDNA与分子Y连接的第一ssDNA接触，
-加入、优选交替加入分子Y连接的第二ssDNA和分子Y连接的第一ssDNA，直至添加所需数目的分子Y，
其中：
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，以及
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，
由此通过添加与分子Y连接的第一和第二ssDNA，一个蛋白X分子而与多个分子Y连接形成所述复合物。
优选地，
当蛋白X与第三ssDNA的5’序列Bx的5’端连接时，所述第一ssDNA以5’-3’方向包含序列B1’BsB0’，第二ssDNA以5’-3’方向包含序列B1BsB0，或者
当蛋白X与第三ssDNA的3’序列Bx的3’端连接时，所述第一ssDNA以5’-3’方向包含序列B0’BsB1’，第二ssDNA以5’-3’方向包含序列B0BsB1。
在一个优选实施方案中，添加的(B0’BsB1’)ByY和(B0BsB1)BzY序列由于序列互补导致的序列延伸方向与Bx序列位于B0序列的5’或3’端相反，即如果Bx序列位于B0序列的5’端，则延伸方向为B0序列的3’方向，而如果Bx序列位于B0序列的3’端，则延伸方向为B0序列的5’方向。
在一个实施方案中，式(I)中的蛋白X与位于ssDNA序列B0的5’端的序列Bx通过接头连接形成XBxB0(5’-3’方向)，分子Y通过接头分别与位于ssDNA序列B1’BsB0’(5’-3’方向)的5’或3’端、优选5’端的序列By和位于B1BsB0(5’-3’方向)的5’或3’端、优选5’端的序列Bz连接形成(B1BsB0)BzY和(B1’BsB0’)ByY。
在一个实施方案中，式(I)中的蛋白X与位于ssDNA序列B0的3’端的序列Bx通过接头连接形成B0BxX(5’-3’方向)，分子Y通过接头分别与位于ssDNA序列B0’BsB1’(5’-3’方向)的5’或3’端、优选3’端的序列By和位于B0BsB1(5’-3’方向)的5’或3’端、优选3’端的序列Bz连接形成(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备式(II)所示复合物的方法，包括：
-将蛋白X通过接头与ssDNA序列B0Bx(5’-3’方向)的3’端连接形成B0Bx-X，
-将分子Y通过接头分别与ssDNA序列B0’B1’By(5’-3’方向)和B0B1Bz(5’-3’方向)的3’端连接形成B0B1Bz-Y和B0’B1’By-Y，
-将形成的B0Bx-X和B0’B1’By-Y接触，
-添加、优选交替添加B0B1Bz-Y和B0’B1’By-Y，直至所需数目的分子Y与蛋白X分子连接，
其中：
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
优选地，
Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT，
B0的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCG(SEQ ID NO：1)，或者
B1的序列为AATACCTATGTGTGGGCCTTG(SEQ ID NO：2)，
更优选地，
B0Bx的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3)，B0’B1’By的序列为CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTTTTTT(SEQ ID NO：4)，或B0B1Bz的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTTTT(SEQ ID NO：5)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备分子Y通过四面体结构的双链DNA分子与蛋白X连接形成的复合物的方法，包括：
(a)将分子Y通过接头分别与第一ssDNA、第二ssDNA和第三ssDNA连接；
(b)将(a)获得的第一ssDNA、第二ssDNA、第三ssDNA与第四ssDNA通过碱基配对形成四面体结构的双链DNA，
(c)将蛋白X通过接头与第五ssDNA连接，以及
(d)将(c)获得的第五ssDNA与(b)获得的四面体结构的双链DNA接触，形成所述复合物，
其中：
所述第一ssDNA、第二ssDNA、第三ssDNA和第四ssDNA均包含3个亚序列，其中所述四个ssDNA中每一个ssDNA的所述3个亚序列分别与其余三个ssDNA的所述3个亚序列之一互补，优选所述四个ssDNA的3个亚序列均不相同，
所述第五ssDNA包含序列B0，
所述第四ssDNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
由此第五ssDNA通过B0与B0’配对形成双链DNA而与所述四面体结构的双链DNA连接，形成所述复合物，
优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备复合物的方法，包括：
-将蛋白X通过接头与ssDNA序列BxB0(5’-3’方向)的5’端连接形成X-BxB0，
-将分子Y通过接头分别与ssDNA序列B5BsB2’BsB6(5’-3’方向)的3’端、B5’BsB4BsB1’(5’-3’方向)的5’端和B3’BsB4’BsB6’(5’-3’方向)的5’端连接，形成B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’和Y-B3’BsB4’BsB6’，
-将形成的X-BxB0、B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’、Y-B3’BsB4’BsB6’与ssDNA序列B3BsB2BsB1-B0’接触，通过碱基配对形成所述复合物，
其中：
Bx是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、B6和B6’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，
Bs为间隔序列，各个Bs序列可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，特别优选为一个核苷酸，例如腺苷酸(A)。
在一个实施方案中，所述B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、或者B6和B6’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
优选地，所述Bx的序列为ACGC，和/或B0的序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：6)，和/或B1的序列为AAGATCGCGACCAT(SEQ ID NO：7)，和/或B2的序列为CGAGA GCAAGTGTA(SEQ ID NO：8)，和/或B3的序列为ATGTGGCCAATCAA(SEQ ID NO：9)，和/或B4的序列为TGAGCCTGGACAGG(SEQ ID NO：10)，和/或B5的序列为TGGG ATATCTACGG(SEQ ID NO：11)，和/或B6的序列为ACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：12)，和/或Bs的序列为A，更优选地，BxB0的序列为ACGCTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：13)，B5BsB2’BsB6的序列为TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGAACTTCAG CTGGTTA(SEQ ID NO：14)，B5’BsB4BsB1’的序列为CCGTAGATATCCCAATGAGCCT GGACAGGAATGGTCGCGATCTT(SEQ ID NO：15)，B3’BsB4’BsB6’的序列为TTGATTG GCCACATACCTGTCCAGGCTCAATAACCAGCTGAAGT(SEQ ID NO：16)，B3BsB2Bs B1-B0’的序列为ATGTGGCCAATCAAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAA AAAAAAAAAAA(SEQID NO：17)。
在一个实施方案中，与分子Y连接的四条ssDNA分子的退火比例为约1:1:1，以形成四面体结构。
在一个实施方案中，蛋白X连接的ssDNA分子与四面体双链DNA的退火比例为1:1至1:40，例如约1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30或1:35，优选为1:5至1:30，更优选为约1:20。
在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含通过接头与单链DNA连接的分子Y和通过接头与单链DNA连接的蛋白X，其中所述与分子Y连接的单链DNA和与蛋白X连接的单链DNA至少部分互补，从而通过碱基互补配对形成双链DNA而将蛋白X与分子Y连接在一起。所述试剂盒还可以包含用于所述蛋白X和分子Y进行连接反应所需的其它试剂，例如缓冲液等。
优选地，通过所述形成的双链DNA将n个分子Y与一个蛋白X连接，其中n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。
本领域技术人员根据本发明将了解如何将蛋白X和分子Y通过所述互补单链DNA形成双链DNA而连接。例如，根据如上所述本发明制备复合物的方法，将试剂盒中通过接头与单链D NA连接的分子Y和通过接头与单链DNA连接的蛋白X退火，从而获得所需的复合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含通过接头与单链DNA序列B0连接的蛋白X，通过接头与单链DNA序列B0’Bx连接的分子Y，其中B0’与B0部分序列互补，由此B0和B0’通过互补碱基配对可以形成双链DNA，其中Bx不存在或是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，更优选为TTT或TTTTT，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含通过接头分别与第一和第二单链DNA连接的分子Y，通过接头与第三单链DNA连接的蛋白X，所述第三单链DNA包含序列B0，所述第一单链DNA包含序列B0’和B1’，第二单链DNA包含序列B0和B1，其中：
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选地，B0和B0’、B1和B1’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
由此与第三单链DNA连接的蛋白X通过交替存在的与分子Y连接的第一和第二单链DNA而与多个分子Y连接形成所述复合物，
优选地，
当蛋白X与第三单链DNA的5’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B1’和B0’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B1和B0，
当蛋白X与第三单链DNA的3’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B0’和B1’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B0和B1。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含蛋白X与位于单链DNA序列B0的5’或3’端的序列Bx通过接头连接形成的(B0)BxX，分子Y通过接头分别与位于单链DNA序列(B0’BsB1’)的5’或3’端的序列By和位于(B0BsB1)的5’或3’端的序列Bz连接形成的(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
优选地，Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含蛋白X与位于单链DNA序列B0Bx的3’端通过接头连接形成的B0BxX，分子Y通过接头分别与单链DNA序列B0’B1’By的3’端和B0B1Bz的3’端连接形成的B0B1BzY和B0’B1’ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，优选地，
Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT，B0的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCG(SEQ ID NO：1)，或者
B1的序列为AATACCTATGTGTGGGCCTTG(SEQ ID NO：2)，更优选地，
B0Bx的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3)，
B0’B1’By的序列为CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTT TTTT(SEQID NO：4)，或
B0B1Bz的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTT TT(SEQ IDNO：5)。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含通过接头分别与第一、第二和第三单链DNA连接的分子Y、第四单链DNA和与第五单链DNA通过接头连接的蛋白X，所述第一、第二、第三和第四单链DNA均包含3个亚序列，其中所述第一、第二、第三和第四单链DNA中每一个单链DNA的所述3个亚序列分别与其余三个单链DNA的所述3个亚序列之一互补，优选所述4个单链DNA的3个亚序列均不相同，其通过碱基配对形成的双链DNA形成四面体结构，
所述第五单链DNA包含序列B0，
所述第四单链DNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
与蛋白X连接的第五单链DNA通过B0与B0’配对形成的双链DNA可与所述四面体结构的双链DNA连接，
优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含蛋白X与单链DNA序列BxB0的5’端通过接头连接形成的X-BxB0，分子Y通过接头分别与单链DNA序列B5BsB2’BsB6的3’端、B5’BsB4BsB1’的5’端和B3’BsB4’BsB6’的5’端连接形成的B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’和Y-B3’BsB4’BsB6’，以及单链DNA序列B3BsB2BsB1-B0’，其中：
Bx是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、B6和B6’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选B0、B1、B2、B3、B4、B5和B6中任一个的序列与其余序列均不相同，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，特别优选为一个核苷酸，例如腺苷酸(A)。
在一个实施方案中，B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、或者B6和B6’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
在一个实施方案中，Bx的序列为ACGC，和/或B0的序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SE QID NO：6)，和/或B1的序列为AAGATCGCGACCAT(SEQ ID NO：7)，和/或B2的序列为CGAGAGCAAGTGTA(SEQ ID NO：8)，和/或B3的序列为ATGTGGCCAATCAA(S EQ ID NO：9)，和/或B4的序列为TGAGCCTGGACAGG(SEQ ID NO：10)，和/或B5的序列为TGGGATATCTACGG(SEQ IDNO：11)，和/或B6的序列为ACTTCAGCTGGTTA(S EQ ID NO：12)，和/或Bs的序列为A，优选地，BxB0的序列为ACGCTTTTTTTTTTTTTT T(SEQ ID NO：13)，B5BsB2’BsB6的序列为TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGA ACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：14)，B5’BsB4BsB1’的序列为CCGTAGATATCCCAATG AGCCTGGACAGGAATGGTCGCGATCTT(SEQ ID NO：15)，B3’BsB4’BsB6’的序列为TT GATTGGCCACATACCTGTCCAGGCTCAATAACCAGCTGAAGT(SEQ ID NO：16)，B3BsB2BsB1-B0’的序列为ATGTGGCCAATCAAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：17)。
在一个实施方案中，本文所述蛋白X是靶向性蛋白，优选抗体或配体，其可以特异性靶向靶，从而定位或检测所述靶。如本文所用，术语“靶向性蛋白”是本领域已知的或将来鉴别的能够特异性靶向(例如识别和/或结合)感兴趣靶的蛋白或片段，例如抗体、配体、肽适体、受体或其片段。所述感兴趣靶可以是待测的任何感兴趣生物分子，例如抗原、生物标记物、病原体等。
在一个实施方案中，靶向性蛋白是抗体或其抗原结合片段，例如Fab、Fab'、单链Fv(scFv)、Fv片段、抗体轻链、抗体重链、单域抗体及线性抗体。常见的靶向部分如Wu,A.M.andP.D.Senter.Nat Biotechnol 23(9)：1137-1146(2005)中所述。在进一步的实施方案中，所述靶向性蛋白可以是一抗或二抗。在一个实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，例如羊抗鼠抗体。
本文中，所述分子Y是能够产生可检测信号的分子，例如具有酶、荧光、放射性等活性的分子，或者化学发光标记物质，如吖啶酯类、三联吡啶钌。根据本发明，可以定量地将多个分子Y与一个蛋白X分子连接，从而可控地放大检测信号。
在一个实施方案中，分子Y是酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种DNA-HRP-IgG复合物及其制备方法。本发明提供的酶标二抗复合物，用多个HRP分子通过DNA介质对单个二抗进行标记，极大地提高了信号放大倍数，和免疫分析的灵敏度，同时通过不同组合方式，HRP在DNA载体上的位置和数量精确可控，排列紧凑，空间位阻小，二抗结合一抗灵活性高，对检测低丰度抗原的组织样品有特别优势。
本发明利用DNA的碱基配对原理，通过将HRP和二抗分别与ssDNA分子连接，然后通过DNA配对形成双链DNA而将HRP与二抗连接，由于可以调整控制DNA互补配对数量，所以可以精确调控HRP在DNA载体上的位置和数量。
在一个实施方案中，本发明提供了如下方法及由此制备的复合物：
-将二抗IgG和HRP蛋白分别与第一接头连接，将ssDNA(任选是经修饰的)与第二接头连接，然后将与第一接头连接的IgG和HRP分别和与第二接头连接的ssDNA连接，形成IgG-ssDNA和HRP-ssDNA，
-然后按照碱基互补配对原则，将IgG-ssDNA和HRP-ssDNA进行组装，得到IgG-DNA-HRP复合物，由此一个IgG分子可以连接多个HRP分子。
在一个实施方案中，本发明提供了2种组装方式：A/B链连接(线性)、四面体和其中用于将蛋白和ssDNA连接的接头为DBCO-N3(还可选自SMCC、SPDP、TCO/四嗪、HyNic/4FB)。
在一个实施方案中，上述IgG-DNA-HRP复合物可以如下制备：
步骤1：ssDNA连接DBCO接头：
于100μl反应体系中，分别加入DBCO接头20μL、ssDNA 25μL，PBS补足100μL，25℃震荡2h进行连接。乙醇沉淀法去除过量的DBCO接头：于上述反应体系中加入900μl预冷的无水乙醇、20μl 3M的乙酸钾(pH5.5)，混匀，-30℃放置30min，14000g，4℃离心30min，弃去上清，沉淀用100μl水重悬。重复上述操作一次，离心后使用预冷的95％乙醇进行洗涤，然后14000g4℃离心10min，将沉淀用10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0的TE Buffer中，-30℃保存备用。
步骤2：IgG/HRP连接N3接头：
IgG/HRP与N3接头以1：5的摩尔比在冰上反应2小时，反应完后加入等体积150mMpH＝8.0的Tris-HCl，冰上静置15min，终止反应，使用50k超滤管5500g x 5min，用PBS超滤6次，定量后，进行下一步反应。
步骤3：IgG/HRP-N3分别与ssDNA-DBCO的连接
IgG-N3与ssDNA-DBCO连接反应如下进行：IgG-N3与ssDNA-DBCO的摩尔比为1：20，反应体系在pH＝8.0、Tris-EDTA的缓冲液中进行，4℃静置过夜。
HRP-N3与ssDNA-DBCO连接反应如下进行：HRP-N3与ssDNA-DBCO的摩尔比为2：1，反应体系在pH＝8.0、Tris-EDTA的缓冲液中进行，4℃静置过夜。
步骤4：IgG-ssDNA与HRP-ssDNA的退火组装：
根据ssDNA序列的不同，设置不同的退火程序，从而进行不同形式的组装，组装模式分别为A/B链连接组装、四面体组装。
如本文所用，“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生及不发生的情况。例如，任选包括的步骤是指该步骤存在或不存在。
实施例
为了更好地说明本发明的目的、技术路线和效果，下面结合实施例对本发明作进一步解释。应当说明的是，以下实施例仅用以解释本发明，不能用来限制本发明的保护范围，所有与本发明相同或相近的技术方案，以及将本发明中的技术参数通过变换得到的方案，均属于本发明的保护范围。
实施例1：一种A/B链状DNA-HRP-IgG复合物的制备及检测
步骤1：ssDNA(A链、B链、标记链)连接NHS-PEG4-DBCO接头(二苯基环辛炔PEG活性酯，如下式所示；购自西安康福诺生物科技有限公司，CAS号为1427004-19-0，规格为50mg/瓶)
于100μl反应体系中，分别加入DBCO接头20μL、ssDNA(A链：CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTTTTTT(SEQ ID NO：4)；B链：TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTTTT(SEQ ID NO：5)；标记链：TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3))25μL，PBS补足100μL，25℃震荡2h进行连接。乙醇沉淀法去除过量的DBCO接头：于上述反应体系中加入900μl预冷的无水乙醇、20μl 3M的乙酸钾(pH5.5)，混匀，-30℃放置30min，14000g，4℃离心30min，弃去上清，沉淀用100μl水重悬。重复上述操作一次，离心后使用预冷的95％乙醇进行洗涤，然后14000g、4℃离心10min，将沉淀用10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0的TE Buffer中，-30℃保存备用。
步骤2：IgG/HRP连接N3-NHS-PEG接头(NHS-PEG4-N3，如下式所示；购自上海麦克林生化科技有限公司，CAS号为A862592-25mg)的反应
IgG(购自购自北京博奥森生物技术有限公司，货号为bs-0296G)/HRP(购自北京索莱宝科技有限公司，货号为P8020-100mg)与N3接头以1：5的摩尔比在冰上反应2小时，反应完后加入等体积150mM pH＝8.0的Tris-HCl，冰上静置15min，终止反应，使用50k超滤管5500g x5min，用PBS超滤6次，定量后，进行下一步反应。
步骤3：IgG/HRP-N3分别与A链-DBCO、B链-DBCO、标记链-DBCO的连接
将IgG-N3与标记链-DBCO连接：连接反应条件如下：IgG-N3与标记链-DBCO的摩尔比为1:20，反应体系在pH＝8.0、Tris-EDTA的缓冲液中进行，4℃静置过夜，得到IgG-N3-DBCO-标记链连接产物。
HRP-N3与A链-DBCO、B链-DBCO分别进行连接：连接反应条件如下：HRP-N3与A链-DBCO、B链-DBCO的摩尔比均为2:1，反应体系在pH＝8.0、Tris-EDTA的缓冲液中进行，4℃静置过夜，得到HRP-N3-DBCO-A链、HRP-N3-DBCO-B链连接产物。
步骤4：IgG-N3-DBCO-标记链与HRP-N3-DBCO-A链、HRP-N3-DBCO-B链的退火组装
IgG-N3-DBCO-标记链与HRP-N3-DBCO-A链和HRP-N3-DBCO-B链的退火比例为1:20:20。按照以下退火程序进行退火：IgG-N3-DBCO-标记链与HRP-N3-DBCO-A链首先进行退火，65℃退火10min，然后冰上放置30min。然后向上一步反应体系中继续添加HRP-N3-DBCO-B链，25℃放置2h/过夜，或者35℃退火至4℃，1℃/1min，4℃放置30min。
步骤5：A/B链组装二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测
按照以上步骤分别制备3批次的A/B链二抗复合物(A/B链-1、A/B链-2、A/B链-3)与商品化的二抗(购自购自Proteintech；货号SA00001-1)稀释至同一浓度梯度后进行ELISA检测，对检测结果进行分析。A/B链二抗复合物样品与商品化二抗稀释后浓度分别为：2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml，每个样品做3个平行进行检测。检测结果见表1。
实施例2：一种四面体组装模式的DNA-HRP-IgG复合物的制备及检测
步骤1：ssDNA(S1-polyA、S2、S3、S4、polyT)连接DBCO接头(见实施例1)
于100μl反应体系中，分别加入DBCO接头20μL、ssDNA(S1-polyA：ATGTGGCCAATCAAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：17)；S2：TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGAACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：14)；S3：CCGTAGATATCCCAATGAGCCTGGACAGGAATGGTCGCGATCTT(SEQ ID NO：15)；S4：TTGATTGGCCACATACCTGTCCAGGCTCAATAACCAGCTGAAGT(SEQ ID NO：16)；polyT：ACGCTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：13))25μL，PBS补足100μL，25℃震荡2h进行连接。乙醇沉淀法去除过量的DBCO接头：于上述反应体系中加入900μl预冷的无水乙醇、20μl 3M的乙酸钾(pH5.5)，混匀，-30℃放置30min，14000g，4℃离心30min，弃去上清，沉淀用100μl水重悬。重复上述操作一次，离心后使用预冷的95％乙醇进行洗涤，然后14000g 4℃离心10min，将沉淀用10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0的TE Buffer中，-30℃保存备用。
步骤2：IgG/HRP连接N3接头的反应
IgG(同实施例1)/HRP(同实施例1)与N3接头(见实施例1)以1：5的摩尔比在冰上反应2小时，反应完后加入等体积150mM pH＝8.0的Tris-HCl，冰上静置15min，终止反应，使用50k超滤管5500g x 5min，用PBS超滤6次，定量后，进行下一步反应。
步骤3：IgG/HRP-N3分别与ssDNA-DBCO进行连接
将IgG-N3与polyT-DBCO进行连接：连接反应条件如下：IgG-N3与polyT-DBCO的摩尔比为1:20，反应体系在pH＝8.0、Tris-EDTA的缓冲液中进行，4℃静置过夜，得到IgG-N3-DBCO-polyT连接产物。
HRP-N3与S1-polyA-DBCO、S2-DBCO、S3-DBCO、S4-DBCO分别进行连接：连接反应条件如下：HRP-N3与标记链-DBCO的摩尔比为2:1，反应体系在pH＝8.0、Tris-EDTA的缓冲液中进行，4℃静置过夜。分别得到HRP-N3-DBCO-S1-polyA、HRP-N3-DBCO-S2、HRP-N3-DBCO-S3、HRP-N3-DBCO-S4连接产物。
步骤4：四面体与IgG-N3-DBCO-polyT退火组装
将四条链HRP-N3-DBCO-S1-polyA、HRP-N3-DBCO-S2、HRP-N3-DBCO-S3、HRP-N3-DBCO-S4以摩尔比1:1:1:1于PBS中95℃反应10min，然后冰浴30min完成四面体的组装。然后将IgG-N3-DBCO-polyT与上述组装完成的四面体以摩尔比1:5，25℃过夜连接。
步骤5：四面体组装二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测
按照以上步骤分别制备3批次的四面体二抗复合物与商品化的二抗(同实施例1)稀释至同一浓度梯度后进行ELISA检测，对检测结果进行分析。样品与商品化二抗稀释后浓度分别为：2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml。每个样品做3个平行进行检测。
实施例3：A/B链组装二抗复合物及四面体二抗复合物的ELISA非特异性检测
对实施例1制备的3批次的A/B链组装二抗复合物及四面体二抗复合物进行ELISA非特异性检测，在检测过程中只包被抗原，不加一抗，使用稀释液代替，检测样品对抗原的非特异性。具体操作步骤如下：
1)包被：用包被液稀释凝血酶抗原为10μg/ml，每孔加100μl，4℃过夜。
2)洗板：拍掉包被液，洗液洗板4次，每孔加200μl，每次4分钟。
3)封闭：拍掉洗液，每孔加入100μl封闭液，37℃孵育2小时或4℃过夜。
4)洗板：拍掉封闭液，洗液洗板4次，每孔加200μl，每次4分钟。
5)加一抗(购自abcam，货号为ab17199)：此步将一抗替换为稀释液，然后每孔均加100μl，37℃孵育2小时。
6)洗板：拍掉一抗，洗液洗板4次，每孔加200μl，每次4分钟。
7)加酶标二抗：将制备二抗复合物与商品化二抗(购自Proteintech；货号SA00001-1)分别稀释后至：2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml。每个样品3个平行，最后一个孔加稀释液作为空白对照。
8)洗板：拍掉二抗，洗液洗板4次，每孔加200μl，每次4分钟。
9)显色：显色液A液和B液1：1混合，现用现配。每孔加入100μl显色液。避光显色10分钟左右。
10)终止：每孔加入50μl终止液终止反应。
11)读数：将酶联免疫板放入酶标仪，450nm下测吸光值。
ELISA实验检测结果见下表1-表8以及图2、图3：
表1：A/B链组装DNA-HRP-IgG复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果：
表2：A/B链组装DNA-HRP-IgG复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果：
表3：A/B链组装二抗复合物ELISA非特异性检测结果
表4：A/B链组装二抗复合物ELISA非特异性检测结果
通过ELISA结果可以看出，我们的A/B链组装DNA-HRP-IgG复合物3组样品各个稀释度的OD值均大于商品化二抗，并且在低浓度下有更大的优势，最高可以为商品化二抗的6～8倍，这样我们在样品检测时候，只需要极少的量即可达到较高的灵敏度。
表5：四面体组装二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果
表6：四面体组装二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果
与A/B链组装DNA-HRP-IgG二抗复合物的ELISA检测结果相似，四面体组装二抗复合物DNA-HRP-IgG复合物3组样品各个稀释度的OD值均大于商品化二抗，同样在在低浓度下有更大的优势，最高可以为商品化二抗的6～8倍，这样我们在样品检测时候，只需要极少的二抗使用量即可达到较高的灵敏度。
表7：四面体组装二抗复合物ELISA非特异性检测结果
表8：四面体组装二抗复合物ELISA非特异性检测结果
注：为了考察制备的抗体复合物的非特异性，在ELISA检测过程中，将特异性的一抗换成稀释液代替来进行ELISA检测，考察样品对抗原的非特异性。将制备的两种不同抗体复合物各个浓度梯度的检测OD值与空白值进行T检验，各个浓度点P值均大于0.05，即各浓度点与空白值均无显著性差异，表明样品在2.0～0.03125μg/ml的浓度范围内与抗原无非特异性吸附。
实施例4：以sulfo-SMCC为接头的IgG-DNA-HRP的A/B模式组装
步骤1：使用sulfo-SMCC作为双功能交联剂制备IgG-SMCC-DNA标记链偶联物。
首先，将200μl 3μM IgG与9μl 15mM sulfo-SMCC在室温下混合放置1h。然后将过量的sulfo-SMCC通过0.5ml 30kD离心管离心洗涤三次除去。末端巯基修饰的Poly-T的DNA标记链用TCEP(20mM，200倍过量)还原6h，过量TCEP用100kd超滤离心去除。
步骤2：使用sulfo-SMCC作为双功能交联剂制备HRP-SMCC-A/B链偶联物
将200μl 3μM HRP与9μl 15mM sulfo-SMCC在室温下混合放置1h。然后将过量的sulfo-SMCC通过0.5ml 15kD离心管离心洗涤三次除去。末端巯基修饰的Poly-T的A链和B链用TCEP(20mM，200倍过量)还原6h，过量TCEP用15kd超滤离心管离心洗涤6次去除。
步骤3：IgG-SMCC-DNA标记链与HRP-SMCC-A/B链的退火组装
IgG-SMCC-DNA标记链与HRP-SMCC-A链和HRP-SMCC-B链的退火摩尔比例为1:20:20。按照以下退火程序进行退火：IgG-SMCC-标记链与HRP-SMCC-A链首先进行退火，65℃退火10min，然后冰上放置30min。然后向上一步反应体系中继续添加HRP-SMCC-B链，25℃放置2h/过夜，或者35℃退火至4℃，1℃/1min，4℃放置30min。
步骤4：SMCC连接组装二抗复合物ELISA检测结果
按照以上步骤分别制备3批次的SMCC连接组装的二抗复合物与商品化的二抗稀释至同一浓度梯度后进行ELISA检测，对检测结果进行分析。样品与商品化二抗稀释后浓度分别为：2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml。每个样品做3个平行进行检测。检测结果见下表9-10和图4。
表9：SMCC连接组装的二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果
表10：SMCC连接组装的二抗复合物与商品化二抗比较ELISA检测结果
以SMCC为接头组装的A/B二抗复合物ELISA检测结果与DBCO/N3接头的结果基本一致，相对商品化二抗，同等浓度的OD值均能达到显著的提升，提升约为6倍左右。
本发明虽然通过上述实施例来描述说明，但是本发明的保护范围并不局限于上述实施例。本技术领域的人员应该理解，基于本发明的基本创造性概念，对本发明的任何变更和修改，等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (34)
1.一种复合物，其形式为：蛋白X-DNA-(分子Y)n，其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6，其中蛋白X和分子Y分别通过接头与DNA连接，优选分子Y通过线性、四面体、六面体、八面体、十二面体或二十面体、更优选正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体或正二十面体结构的DNA与蛋白X连接。
2.权利要求1的复合物，其由式蛋白X-B0/(B0’Bx-分子Y)n表示，其中：B0表示单链DNA序列，B0’表示与B0部分序列互补的单链DNA序列，以及“/”表示B0和B0’通过互补碱基配对形成双链DNA，其中蛋白X通过接头与B0连接，分子Y通过接头与B0’Bx连接，其中Bx不存在或是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，更优选为TTT或TTTTT，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
3.权利要求1的复合物，其中分子Y通过接头分别与第一和第二单链DNA连接，蛋白X通过接头与第三单链DNA连接，所述第三单链DNA包含序列B0，所述第一单链DNA包含序列B0’和B1’，第二单链DNA包含序列B0和B1，其中：
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选地，B0和B0’、B1和B1’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
由此与第三单链DNA连接的蛋白X通过交替存在的与分子Y连接的第一和第二单链DNA而与多个分子Y连接形成所述复合物，
优选地，
当蛋白X与第三单链DNA的5’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B1’和B0’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B1和B0，
当蛋白X与第三单链DNA的3’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B0’和B1’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B0和B1。
4.权利要求3的复合物，其中复合物如下式(I)所示，
其中：
蛋白X与位于单链DNA序列B0的5’或3’端的序列Bx通过接头连接形成(B0)BxX，分子Y通过接头分别与位于单链DNA序列(B0’BsB1’)的5’或3’端的序列By和位于(B0BsB1)的5’或3’端的序列Bz连接形成(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
由于交替存在的(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY通过碱基配对形成双链DNA，一个蛋白X分子与多个分子Y连接，
优选地，Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT。
5.权利要求3或4的复合物，其中复合物构型如下式(II)所示，
其中：
蛋白X与位于单链DNA序列B0Bx的3’端通过接头连接形成B0BxX，分子Y通过接头分别与单链DNA序列B0’B1’By的3’端和B0B1Bz的3’端连接形成B0B1BzY和B0’B1’ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
由于交替存在的B0B1Bz-Y和B0’B1’By-Y通过碱基配对形成双链DNA，一个蛋白X分子与多个分子Y连接，
优选地，
Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT，
B0的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCG(SEQ ID NO：1)，或者
B1的序列为AATACCTATGTGTGGGCCTTG(SEQ ID NO：2)，
更优选地，
B0Bx的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3)，
B0’B1’By的序列为CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTTTTTT(SEQ IDNO：4)，或
B0B1Bz的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTTTT(SEQ ID NO：5)。
6.权利要求1的复合物，其中：
分子Y通过接头分别与第一、第二和第三单链DNA连接并与第四单链DNA通过碱基配对形成的双链DNA形成四面体结构，所述第一、第二、第三和第四单链DNA均包含3个亚序列，其中所述第一、第二、第三和第四单链DNA中每一个单链DNA的所述3个亚序列分别与其余三个单链DNA的所述3个亚序列之一互补，优选所述4个单链DNA的3个亚序列均不相同，
蛋白X与第五单链DNA通过接头连接，所述第五单链DNA包含序列B0，
所述第四单链DNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
与蛋白X连接的第五单链DNA通过B0与B0’配对形成的双链DNA而与所述四面体结构的双链DNA连接
优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
7.权利要求6的复合物，其中蛋白X与单链DNA序列BxB0的5’端通过接头连接形成X-BxB0，分子Y通过接头分别与单链DNA序列B5BsB2’BsB6的3’端、B5’BsB4BsB1’的5’端和B3’BsB4’BsB6’的5’端连接，形成B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’和Y-B3’BsB4’BsB6’，再与单链DNA序列B3BsB2BsB1-B0’通过碱基配对形成四面体构型，由此一个蛋白X分子通过碱基配对形成双链DNA与多个分子Y连接，其中：
Bx是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、B6和B6’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选B0、B1、B2、B3、B4、B5和B6中任一个的序列与其余序列均不相同，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，特别优选为一个核苷酸，例如腺苷酸(A)。
8.权利要求1-7任一项的复合物，其中B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、或者B6和B6’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
9.权利要求6-8任一项的复合物，其中：
Bx的序列为ACGC，和/或
B0的序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：6)，和/或
B1的序列为AAGATCGCGACCAT(SEQ ID NO：7)，和/或
B2的序列为CGAGAGCAAGTGTA(SEQ ID NO：8)，和/或
B3的序列为ATGTGGCCAATCAA(SEQ ID NO：9)，和/或
B4的序列为TGAGCCTGGACAGG(SEQ ID NO：10)，和/或
B5的序列为TGGGATATCTACGG(SEQ ID NO：11)，和/或
B6的序列为ACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：12)，和/或
Bs的序列为A，
优选地，
BxB0的序列为ACGCTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：13)，
B5BsB2’BsB6的序列为TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGAACTTCAGCTGGTTA(SEQ IDNO：14)，
B5’BsB4BsB1’的序列为CCGTAGATATCCCAATGAGCCTGGACAGGAATGGTCGCGATCTT(SEQ IDNO：15)，
B3’BsB4’BsB6’的序列为TTGATTGGCCACATACCTGTCCAGGCTCAATAACCAGCTGAAGT(SEQ IDNO：16)，
B3BsB2BsB1-B0’的序列为ATGTGGCCAATCAAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：17)。
10.权利要求1-9任一项的复合物，其中接头选自如下类型接头：
N3/DBCO；
SMCC；
SPDP；
TCO/四嗪，和
HyNic/4FB。
11.权利要求1-10任一项的复合物，其中分子Y是可产生可检测信号的分子，例如酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)，或者化学发光标记物质，如吖啶酯类、三联吡啶钌。
12.权利要求1-11任一项的复合物，其中蛋白X是靶向性蛋白，优选抗体或配体。
13.一种制备复合物：蛋白X-DNA-(分子Y)n的方法，包括：
-将蛋白X通过接头与单链DNA连接，
-将分子Y通过接头与单链DNA连接，其中与蛋白X连接的单链DNA和与分子Y连接的单链DNA至少部分互补，
-将蛋白X连接的单链DNA与分子Y连接的单链DNA退火，形成所述复合物
其中n表示大于1的整数，优选地，n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。
14.权利要求13的方法，其用于制备权利要求3所述的复合物，包括：
-将分子Y通过接头分别与第一和第二单链DNA连接，
-将蛋白X通过接头与第三单链DNA连接，
-将蛋白X连接的第三单链DNA与分子Y连接的第一单链DNA接触，
-加入、优选交替加入分子Y连接的第二单链DNA和分子Y连接的第一单链DNA，直至所需数目的分子Y与蛋白X分子连接，
其中：
所述第一单链DNA包含序列B0’和B1’，
所述第二单链DNA包含序列B0和B1，
所述第三单链DNA包含序列B0，
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选地，B0和B0’、B1和B1’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
由此通过添加与分子Y连接的第一和第二单链DNA，一个蛋白X分子与所需数目的多个分子Y连接形成所述复合物，
优选地，
当蛋白X与第三单链DNA的5’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B1’和B0’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B1和B0，
当蛋白X与第三单链DNA的3’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B0’和B1’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B0和B1。
15.权利要求13或14的方法，其中所述复合物如式(I)所示，所述方法包括：
-将分子Y通过接头分别与第一单链DNA和第二单链DNA连接，将蛋白X通过接头与第三单链DNA连接，所述第一单链DNA包含序列B0’BsB1’，第二单链DNA包含序列B0BsB1，所述第三单链DNA包含序列B0，
-将蛋白X连接的第三单链DNA与分子Y连接的第一单链DNA接触，
-加入、优选交替加入分子Y连接的第二单链DNA和分子Y连接的第一单链DNA，直至添加所需数目的分子Y，
其中：
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，以及
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，
由此通过添加与分子Y连接的第一和第二单链DNA，一个蛋白X分子与所需数目的多个分子Y连接形成所述复合物，
优选地，
当蛋白X与第三单链DNA的5’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B1’BsB0’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B1BsB0，
当蛋白X与第三单链DNA的3’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B0’BsB1’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B0BsB1。
16.权利要求13-15任一项的方法，其中所述复合物如式(II)所示，所述方法包括：
-将蛋白X通过接头与单链DNA序列B0Bx的3’端连接形成B0Bx-X，
-将分子Y通过接头分别与单链DNA序列B0’B1’By和B0B1Bz的3’端连接形成B0B1Bz-Y和B0’B1’By-Y，
-将形成的B0Bx-X和B0’B1’By-Y接触，
-添加、优选交替添加B0B1Bz-Y和B0’B1’By-Y，直至所需数目的分子Y与蛋白X分子连接，
其中：
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
优选地，
Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT，
B0的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCG(SEQ ID NO：1)，或者
B1的序列为AATACCTATGTGTGGGCCTTG(SEQ ID NO：2)，
更优选地，
B0Bx的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3)，
B0’B1’By的序列为CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTTTTTT(SEQ IDNO：4)，或
B0B1Bz的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTTTT(SEQ ID NO：5)。
17.权利要求13的方法，其用于制备分子Y通过四面体结构的双链DNA分子与蛋白X连接形成的所述复合物，包括：
(a)将分子Y通过接头分别与第一单链DNA、第二单链DNA和第三单链DNA连接；
(b)将(a)获得的第一单链DNA、第二单链DNA、第三单链DNA与第四单链DNA通过碱基配对形成四面体结构的双链DNA，
(c)将蛋白X通过接头与第五单链DNA连接，以及
(d)将(c)获得的第五单链DNA与(b)获得的四面体结构的双链DNA接触，形成所述复合物，
其中：
所述第一单链DNA、第二单链DNA、第三单链DNA和第四单链DNA均包含3个亚序列，其中所述四个单链DNA中每一个单链DNA的所述3个亚序列分别与其余三个单链DNA的所述3个亚序列之一互补，优选所述四个单链DNA的3个亚序列均不相同，
所述第五单链DNA包含序列B0，
所述第四单链DNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
由此第五单链DNA通过B0与B0’配对形成双链DNA而与所述四面体结构的双链DNA连接，形成所述复合物，
优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
18.权利要求17的方法，包括：
-将蛋白X通过接头与单链DNA序列BxB0的5’端连接形成X-BxB0，
-将分子Y通过接头分别与单链DNA序列B5BsB2’BsB6的3’端、B5’BsB4BsB1’的5’端和B3’BsB4’BsB6’的5’端连接，形成B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’和Y-B3’BsB4’BsB6’，
-将形成的X-BxB0、B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’、Y-B3’BsB4’BsB6’与单链DNA序列B3BsB2BsB1-B0’接触，通过碱基配对形成所述复合物，
其中：
Bx是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、B6和B6’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，
Bs为间隔序列，各个Bs序列可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，特别优选为一个核苷酸，例如腺苷酸(A)。
19.权利要求17或18的方法，其中：
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、或者B6和B6’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
更优选地，
Bx的序列为ACGC，和/或
B0的序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：6)，和/或
B1的序列为AAGATCGCGACCAT(SEQ ID NO：7)，和/或
B2的序列为CGAGAGCAAGTGTA(SEQ ID NO：8)，和/或
B3的序列为ATGTGGCCAATCAA(SEQ ID NO：9)，和/或
B4的序列为TGAGCCTGGACAGG(SEQ ID NO：10)，和/或
B5的序列为TGGGATATCTACGG(SEQ ID NO：11)，和/或
B6的序列为ACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：12)，和/或
Bs的序列为A，
更优选地，
BxB0的序列为ACGCTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：13)，
B5BsB2’BsB6的序列为TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGAACTTCAGCTGGTTA(SEQ IDNO：14)，
B5’BsB4BsB1’的序列为CCGTAGATATCCCAATGAGCCTGGACAGGAATGGTCGCGATCTT(SEQ IDNO：15)，
B3’BsB4’BsB6’的序列为TTGATTGGCCACATACCTGTCCAGGCTCAATAACCAGCTGAAGT(SEQ IDNO：16)，
B3BsB2BsB1-B0’的序列为ATGTGGCCAATCAAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：17)。
20.权利要求13-19任一项的方法，其中接头选自如下类型接头：
N3/DBCO；
SMCC；
SPDP；
TCO/四嗪，和
HyNic/4FB。
21.权利要求13-20任一项的方法，其中分子Y是可产生可检测信号的分子，例如酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)，或者化学发光标记物质，如吖啶酯类、三联吡啶钌。
22.权利要求13-21任一项的方法，其中蛋白X是靶向性蛋白，优选抗体或配体。
23.一种试剂盒，其包含通过接头与单链DNA连接的分子Y和通过接头与单链DNA连接的蛋白X，其中所述与分子Y连接的单链DNA和与蛋白X连接的单链DNA至少部分互补，从而能够通过碱基互补配对形成双链DNA而将蛋白X与分子Y连接在一起，
优选地，通过所述双链DNA将n个Y分子与一个蛋白X连接，其中n大于等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地，n为3、4、5或6。
24.权利要求23的试剂盒，其包含通过接头与单链DNA序列B0连接的蛋白X，通过接头与单链DNA序列B0’Bx连接的分子Y，其中B0’与B0部分序列互补，由此B0和B0’通过互补碱基配对可以形成双链DNA，其中Bx不存在或是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，更优选为TTT或TTTTT，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
25.权利要求23或24的试剂盒，其包含通过接头分别与第一和第二单链DNA连接的分子Y，通过接头与第三单链DNA连接的蛋白X，所述第三单链DNA包含序列B0，所述第一单链DNA包含序列B0’和B1’，第二单链DNA包含序列B0和B1，其中：
B0和B0’、B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选地，B0和B0’、B1和B1’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
由此与第三单链DNA连接的蛋白X通过交替存在的与分子Y连接的第一和第二单链DNA而与多个分子Y连接形成所述复合物，
优选地，
当蛋白X与第三单链DNA的5’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B1’和B0’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B1和B0，
当蛋白X与第三单链DNA的3’端连接时，所述第一单链DNA以5’-3’方向包含序列B0’和B1’，第二单链DNA以5’-3’方向包含序列B0和B1。
26.权利要求23-25任一项的试剂盒，其包含蛋白X与位于单链DNA序列B0的5’或3’端的序列Bx通过接头连接形成的(B0)BxX，分子Y通过接头分别与位于单链DNA序列(B0’BsB1’)的5’或3’端的序列By和位于(B0BsB1)的5’或3’端的序列Bz连接形成的(B0BsB1)BzY和(B0’BsB1’)ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
优选地，Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT。
27.权利要求23-26任一项的试剂盒，其包含蛋白X与位于单链DNA序列B0Bx的3’端通过接头连接形成的B0BxX，分子Y通过接头分别与单链DNA序列B0’B1’By的3’端和B0B1Bz的3’端连接形成的B0B1BzY和B0’B1’ByY，
B0和B0’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，
B1和B1’至少部分、优选完全序列互补以形成双链DNA，其中B0和B1序列可以相同或不同，以及
Bx、By、Bz是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
优选地，
Bx、By、Bz的序列独立地为TTT或TTTTT，更优选地，Bx为TTT，By或Bz为TTTTT，
B0的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCG(SEQ ID NO：1)，或者
B1的序列为AATACCTATGTGTGGGCCTTG(SEQ ID NO：2)，
更优选地，
B0Bx的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGTTT(SEQ ID NO：3)，
B0’B1’By的序列为CGAACAGTGCTGGCGAGTGCACAAGGCCCACACATAGGTATTTTTTT(SEQ IDNO：4)，或
B0B1Bz的序列为TGCACTCGCCAGCACTGTTCGAATACCTATGTGTGGGCCTTGTTTTT(SEQ ID NO：5)。
28.权利要求23的试剂盒，其包含通过接头分别与第一、第二、第三单链DNA连接的分子Y、第四单链DNA和与第五单链DNA通过接头连接的蛋白X，所述第一、第二、第三和第四单链DNA均包含3个亚序列，其中所述第一、第二、第三和第四单链DNA中每一个单链DNA的所述3个亚序列分别与其余三个单链DNA的所述3个亚序列之一互补，优选所述4个单链DNA的3个亚序列均不相同，其通过碱基配对形成的双链DNA形成四面体结构，
所述第五单链DNA包含序列B0，
所述第四单链DNA还包含与B0序列互补的序列B0’，
与蛋白X连接的第五单链DNA通过B0与B0’配对形成的双链DNA可与所述四面体结构的双链DNA连接，
优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
29.权利要求28的试剂盒，其包含蛋白X与单链DNA序列BxB0的5’端通过接头连接形成的X-BxB0，分子Y通过接头分别与单链DNA序列B5BsB2’BsB6的3’端、B5’BsB4BsB1’的5’端和B3’BsB4’BsB6’的5’端连接形成的B5BsB2’BsB6-Y、Y-B5’BsB4BsB1’和Y-B3’BsB4’BsB6’，以及单链DNA序列B3BsB2BsB1-B0’，其中：
Bx是任意核苷酸序列，优选长度为2-5个核苷酸，
B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、B6和B6’至少部分、优选完全序列互补以可以形成双链DNA，优选B0、B1、B2、B3、B4、B5和B6中任一个的序列与其余序列均不相同，优选地，互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸，
Bs为间隔序列，各个Bs可以相同或不同，优选长度为0-5个核苷酸，特别优选为一个核苷酸，例如腺苷酸(A)。
30.权利要求29的试剂盒，其中B0和B0’、B1和B1’、B2和B2’、B3和B3’、B4和B4’、B5和B5’、或者B6和B6’中互补序列的长度为10-30个核苷酸，优选15-30个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
31.权利要求28-30任一项的试剂盒，其中
Bx的序列为ACGC，和/或
B0的序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：6)，和/或
B1的序列为AAGATCGCGACCAT(SEQ ID NO：7)，和/或
B2的序列为CGAGAGCAAGTGTA(SEQ ID NO：8)，和/或
B3的序列为ATGTGGCCAATCAA(SEQ ID NO：9)，和/或
B4的序列为TGAGCCTGGACAGG(SEQ ID NO：10)，和/或
B5的序列为TGGGATATCTACGG(SEQ ID NO：11)，和/或
B6的序列为ACTTCAGCTGGTTA(SEQ ID NO：12)，和/或
Bs的序列为A，
优选地，
BxB0的序列为ACGCTTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID NO：13)，
B5BsB2’BsB6的序列为TGGGATATCTACGGATACACTTGCTCTCGAACTTCAGCTGGTTA(SEQ IDNO：14)，
B5’BsB4BsB1’的序列为CCGTAGATATCCCAATGAGCCTGGACAGGAATGGTCGCGATCTT(SEQ IDNO：15)，
B3’BsB4’BsB6’的序列为TTGATTGGCCACATACCTGTCCAGGCTCAATAACCAGCTGAAGT(SEQ IDNO：16)，
B3BsB2BsB1-B0’的序列为ATGTGGCCAATCAAACGAGAGCAAGTGTAAAAGATCGCGACCATAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：17)。
32.权利要求23-31任一项的试剂盒，其中接头选自如下类型接头：
N3/DBCO；
SMCC；
SPDP；
TCO/四嗪，和
HyNic/4FB。
33.权利要求23-32任一项的试剂盒，其中分子Y是可产生可检测信号的分子，例如酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)，或者化学发光标记物质，如吖啶酯类、三联吡啶钌。
34.权利要求23-33任一项的试剂盒，其中蛋白X是靶向性蛋白，优选抗体或配体。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311171939.XA Pending CN117706082A (zh) | 2022-09-13 | 2023-09-12 | 一种蛋白质-dna-分子复合物及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117706082A (zh) |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311171939.XA patent/CN117706082A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |