CN117701623A - PsCLH基因在调控牡丹绿色花和结实方面的应用 - Google Patents

PsCLH基因在调控牡丹绿色花和结实方面的应用 Download PDF

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李彤彤
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Abstract

本发明公开了PsCLH基因在调控牡丹绿色花和结实方面的应用，属于基因工程领域。本发明获得‘绿幕隐玉’PsCLH基因编码序列，通过农杆菌介导法过表达转化烟草和病毒诱导基因沉默来验证候选基因生物学功能。与野生型植株相比，烟草中过表达PsCLH植株出现植株矮小、生长势变弱、结实量减少、叶片颜色变浅等，且PsCLH沉默后的叶绿素总含量上升，说明PsCLH负调控牡丹叶绿素合成。进一步证明了PsCLH在牡丹‘绿幕隐玉’绿色花瓣形成及生长和结实过程中的作用。本发明为牡丹花色和产量育种提供理论基础和基因资源。

Description

PsCLH基因在调控牡丹绿色花和结实方面的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及PsCLH基因在调控牡丹绿色花和结实方面的应用。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)属芍药科芍药属，是世界上著名的观赏植物，因其艳丽多彩的花瓣颜色和独特的文化象征而被称为“花中之王”。牡丹作为园林绿化、盆栽花卉和切花被广泛种植(Zhou et al.,2014a)，已有2000多年的历史，形成了九大花色：白色、粉色、红色、紫色、黑色、黄色、绿色、蓝色和复色(Zhang and Liu，2018)。尽管世界各地已有超三千个牡丹品种，但绿色的品种相对罕见，具有独特花色的品种会受到花色育种者的更多重视(Streinzer et al.,2019)。牡丹绿色品种如‘绿幕隐玉’、‘春柳’、‘豆绿’、‘绿香球’等由于花色稀少，在市场上很受欢迎，具有较高的商业价值。这些绿色品种在开花期间表现出从绿色到白色或粉色的转变。而目前有关牡丹花色的研究主要集中在红色、紫色和黄色，对于绿色牡丹呈色机理方面以及分子生物信息学研究的文章很少。研究发现，观赏植物中花瓣呈现绿色主要是由叶绿素和花色苷等色素共同决定的，但其形成机制还不清楚，限制了绿色花育种的发展。为了丰富牡丹不同花色品种，挖掘花瓣呈色的关键因素以及关键基因，为研究其他绿色花的呈色机理以及绿色牡丹的分子育种提供有效的基因资源非常关键。
发明内容
本发明的目的是提供PsCLH基因在调控牡丹绿色花和结实方面的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该基因负调控牡丹花瓣叶绿素的合成，通过沉默该基因可以促使牡丹花瓣花色降解以促使形成绿色花牡丹，为牡丹花色育种提供理论基础和基因资源。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供PsCLH基因在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用；
其中，所述PsCLH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(或者包含SEQ ID NO：1所示序列的基因片段)：
ATGGCAACTTCTGTTTTTGAAACAGGACCCTTGAGCGTGAAATCTATTATTCCAGTAGAACGGTCATCAAGCACTTCTTCACTTCCAAAGCCATTGCTAATTATTACTCCAACCATTCCTGGGACATACCCAGTTCTTTTGTTTCTTCATGGAACCATGCTAAGTAATGACAACTATACTTTGCTCCTCCAACATATAGCTTCCCATGGATTTATTATCGTTGCTCCTCAGTTATATGCCATTATACCTCGCTGCGGATGCGAAGAGGTGGATGCAGCGGCAGAAGTCACACGGTGGTTATCCGAAGGCCTCCAACCCTTGCTACCTGACGATATCAAAGCAAACCTTGCCAAGTTTGCTCTGGCAGGCCACAGCAGAGGAGGAAAGGCAGCATTCTCTGTTGCATTAGGCTATGCTCCAGTCAGGCCACTTAAAATCTCAGCACTCATTGGAGTAGACCCTGTAGCTGGGAGGGGGGAAGGAGACCAAGTTCTGCCCAACATCCTCACTTACGTCCCTCGCTCTTTTGATCTAAACAAAACCCCGGTGATGGTCCTTGGTACCGGACTGGGGCACCAGAGGAGTTTTTTATGGGGACCAGCTTCTGCTCCTGTGGGTGTGAGTCATGACCAGTTCTTTAGTGAGTGTCAGCCTCCTAGTTACCATATTGTTACAAAGGATTATGGTCACATGGATATGTTGAATGATGGTTTGGGAATAATTGTGGAAAATATGTGTAAGATGTGTAAGAGTGGGTCGGGTGACAAAGATCTCATGAGGAGAAGTGTTGGTGGAATTTTGGTGGCCTTTTTGAGAGCTGCTTTGGAAAGTGAGGATGGAGATCTCAAGGTTATTTTGGAGGAACCTGATGTTTCTCCTGTGAAGCTTGATCCAGTTGAGGTTATTAATGCATGA.
本发明还提供所述PsCLH基因编码的蛋白在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用；
其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(或包含SEQ ID NO：2所示序列的氨基酸序列)：
MATSVFETGPLSVKSIIPVERSSSTSSLPKPLLIITPTIPGTYPVLLFLHGTMLSNDNYTLLLQHIASHGFIIVAPQLYAIIPRCGCEEVDAAAEVTRWLSEGLQPLLPDDIKANLAKFALAGHSRGGKAAFSVALGYAPVRPLKISALIGVDPVAGRGEGDQVLPNILTYVPRSFDLNKTPVMVLGTGLGHQRSFLWGPASAPVGVSHDQFFSECQPPSYHIVTKDYGHMDMLNDGLGIIVENMCKMCKSGSGDKDLMRRSVGGILVAFLRAALESEDGDLKVILEEPDVSPVKLDPVEVINA。
本发明还提供包括所述PsCLH基因的表达载体在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用。
本发明还提供包括所述表达载体的宿主菌在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用。
优选的是，沉默所述PsCLH基因，牡丹花瓣中叶绿素的总含量上升，促使绿色花牡丹形成。
本发明还提供一种调控牡丹花瓣叶绿素合成的方法，包括过表达或者沉默牡丹中的PsCLH基因，以调控牡丹花瓣中叶绿素合成，PsCLH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的是，沉默所述PsCLH基因，所述牡丹花瓣叶绿素的总含量上升；过表达所述PsCLH基因，所述牡丹花瓣叶绿素的总含量下降。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以典型绿色牡丹品种‘绿幕隐玉’为研究材料，通过对牡丹绿色花样本的转录组测序，筛选出花色差异表达的基因，并通过结合荧光定量PCR的方法检测差异表达基因的表达模式，获得关键基因PsCLH，并进一步通过克隆全长、生物信息学分析、过表达烟草以及瞬时基因沉默(VIGS)来验证候选基因的功能，探究了在花瓣叶绿素代谢途径中的作用。结果发现，烟草中过表达PsCLH植株出现植株矮小、生长势变弱、结实量减少、叶片颜色变浅等表型，且PsCLH沉默后的叶绿素总含量上升，说明PsCLH负调控牡丹叶绿素合成。进一步证明了PsCLH在牡丹‘绿幕隐玉’绿色花瓣形成过程中具有重要的调控作用。本发明为深入研究牡丹花色改变的分子机制提供了信息，并为利用基因工程来定向培育变色牡丹品种奠定了理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为‘LMYY’5个时期花瓣RNA的电泳检测结果；M为标准DNA分子，LMS1-LMS5分别为5个时期花瓣RNA样品；
图2为构建过表达基因载体菌液PCR检测结果；M为标准DNA分子，pSuper1300-PsCLH为过表达基因载体菌液；
图3为PsCLH的亲/疏水性、跨膜性结构、信号肽、二级及三级结构预测；A：亲/疏水性预测分析；B：跨膜性预测分析；C：信号肽预测分析分析；D：二级结构预测；E：三级结构预测分析；
图4为牡丹‘LMYY’与其他植物已知PsCLH蛋白氨基酸序列比对及进化树分析；A：PsCLH进化树分析；B：PsCLH与其它物种的CLH蛋白序列的系统进化树分析；
图5为烟草遗传转化；A：共培养阶段；B：Hyg筛选阶段；C：生根阶段；D：再生烟草；
图6为PsCLH转基因烟草PCR检测；Marker为标准DNA分子，WT为野生型烟草，PsCLH为转基因阳性烟草植株；
图7为PsCLH转基因烟草荧光定量分析；
图8为PsCLH转基因烟草表型(A)、L*a*b*值(B)和叶绿素含量(C)；
图9为PsCLH基因表达量与叶绿素含量相关性分析；
图10为PsCLH转基因烟草营养生长指标；A：18周龄烟草株高；B：叶片数；C：节间长；D：冠幅；E：花序分枝数量；F：花序分枝长度；G：单个果实重量；H：单株果实数量；
图11为转基因烟草不同时期花瓣P1-P3表型；
图12为构建VIGS沉默载体菌液PCR检测；M为标准DNA分子，pTRV2-PsCLH为VIGS沉默基因载体菌液；
图13为沉默PsCLH花瓣对表型(A)、L*a*b*值(B)、基因表达量(C)和叶绿素含量(D)的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1PsCLH基因的克隆与功能鉴定
1、PsCLH基因的克隆
1.1植物材料
选择牡丹(P.suffruticosa)中典型绿色品种‘绿幕隐玉’为研究材料，种植于青岛农业大学牡丹种质资源圃。依据开放过程，将花分为五个发育时期，分别为S1(紧密的花蕾时期，花瓣呈黄绿色)、S2(膨大的花蕾时期、花瓣呈浅绿色)、S3(开始开花时期，花瓣为深绿色)、S4(杯状开花时期，绿色和淡粉色共存于花瓣中)和S5(开花时期，花瓣呈淡粉色)。于2021年4-5月，随机采集‘绿幕隐玉’在5个发育时期10株优良株系，每个单株选择新鲜的花瓣，一部分现场立即用于花色评定，以及FAA固定用于扫描电镜观察，一部分用锡箔纸包好液氮速冻后保存于-80℃，用于后期花瓣色素含量，pH值的测定以及RNA提取等研究。
烟草Nc89(Nicotiana tabacum cv.Nc89)种子来自中国科学院植物研究所牡丹组舒庆艳课题组。野生型烟草种子由课题组实验室提供。
1.2基因克隆
总RNA提取与反转录。以S3时期牡丹花瓣为材料提取总RNA，依照II1stStrand cDNASynthesis Kit的反转录说明说明书，顺序进行实验。
(1)cDNA合成
反转录。以前一步骤中所得到的RNA为模板，对其进行反转录表达，制备出cDNA。
具体的操作过程是：首先，在冰上配制16μL的反应体系(4×gDNA wiper Mix 4μL；RNA1μg；ddH2O补充至16μL)，用移液枪轻吹打混合均匀，42℃，2分钟；另外再加入5×HiScriptIII qRT SuperMix，用吸液器轻轻地上下抽打混匀，经过短暂的离心，将管壁液滴收集到管底部，并将其放入PCR仪中，进行如下的反应：37℃15min；85℃5sec。
(2)基因编码区的克隆
根据测序结果可获取PsCLH全长序列，将全长序列于NCBI的CDS Finder在线软件查找最大开放阅读框，并利用软件primer premier 5.0在PsCLH的序列5’端与3’端设计一对特异性引物(见表1)。
表1基因克隆所有基因引物序列
(3)目的基因PCR扩增
以cDNA为模板，对其进行PCR扩增反应。按照Max Master MixPCR说明书操作指南进行扩增。
接着在PCR仪中进行一下程序步骤(循环数35，表2)：
表2PCR程序
(4)DNA凝胶产物的纯化与回收
反应结束后，将所获得的产物上机，跑琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的特异性，将所制得的凝胶产物放置于紫外凝胶成像仪下，观察到条带大小与预期条带大小一致，在紫外下切胶存入1.5mL离心管中，根据Gel DNA Extraction Mini Kit说明纯化回收。
(5)连接
根据5min TA/Blunt-Zero Cloning Kit说明书，在冰上配制5μL反应体系，将回收产物与平末端Blunt-Zero克隆反应5min进行载体连接。
(6)转化感受态
将连接产物转接到大肠杆菌感受态Fast-T1 Competent Cell，并涂布于含有Amp(100mg/mL)LB固体培养基上，将封膜后的平板正放于37℃培养箱10min，待菌液被培养基完全吸收后，将平板翻转倒置，并进行过夜培养。
(7)菌液PCR验证
在平板长出分散且较大的单菌之后，再挑选出单菌落到含有Amp(100mg/mL)的LB液体培养基中，在摇床上设定37℃过夜振荡，将其进行扩大培养，在菌液浑浊之后，将菌液拿出来进行PCR验证。
(8)测序
反应结束后，取PCR产物做琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察条带大小，以确定与预期目标条带一致，菌液鉴定为阳性菌落。将菌液样品取200μL送擎科测序公司测序。测序结果通过DNAMAN8.0软件与PsCLH(c51249.graph_c0)做序列比对。
(9)质粒提取
在测序结果中，找到与目标基因序列有较高重合性的菌落，对其进行质粒提取。
1.3生物信息学分析
通过对基因编码区域的氨基酸物理化学性质的预测、氨基酸亲疏水性的预测、编码产物的二级和三级结构的预测，揭示基因编码区域的分子生物学特性与其功能的关系。在此基础上，采用DNAMAN、MEGA软件对各种植物的氨基酸进行同源序列比较，建立各物种的进化树。分析软件见下表3。
表3在线分析软件分析链接
1.4植物过表达载体的构建
1.4.1克隆质粒提取
使用南京诺唯赞公司质粒小提试剂盒分别提取pMD-18T-PsCLH与pSuper1300的质粒。
1.4.2重组插入片段获取
在Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)网站在线设计引物，设置条件，自动生成插入片段的扩增引物(表1)。插入的片段用高保真酶进行扩增，步骤见1.3，在扩增完成电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒对其进行再回收。
1.4.3线性化载体的制备
找到pSuper1300载体上合适的酶切位点，使用Hind III与Kpn I限制性内切酶双酶切制备pSuper1300线性化载体。
4℃下加样，加样后轻弹离心管底部混匀，放于恒温干燥器内37℃，酶切3-5h后，立即置于冰上，终止酶切反应。
用1％琼脂糖凝胶电泳检验酶切是否成功，DNA凝胶回收试剂盒纯化回收。
1.4.4目的基因与线性载体的连接及转化
通过计算得到需要的DNA的量，在冰面上合成下列反应体系：载体双酶切回收产物3.3μL、目的基因1.23μL、2×Taq Plus Master Mix II 5μL、ddH2O补充至10μL。
用冰块快速溶解DH5α化学感受态细胞，将其融化至液态，用移液器将10μL重组产物注入感受态细胞，用手轻轻弹管壁，使之混合均匀，置冰面上30min。
在42℃下，将反应后的产品放置在恒温干燥机中，加热45s，然后立刻放入冰中，2-3min。将900μL无抗生素的LB液状培养基放入反应试管中，37℃下200rpm摇菌1h。在离心机中以5000rpm离心5min，除去900μL的上清液。用剩下的培养基将菌体吸打重悬，随后用一个无菌的涂布棒轻柔地涂抹在含有卡那霉素(Kan)抗生素的平板上。在37℃的温控条件下，倒置培养12-16h。
1.4.5重组载体质粒鉴定
对pSuper1300-PsCLH重组质粒进行PCR检测(见图2)，灭菌枪头挑取分散且较饱满的农杆菌单菌落，连带枪头打入含有100μg/mL Kan和50μg/mL利福平(Rif)的LB液体培养基内轻晃混匀，置于28℃，200rpm的培养条件下震荡培养8h，后进行PCR检测阳性重组子，挑选条带明确的送擎科生物公司测序并用50％甘油保存正确菌液于-80℃。
1.5过表达载体转化烟草
1.5.1农杆菌介导的烟草转化
烟草的无菌苗培养。取适量野生型烟草种子于1.5mL离心管中，吸取1000μL 75％酒精加入离心管中，使其浸泡2min，上下颠倒摇匀，弃废液；加1000μL 2％次氯酸钠溶液，浸泡种子5min，上下颠倒混匀，弃废液；灭菌水冲洗种子，用移液枪吸出废液，重复3-5次，置于无菌滤纸上吸干水分。灭菌镊子夹取种子接种于组培瓶中的MS培养基上，随后将其放入28℃、光照强度为2500Lx、光周期为16h/8h、相对湿度为60％的培养箱中，当植物长出3-5片真叶时，进行侵染试验。所有的播种过程均在无菌操作台中进行。
重组载体转化农杆菌。叶盘法转化烟草，具体操作步骤如下：
(1)将已转入pSuper1300-PsCLH载体的GV3101农杆菌感受态活化，按照1：100比例取活化菌液加入含100μg/mL Kan和50μg/mL Rif的LB液体培养基内轻晃混匀，置于28℃，180rpm的培养条件下震荡培养，直到菌液OD600值为0.6；
(2)在室温条件下5000rpm离心10min，去除上清，收集菌体沉淀，用灭菌的MS液体培养基重新悬浮菌体，以备侵染叶片；
(3)将生长3周左右，有3-5片真叶时的烟草无菌苗叶片切取叶盘，避开主叶脉以及叶尖叶缘，将其切成1cm2左右的小块；
(4)把切好的烟草叶片小块放入MS悬浊液中，进行10到15min的感染，然后轻轻地摇动，让细菌液体与叶缘的伤口充分接触；
(5)将侵染好菌液的叶子取出，放在无菌滤纸上，将上面的细菌液体吸掉；
(6)将叶片接种至固体共培养基(MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L，PH＝5.8)，置于28℃避光共培养3d；
(7)在共培养完成之后，用含500mg/L头孢霉素(Cef)的无菌水对叶片上的残余农杆菌进行洗涤，再用无菌滤纸将其吸收干净，最后将其移到含有Kan的分化诱导及筛选培养基MS(MS培养基+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L+Kan(100mg/L)+Cef(200mg/L)，PH为5.8)上，28℃，光照强度为2500Lx、相对湿度为50％-60％、光周期为16h/8h静置培养，每十天更换一次MS培养基；
(8)分化出再生苗后，待分化苗长到2-3cm高的将其从愈伤组织上分离。转入MS生根培养基(1/2MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L+Kan(100mg/L)+Cef(200mg/L)，PH为5.8)，诱导生根，大约1-2周后阳性转基因苗可生根；在诱导出幼苗后，当幼苗生长到2-3cm时，将幼苗与愈伤组织分开。将其转移到MS的生根培养基(1/2MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L+Kan(100mg/L)+Cef(200mg/L)，PH为5.8)中，进行诱导生根，1-2个星期后，该基因的阳性植株就可生根；
(9)在根系生长良好后，将烟草组培苗取出来，用无菌水冲洗干净其根部所携带的琼脂，并将其定植在含有基质的花盆中(营养土：蛭石＝1：1)，覆膜一星期后，揭开薄膜，移入温室中使其开花结果以获得种子；
(10)直到种子完全成熟，采集并保存在4℃的冰箱中，在较低的温度下进行春化备用。
1.5.2转基因烟草的PCR鉴定与qPCR检测
(1)PCR鉴定
分别取长势较好的转入pSuper1300-PsCLH基因的烟草6株，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR鉴定，鉴定方法上述1.4中的普通PCR鉴定。在反应完成后，用1％琼脂糖凝胶电泳测带有目的基因条带的烟草植株阳性烟草植株。
(2)RT-qPCR检测
对野生型、转基因株系进行荧光定量PCR，验证PsCLH基因的相对表达量。提取总RNA，RNA反转录成cDNA(见试剂说明)，在NCBI官网在线设计PsCLH基因的荧光定量引物(见表4)，并选取烟草基因的NtTubulin内参基因设计内参引物NtTubulin-F和NtTubulin-R(见表4)，荧光定量PCR反应体系如下：cDNA 2μL、2×ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix10μL、Forward primer 0.4μL、Reverse primer 0.4μL、ddH2O 9.8μL。
表4实时荧光定量分析所有基因引物序列
实时荧光定量PCR反应条件如下(循环数40，表5)：
表5实时荧光定量PCR反应条件
根据2-ΔΔCt法计算转基因烟草植株中的PsCLH基因的相对表达量。
1.6PsCLH在转基因烟草中的生物学功能验证
对转基因株系进行荧光定量PCR，验证PsCLH基因的相对表达量。以及对烟草阳性植株进行营养生长指标的测定。分别选择PsCLH表达量高的转基因烟草株系用以表型验证。比较苗龄为24周的野生型、PsCLH转基因烟草阳性植株的营养生长状况，并对二者株高、冠幅、花序分枝长度、数量等进行测量，拍照记录烟草表现形态。果实成熟后进行采收，并对果实长度、宽度、果实重量等指标进行统计。
2、结果与分析
2.1基因的克隆
2.1.1RNA质量检测
提取‘绿幕隐玉’花瓣的RNA，并对所提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图结果显示四个样品的RNA均有28S、18S、和5S三条清晰条带，并且28S条带最为明显(图1)。RNA质量合格，保存于-80℃或立即反转录后保存于-20℃用于后续试验。
2.1.2基因编码区的克隆
根据转录组数据，得到PsCLH(1020bp)的核苷酸序列，并于CDS Finder在线软件找查询PsCLH的开放阅读框，其中，PsCLH的CDS为915bp。在其两端设计引物PsCLH-F/R(见表1)，以‘绿幕隐玉’的cDNA为模板进行PCR扩增，在915bp附近得到了单一特异性条带，菌液经测序，结果显示该序列与拼接结果的CDS区一致。
2.2PsCLH的生物信息学分析
对PsCLH的编码区序列进行生物信息学分析，包括氨基酸理化性质预测分析、氨基酸疏亲水性预测分析、编码产物二级和三级结构预测分析。
使用ProtParam在线分析工具预测蛋白质理化性质，PsCLH的CDS为915bp，共编码313个氨基酸。编码蛋白的相对分子质量33495.78Da，分子式为C1506H2399N395O440S13，理论等电点PI值为5.49，原子总数为4753个。不稳定指数为46.75，推测该蛋白为不稳定蛋白。总平均疏水指数为0.186。PsCLH蛋白中疏水性最大值为2.8，最小值为-1.767。该蛋白具有非常明显的亲水和疏水区域交替排列，总体为疏亲水性蛋白。PsCLH没有蛋白跨膜结构域，不属于膜蛋白。PsCLH没有信号肽，属于非分泌性蛋白。PsCLH结果显示氨基酸二级结构显示结构原件有α-螺旋(31.95％)、β-转角(6.71％)、无规则卷曲(42.81％)、延伸链(18.53％)(图3)。
将PsCLH氨基酸序列与李子(Prunzzs mume)、中国蔷薇(Rosa chinensis)、鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)、桑椹(Morus notabilis)、红槲树(Quercussber)、葡萄(Vitsvinifera)等的同源蛋白氨基酸序列做比对，为探究与其它物种之间的系统发育关系，通过Jalview构建系统进化树，结果表明PsCLH与莲藕聚为一类，与其系统进化关系也很近(图4)。
2.3基因过表达载体的鉴定
以pSuper1300-PsCLH的重组质粒DNA为模板，进行PCR验证，在915bp处有PsCLH的正确条带，对阳性质粒测序结果比对分析表明与原序列一致性达到99％以上，成功构建过表达载体pSuper1300-PsCLH。
2.4转化烟草
重组载体导入烟草中鉴定PsCLH的功能，实验采用农杆菌介导法，以及烟草叶盘法转化建立遗传转化体系，将PsCLH转至烟草中过表达，烟草遗传转化每一阶段状态如图5。
2.5转基因烟草植株筛选和定量
通过农杆菌介导法将基因转入烟草叶片，T1代烟草种子于20mg/L Hyg的MS体培养基中进行抗性筛选，在对转基因烟草植株进行抗体筛选时，会存在抗体植株假阳性情况，即农杆菌所携带的外源基因并没有成功插入至烟草基因组，所以需要对抗性植株的DNA进行抗性PCR检测，确定阳性烟草植株(图6)。
2.6转基因烟草荧光定量PCR检测
T0代烟草植株继续种植后单株收种子重复抗性筛选，T1单株收种子继续抗性Hyg筛选至T2代纯合可用于观察表型。对T2代的转基因株系提取RNA并进行实时荧光定量PCR鉴定，验证基因的相对表达量。结果表明，PsCLH的相对表达量较于野生型烟草中的表达量也同样升高，第1株系、第2株系、第7株系、第12株系、第18株系和第23株系相对表达量分别是野生型植株的421倍、45倍、19倍、19倍、16倍和20倍(图7)。
2.7PsCLH转基因烟草指标测定
2.7.1转基因烟草表型观察
从图中可以看出，过表达PsCLH导致了叶片失绿现象(图8中A)，L*a*b*的检测也呈现相应的变化，三个株系的L*值普遍高于对照组(53.16)，其中第1株系最高，为84.29，其次是第2株系，为75.92。a*值也是普遍高于对照组(-20.19)，其中第1株系最高，为-19.24，其次为第2株系，为-19.44。b*值也是呈现相应的变化趋势，其中第1株系最高，为52.14(图8中B)，过表达PsCLH烟草的叶绿素含量普遍比对照组低(图8中C)，且相关性分析结果表明，叶绿素a含量、叶绿素b含量、总叶绿素含量与PsCLH基因表达量呈显著负相关(图9)。这些结果表明，过表达PsCLH会加速叶片叶绿素的分解，使叶片白化。
2.7.2转基因烟草营养生长指标测定
比较野生型和转基因PsCLH烟草植株的营养生长状况，发现PsCLH转基因植株与野生型植株存在显著差异。PsCLH转基因株系的株高普遍低于野生型植株，为43.66±2.49cm，尤其是第1株系(图10中A)。PsCLH转基因株系的叶片数略少于野生型植株，为32.33±
1.24(图10中B)。PsCLH转基因株系的节间长低于野生型植株，为2.4±0.37cm(图10中C)。PsCLH转基因株系冠幅为14.33±1.69cm，低于野生型的30.33±1.24cm(图10中D)。PsCLH转基因植株的花序分枝数量与野生型差异不大(图10中E)。相同生长时间内PsCLH转基因植株的花序长度与野生型植株相差不多(图10中F)。PsCLH转基因植株的果实重量与野生型相比无显著性差异(图10中G)。在单株果实数量上，PsCLH转基因植株的果实数量略少于野生型(图10中H)。
2.7.3转基因烟草开花过程分析
PsCLH的花瓣在P1时期已经出现明显的红色，转基因株系PsCLH花瓣的红色比野生型CK株系花瓣红色更深一些，这与PsCLH的表达量呈负相关(图11)。
实施例2利用VIGS瞬时沉默PsCLH基因
1、实验材料
同实施例1。
2、构建VIGS过表达载体
根据转录组数据库中PsCLH的序列设计上下游引物(见表6)克隆靶片段，克隆长度为379bp。用于VIGS沉默的PsCLH片段设计上下游引物并添加Eco RI和Kpn I酶切位点。PCR扩增体系和程序同实施例1中的1.4。将目标条带进行回收，并与PMD18-T载体进行连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，对其进行PCR序列测序，确认无误后，将其提取阳性质粒。与此同时，分别用对应的2个限制性内切酶将目的片段和pTRV2进行双酶切反应并回收，双酶切反应体系(50μL)：2.5μL 10×M Buffer，2.5μg质粒DNA，2.5μL限制性内切酶I，2.5μL限制性内切酶Ⅱ，灭菌水加到50μL。条件为37℃反应3-5h。之后跑胶回收。随后利用同源重组技术，将靶基因与pTRV2的回收产物进行连接。连接产物转化涂板后，从中挑取阳性单克隆菌落并进行菌液PCR验证，根据pTRV2序列信息特征，设计特异性的引物，对pTRV2-F/pTRV2-R鉴定重组载体。经序列测定后，测序验证为正确的表达载体质粒储存于-20℃保存备用。用冻融法转化农杆菌GV310感受态细胞，获得阳性的单克隆农杆菌，菌液加入50％的甘油混匀后于-80℃保存备用。
表6VIGS所有基因引物序列
2、VIGS沉默花瓣
具体步骤如下：
(1)设置TRV2-PsCLH为目标基因，相应的pTRV2空载体为对照。
(2)取pTRV1、pTRV2(阴性对照)、TRV2-PsCLH的农杆菌GV3101各1mL接种60mL的LB液体培养基(含50mg/L Rif、100mg/L Kan、50mg/L庆大霉素(Gen)、200mmol/L乙酰丁香酮(As)、10mmol/L MES)中，180rpm/min，28℃，振荡培养至不同处理OD600；
(3)测定已摇菌液的OD600＝1.0-2.0后，4000rpm，室温离心10min，收集菌体，弃上清；
(4)重悬于侵染缓冲液(10mM MgCl2，20mM AS，10mM MES(pH＝5.6)中；
(5)用侵染液调节重悬菌液的OD600值与所设置菌液OD600值相同，且TRV2-PsCLH、pTRV1和pTRV2菌液的OD600值相同；
(6)将pTRV2、TRV2-PsCLH菌液分别和pTRV1按体积比1：1混合，室温暗处置4h；
(7)VIGS体系接种技术多样，物种不同，所采用的接种方法也影响基因沉默效率的高低，本试验所采用的侵染方法为抽真空法。先处理花瓣圆片，选取S3时期的花朵。去掉最外面的花瓣，取中间的花瓣，每株花6-8片；花瓣圆片选择靠近边缘的中上部，每个花瓣打一个，选用平整的圆片，尽量确保圆片的位置基本相同；采用真空抽吸法将花瓣圆片进行抽吸侵染。将花瓣圆片浸泡在侵染液里。第一次抽吸到-0.08，第二次-0.07，维持90s，缓慢放气5min，侵染液OD600＝1.5。在侵染后，将花瓣用蒸馏水冲洗。用软尺测度花瓣的长度和宽度。按照一定的顺序拍摄，并在照片中添加直尺作为标尺。在此过程中，要注意尽可能的快速，以免失去水分，不要把花瓣顺序弄乱。将已完成拍摄的花瓣放在浸泡过的吸水纸上，以确保其底部可以吸收水分。用塑料薄膜包住以防水分流失；
(8)8℃放置3d，3d后取出来，按照上一次的次序，测量尺寸，拍摄照片；
(9)转移到23℃下放置10d左右。取样当天按顺序进行测量、拍照、取样；
(10)将各处理后的花瓣圆片放入液氮中速冻后放置于-80℃备用。参考实施例1中的生物信息学分析方法，分析与空白对照相比，基因的表达水平的变化，进行PsCLH基因的表达量分析，设9次生物学和3次技术重复。引物序列见(见表4)。
3、结果与分析
3.1PsCLH靶片段的克隆
电泳结果显示，在350bp左右出现清晰单一的特异条带，这与目的基因片段大小一致，回收连接转化获得阳性菌液进行测序，结果显示成功克隆得到PsCLH基因干扰片段(379bp)，可用于构建VIGS重组载体。
3.2目的基因VIGS重组载体的构建
将靶片段与线性载体进行酶切连接反应后，转化大肠杆菌，经过菌液PCR的鉴定(图12)，获得了清晰单一的特异条带。
3.3沉默PsCLH花瓣表型、叶绿素含量及L*a*b*值分析
瞬时沉默PsCLH 10d后，花瓣出现滞绿表型(图13中A)。PsCLH浸染花瓣的沉默效率为63％(图13中B)，与TRV对照(101.19μg·g-1FW)相比，PsCLH沉默(164.01μg·g-1FW)花瓣的总叶绿素含量增加(图13中D)，PsCLH沉默的a*值(-20.56)明显低于TRV对照(-14.71)，然而，b*值显示出与a*值相反的趋势(图13中B)。这些与表型结果一致，表明了PsCLH可促进叶绿素降解。
从上述实施例1-2的结果可以看出，PsCLH基因的沉默可能导致了牡丹‘绿幕隐玉’中花色的改变，这些结果与过表达烟草的结论一致。本发明成功沉默了PsCLH基因，沉默效率为63％。发现沉默PsCLH，花瓣叶绿素含量要比对照多，花瓣出现滞绿表型，这说明PsCLH基因可能在花色形成途径中起重要的调控作用，PsCLH沉默后的叶绿素总量提升，这进一步证明了PsCLH基因在牡丹‘绿幕隐玉’花瓣绿色降解过程中起作用。本发明初步着重探索了关键候选基因PsCLH的功能，并获得了阳性烟草植株种子，其表型也出现了显著变化，为完善牡丹绿色花的花瓣呈色机理，为以花瓣颜色为指标的品种选育提供理论指导与有效的基因资源。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.PsCLH基因在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用；
其中，所述PsCLH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1中所述PsCLH基因编码的蛋白在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用；
其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.包括权利要求1中所述PsCLH基因的表达载体在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用。
4.包括权利要求3中所述表达载体的宿主菌在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)在调控牡丹绿色花形成方面的应用；
(2)在调控牡丹花瓣叶绿素合成方面的应用；
(3)在培育绿色花牡丹品种中的应用；
(4)在调控牡丹生长和结实中应用。
5.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，沉默所述PsCLH基因，牡丹花瓣中叶绿素的总含量上升，促使绿色花牡丹形成。
6.一种调控牡丹花瓣叶绿素合成的方法，其特征在于，包括过表达或者沉默牡丹中的PsCLH基因，以调控牡丹花瓣中叶绿素合成，PsCLH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，沉默所述PsCLH基因，所述牡丹花瓣叶绿素的总含量上升；过表达所述PsCLH基因，所述牡丹花瓣叶绿素的总含量下降。
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