CN117701631A - 一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及植物育种技术领域，公开了一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建和应用。所述超表达载体的构建方法为：采用特异性引物AcPLD2‑F和AcPLD2‑R进行PCR反应，扩增得到AcPLD2基因片段；将AcPLD2基因片段克隆至含CaMV 35S启动子的PHB载体，得到菠萝AcPLD2基因超表达载体PHB‑AcPLD2。并采用异源转化，将AcPLD2基因在拟南芥野生型和pld2突变体中超表达来验证AcPLD2基因是否参与膜脂代谢，具有载体构建方法简单，验证结果可靠的优点。本发明首次明确了AcPLD2基因参与膜脂降解的功能，研究也为菠萝的分子育种和遗传改良提供了一种新的途径。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及植物育种技术领域，具体涉及一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建和应用。
背景技术
采后菠萝(Ananas comosus L.)果实贮藏期间极易遭受黑心病(一种复杂的生理性紊乱)侵袭，从而限制了其贮藏期并导致品质劣变，损失巨大。果实黑心病发生过程中最明显的一个外观变化就是果肉颜色显现黑褐色，目前普遍认为这主要是由细胞膜结构遭到破坏，酚类物质与多酚氧化酶相遇，前者被氧化为黑褐色醌类而褐变的结果。磷脂是生物体细胞膜的重要组分，主要包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)等，这些磷脂构成了细胞膜的基本支架，是细胞质与外界的屏障，也是细胞对外界刺激应答的物质基础。研究表明，维持细胞膜磷脂类稳定性可以减少多种采后果实包括梨、桃和龙眼等黑心病的发生。菠萝果实细胞膜磷脂类物质主要包括PC和PE，延缓采后菠萝果实细胞膜中PC和PE降解，可推迟黑心病发生(Low temperaturestorage alleviates internal browning of‘Comte de Paris’winter pineapple fruitby reducing phospholipid degradation,phosphatidic acid accumulation andmembrane lipid peroxidation processes.Food Chemistry,2023(404)134656)。
磷脂酶D(PLD；EC3.1.4.4)是一类植物组织中普遍存在，催化细胞膜的主要组分磷脂类物质水解，产生磷脂酸(PA)和亲水性的胆碱等的酶类，目前已在多种植物如水稻、玉米、拟南芥、甘蓝、烟草、番茄、草莓、龙眼等获得PLD基因cDNA全长序列。
发明人在实验过程中从菠萝基因组中分离到磷脂酶基因家族10个成员，Hong等(Identification and characterization of phospholipase D genes putativelyinvolved in internal browning of pineapple during postharveststorage.Frontiers in plant science,2017,8/913)，并且注意到AcPLD2基因表达模式与黑心病的发生具有显著相关性，进一步通过Western-blot技术分析菠萝果实黑心病进程中AcPLD2蛋白表达模式，结果表明，随着果实黑心病的出现，AcPLD2蛋白表达逐渐呈现，暗示AcPLD2蛋白与菠萝果实黑心病有密切联系(菠萝AcPLD2基因多克隆抗体制备及其在果实黑心病发生中的表达分析.热带作物学报,2022,43(2):244-250)。但是目前尚无证据表明，AcPLD2基因参与了膜脂代谢。如何构建AcPLD2基因超表达载体并利用其超表达来验证AcPLD2基因参与膜脂代谢的方法是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法构建的菠萝AcPLD2基因超表达载体。
本发明的再一目的在于提供上述菠萝AcPLD2基因超表达载体在验证AcPLD2基因参与膜脂代谢中的应用。鉴于菠萝遗传转化体系尚未成熟，本发明采用异源转化，将AcPLD2基因在拟南芥野生型和pld2突变体中超表达来验证AcPLD2基因是否参与膜脂代谢。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)采用特异性引物AcPLD2-F和AcPLD2-R进行PCR反应，扩增得到AcPLD2基因片段；所述特异性引物序列如下：
AcPLD2-F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGCTACAGAGGATTCTCC-3’；
AcPLD2-R：5’-GATACGAACGAAAGCTCTAGATCAAGTGGTGAGAATAGGAG-3’；
(2)将步骤(1)的AcPLD2基因片段克隆至含CaMV 35S启动子的PHB载体，得到菠萝AcPLD2基因超表达载体PHB-AcPLD2。
进一步地，步骤(1)中所述PCR反应体系为：10×kod Buffer 2μl，2mM dNTPs 2μl，菠萝cDNA 2μl，DMSO 1μl，10pmol/μl特异性引物1.6μl，kod DNA聚合酶(KOD-401,TOYOBO)1μl，ddH2O 10.4μl。
进一步地，步骤(1)中所述PCR反应程序设置为：94℃4min；94℃30s，64℃30s，72℃1min，40个循环；72℃10min。
进一步地，步骤(1)中所述AcPLD2基因片段序列长度为2439bp，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白由813个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，步骤(2)中所述AcPLD2基因片段克隆至含CaMV 35S启动子的PHB载体的步骤如下：
使用HindⅢ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切含CaMV 35S启动子的PHB质粒，回收并纯化双酶切产物，通过一步克隆链接法链接酶切产物和目的基因片段，得到超表达载体PHB-AcPLD2。
所述回收并纯化的具体过程如下：在250μl EP管中分别加入PHB质粒30μl，10×酶切缓冲液4μl，HindⅢ和XbaⅠ各1μl,补加去离子水至总体积40μl，混匀后置于37℃水浴中酶切1h。酶切结束后，在酶切反应体系试管中加入10×loading buffer 4μl，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。结束电泳，在凝胶成像系统中拍照将DNA目标条带小心割下,放入1.5ml EP管中。采用捷瑞生物科技有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收DNA目的条带纯化，具体步骤如下：①向装有目的DNA条带管中加入400μl的banding B，放入70℃水浴中，直到凝胶完全溶解；②向管中加入100μl异丙醇，室温放1分钟，5000rpm离心1分钟过柱；③加500μl washbuffer 12000rmp洗两次，10000rmp离心1分钟，去除残留washbuffer；④重复步骤③一次；⑤向柱中加入40μl ddH2O，37℃放置2分钟，12000rmp离心1分钟，即获得双酶切产物。
所述一步克隆链接法链接酶切产物和目的基因片段的具体方法如下：AcPLD2基因PCR扩增片段经琼脂糖凝胶回收后，与酶切回收的PHB空载体混合，采用天根生化科技有限公司EasyGeno快速重组克隆试剂盒进行连接，10μl重组体系如下：2×EasyGeno AssemblyMix 5μl，酶切后PHB空载体DNA 2.5μl，AcPLD2基因片段DNA 2.5μl，将反应体系加入250μlEP管中并混合均匀，然后置于50℃水浴30分钟后转化大肠杆菌涂板，平板置于放37℃培养箱16小时后，挑选阳性克隆测序，获得测序正确的重组质粒，从而得到超表达载体PHB-AcPLD2。
一种菠萝AcPLD2基因超表达载体，通过上述方法构建得到。
上述菠萝AcPLD2基因超表达载体在验证AcPLD2基因参与膜脂代谢中的应用。
进一步地，所述应用方法为：
(1)将超表达载体PHB-AcPLD2转化入至农杆菌GV3101中培养，然后侵染拟南芥野生型和pld2基因敲除突变体花序，培养至收种，播种生长至长出真叶，用潮霉素溶液进行喷洒，筛选出抗性小苗，继续培养抗性植株至收获种子，扩繁鉴定直至T3代纯合；对收获的纯合种子进行RT-qPCR目的基因表达量的检测，并与拟南芥野生型和pld2基因敲除突变体的检测结果进行分析比较；
(2)采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术对T3代纯合转基因拟南芥野生型和pld2基因敲除突变体的幼苗中磷脂类物质进行定性定量分析比较；
(3)根据步骤(1)基因表达量的比较结果与步骤(2)磷脂类物质的比较结果确定AcPLD2基因生物学功能。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明采用异源转化，将AcPLD2基因在拟南芥野生型和pld2突变体中超表达来验证AcPLD2基因是否参与膜脂代谢，具有载体构建方法简单，验证结果可靠的优点。
(2)本发明首次明确了AcPLD2基因参与膜脂降解的功能，研究也为菠萝的分子育种和遗传改良提供了一种新的途径。
附图说明
图1为实施例中拟南芥野生型(a)和pld2突变体(b)中AcPLD2基因超表达株系目标基因相对表达量结果图(OE1，OE2，OE3分别表示不同的超表达株系)。
图2为实施例中负(a)、正离子(b)模式下质控样本(QC)质谱检测的总离子流图(TIC)重叠展示分析图。
图3为实施例中拟南芥野生型中AcPLD2基因超表达株系14种磷脂酰乙醇胺(PE)(a)及其总含量(b)的变化模式图(注：蓝色至红色表示含量依次升高)。
图4为实施例中拟南芥pld2突变体中AcPLD2基因超表达株系13种磷脂酰乙醇胺(PE)(a)及其总含量(b)的变化模式图。
图5为实施例中拟南芥野生型中AcPLD2基因超表达株系3种磷脂酰胆碱(PC)(a)及其总含量(b)的变化模式图。
图6为实施例中拟南芥pld2突变体中AcPLD2基因超表达株系10种磷脂酰胆碱(PC)(a)及其总含量(b)的变化模式图。
图7为实施例中拟南芥野生型中AcPLD2基因超表达株系5种磷脂酸(PA)(a)及其总含量(b)的变化模式图。
图8为实施例中拟南芥pld2突变体中AcPLD2基因超表达株系5种磷脂酸(PA)(a)及其总含量(b)的变化模式图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)基因来源及分离
基于菠萝基因组官方网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)公布的菠萝全基因组测序，经过本发明前期实验克隆获得一个基因，鉴定该基因为菠萝磷脂酶D基因，命名为AcPLD2(Aco016943)，AcPLD2基因编码框核苷酸序列长度为2439bp，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白由813个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
(2)AcPLD2基因超表达载体构建
利用AcPLD2基因全长序列构建超表达载体PHB-AcPLD2，以菠萝cDNA为模板，采用Ac PLD2基因正、反向特异引物F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGCTACAGAGGATTCTCC-3’(SEQ ID NO.3)和R：5’-GATACGAACGAAAGCTCTAGATCAAGTGGTGAGAATAGGAG-3’(SEQ IDNO.4)，进行PCR反应，扩增AcPLD2基因CDS序列全长。
PCR反应体系为：10×kod Buffer 2μl，2mM dNTPs 2μl，菠萝cDNA 2μl，DMSO 1μl，10pmol/μl正向及反向引物1.6μl，kodDNA聚合酶(KOD-401,TOYOBO)1μl，ddH2O 10.4μl。
PCR程序设置为：94℃4min；40个循环(具体包括：94℃30s，64℃30s，72℃1min)72℃10min，扩增产物于16℃保存。
扩增后回收并纯化目的条带，采用捷瑞生物科技有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收的DNA目的条带纯化，具体步骤如下：①向装有目的DNA条带管中加入400μl的banding B，放入70℃水浴中，直到凝胶完全溶解；②向管中加入100μl异丙醇，室温放1分钟，5000rpm离心1分钟过柱；③加500μl wash buffer 12000rmp洗两次，10000rmp离心1分钟，去除残留wash buffer；④重复步骤③一次；⑤向柱中加入40μl ddH2O，37℃放置2分钟，12000rmp离心1分钟，即获得AcPLD2基因CDS序列全长。使用HindⅢ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切含CaMV 35S启动子的PHB质粒(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所采后生理与保鲜实验室保存)，回收并纯化双酶切产物，具体过程如下：在250μl EP管中分别加入PHB质粒30μl，10×酶切缓冲液4μl，HindⅢ和XbaⅠ各1μl，补加去离子水至总体积40μl，混匀后置于37℃水浴中酶切1h。酶切结束后，在酶切反应体系试管中加入10×loading buffer 4μl，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。结束电泳，在凝胶成像系统中拍照将DNA目标条带小心割下,放入1.5ml EP管中。采用捷瑞生物科技有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收的DNA目标纯化，具体步骤如下：①向装有目的DNA条带管中加入400μl的banding B，放入70℃水浴中，直到凝胶完全溶解；②向管中加入100μl异丙醇，室温放1分钟，5000rpm离心1分钟过柱；③加500μl wash buffer 12000rmp洗两次，10000rmp离心1分钟，去除残留washbuffer；④重复步骤③一次；⑤向柱中加入40μl ddH2O，37℃放置2分钟，12000rmp离心1分钟，即获得双酶切产物。通过一步克隆链接法链接酶切产物和目的基因片段，具体方法如下：AcPLD2基因PCR扩增片段经琼脂糖凝胶回收后，与酶切回收的PHB空载体混合，采用天根生化科技有限公司EasyGeno快速重组克隆试剂盒进行连接，10μl重组体系如下：2×EasyGeno Assembly Mix 5μl，酶切后PHB空载体DNA 2.5μl，AcPLD2基因片段DNA 2.5μl，将反应体系加入250μl EP管中并混合均匀，然后置于50℃水浴30分钟后转化大肠杆菌涂板，平板置于放37℃培养箱16小时后，挑选阳性克隆测序，获得测序正确的重组质粒为PHB-AcPLD2表达载体用于后续实验。
(3)转基因阳性株的筛选
为了更加全面研究AcPLD2基因在膜脂代谢中的作用，通过拟南芥野生型(Columbia型)和pld2基因敲除突变体(购自AraShare科学，网址：https://www.arashare.cn/index/)两种材料进行遗传转化，然后比较分析两种转基因拟南芥中AcPLD2基因生物学功能。将构建成功的重组质粒PHB-AcPLD2，采用液氮冻融法转入至农杆菌GV3101中，然后置于摇床中摇菌，直至OD值为0.8，使用灭菌的转基因缓冲液重悬，侵染拟南芥野生型和pld2突变体花序，避光16小时后置于光照培养箱(培养条件：光强度为150μmol/m2.s；光周期为16h光照，8h暗期)中培养至收种。收获的种子播种在营养土中生长至长出真叶，用浓度为30μg/ml潮霉素溶液进行喷洒，筛选出抗性小苗，继续培养抗性植株至收获种子，扩繁鉴定直至T3代纯合。
对收获的纯合种子进行了RT-qPCR目的基因表达量的检测，与拟南芥野生型和pld2突变体相比，超表达纯合株系目的基因表达量相对较高(如图1所示，图中(a)为拟南芥野生型结果，(b)为pld2突变体结果)。
(4)转基因阳性株磷脂类物质含量分析
采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术对T3代纯合转基因拟南芥野生型和基因敲除突变体(pld2)的幼苗中磷脂类物质进行了定性定量分析(图2)，共鉴定57种磷脂(PL)包括17PC，35PE和5PA(表1；图2)，结果显示，拟南芥野生型中，3个AcPLD2基因超量表达株系中，14PE包括PE34:3，35:2，36:2，36:3，36:5，38:2，40:2，40:3，42:2，42:3，42:4，43:2，44:2，44:3及其总含量显著低于拟南芥野生型对照(图3)；拟南芥pld2突变体中，3个AcPLD2基因超量表达株系中，13PE包括PE32:1，33:2，33:3，34:3，35:2，36:3，36:5，36:6，41:2，41:3，41:4，42:4，43:3及其总含量显著低于pld2突变体对照(图4)；拟南芥野生型中，3个AcPLD2基因超量表达株系中，3PC包括PC34:4，34:1，36:2及其总含量显著低于拟南芥野生型对照(图5)拟南芥pld2突变体中，3个AcPLD2基因超量表达株系中，10PC包括PC32:1，34:1，34:2，34:3，35:2，36:2，36:5，36:6，37:4，38:5及其总含量显著低于pld2突变体对照(图6)；拟南芥野生型中，3个AcPLD2基因超量表达株系中，5PA包括PA 34:2，34:3，36:4，36:5，36:6及其总含量显著高于拟南芥野生型对照(图7)；拟南芥pld2突变体中，3个AcPLD2基因超量表达株系中，5PA包括PA 34:2，34:3，36:4，36:5，36:6及其总含量显著高于拟南芥野生型对照(图8)。
表1.AcPLD2基因超表达拟南芥叶片中检测到57种磷脂类物质
根据式(Ⅰ)中磷脂酶D参与的代谢途径分析表明，AcPLD2基因在磷脂代谢中具有重要调控作用，该基因表达增强，PE和PC含量降低，PA含量增加，明确了AcPLD2基因参与膜脂降解的功能，研究也为菠萝的分子育种和遗传改良提供了一种新的途径。
(注：PL表示磷脂，X表示极性分子)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用特异性引物AcPLD2-F和AcPLD2-R进行PCR反应，扩增得到AcPLD2基因片段；所述特异性引物序列如下：
AcPLD2-F：5’-ACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGGCTACAGAGGATTCTCC-3’；
AcPLD2-R：5’-GATACGAACGAAAGCTCTAGATCAAGTGGTGAGAATAGGAG-3’；
(2)将步骤(1)的AcPLD2基因片段克隆至含CaMV 35S启动子的PHB载体，得到菠萝AcPLD2基因超表达载体PHB-AcPLD2。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR反应体系为：10×kodBuffer 2μl，2mM dNTPs 2μl，菠萝cDNA 2μl，DMSO 1μl，10pmol/μl特异性引物1.6μl，kodDNA聚合酶1μl，ddH2O 10.4μl。
3.根据权利要求1所述的一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR反应程序设置为：94℃4min；94℃30s，64℃30s，72℃1min，40个循环；72℃10min。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述AcPLD2基因片段序列长度为2439bp，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白由813个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的一种菠萝AcPLD2基因超表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述AcPLD2基因片段克隆至含CaMV 35S启动子的PHB载体的步骤如下：
使用HindⅢ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切含CaMV 35S启动子的PHB质粒，回收并纯化双酶切产物，通过一步克隆链接法链接酶切产物和目的基因片段，得到超表达载体PHB-AcPLD2。
6.一种菠萝AcPLD2基因超表达载体，其特征在于，通过权利要求1～5任一项所述的方法构建得到。
7.权利要求6所述的一种菠萝AcPLD2基因超表达载体在验证AcPLD2基因参与膜脂代谢中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种菠萝AcPLD2基因超表达载体在验证AcPLD2基因参与膜脂代谢中的应用，其特征在于，所述应用方法为：
(1)将超表达载体PHB-AcPLD2转化入至农杆菌GV3101中培养，然后侵染拟南芥野生型和pld2基因敲除突变体花序，培养至收种，播种生长至长出真叶，用潮霉素溶液进行喷洒，筛选出抗性小苗，继续培养抗性植株至收获种子，扩繁鉴定直至T3代纯合；对收获的纯合种子进行RT-qPCR目的基因表达量的检测，并与拟南芥野生型和pld2基因敲除突变体的检测结果进行分析比较；
(2)采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术对T3代纯合转基因拟南芥野生型和pld2基因敲除突变体的幼苗中磷脂类物质进行定性定量分析比较；
(3)根据步骤(1)基因表达量的比较结果与步骤(2)磷脂类物质的比较结果确定AcPLD2基因生物学功能。
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