CN117701540A - 在毕赤酵母中大规模制备蛋白酶k的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在毕赤酵母中大规模制备蛋白酶K的方法，使用本发明的方法进行高密度发酵，在诱导后蛋白酶K的表达量极高，且表达产物纯度较高，后续仅需超滤浓缩后过阳离子柱纯化即可得到高纯度的蛋白酶K产品，整个流程操作简单、周期短、成本低，适合工业化生产。

Description

在毕赤酵母中大规模制备蛋白酶K的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种在毕赤酵母中大规模制备蛋白酶K的方法。

背景技术

蛋白酶K是蛋白酶的一种，属于碱性丝氨酸蛋白酶类，来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)，因其能降解角蛋白，故命名为蛋白酶K。其分子量为28.93KDa。该蛋白分子中有两个Ca²⁺结合位点，有研究表明，用EDTA螯合去除蛋白中的Ca²⁺，催化活性会受到明显的抑制，且重新加入Ca²⁺该蛋白也仅能恢复28％活性。此外，其成熟体还含有典型的丝氨酸蛋白酶类催化三联体结构(Asp 39-His 69-Ser 224)和两对二硫键因此其比其他蛋白酶在极端pH和高温等环境中有更高的稳定性。

蛋白酶K应用较为广泛，常见应用有肉类的嫩化、DNA/RNA等核酸提取、原位杂交以及生活和工业用水中细菌的灭活等。在肉类嫩化中，蛋白酶K能分解肉的肌纤维，结缔组织的蛋白质，甚至包括弹性蛋白及胶原蛋白，使蛋白质的各级空间结构发生变化，部分肽键断裂，肉料吸水膨胀，质地变嫩。在核酸提取中，蛋白酶K主要用于将样品中的蛋白质类杂质分解，其能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的纯化。另外蛋白酶K在65℃及存在EDTA、尿素以及去垢剂如0.5％SDS等存在时，仍然能够保留部分酶活性，在提取核酸时有较大优势。在原位杂交中，蛋白酶K通常被用于杂交前标本的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以利于检测探针的穿透，提高检测灵敏度。

目前大部分商业化的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌经发酵后分离纯化获得，当培养基中添加蛋白质类氮源时即可诱导林伯氏白色念球菌产蛋白酶K，因此发酵过程中通常会加入BSA、奶粉等富含蛋白质类的物质作为氮源和诱导剂，但此过程蛋白酶K的合成会明显受到培养基中的葡萄糖和氨基酸抑制。且林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度发酵，在发酵过程中林伯氏白色念球菌还会产其它蛋白酶类，加之该菌株的基因工程操作相比大肠杆菌、酵母菌以及芽孢杆菌困难许多，这些都给蛋白酶K的大规模高效生产带来困难。而由于蛋白酶K极高的蛋白水解活性，要实现蛋白酶K的基因工程异源表达就需要实现目标蛋白在菌体内的无活性合成并在分泌后再形成有活性的蛋白。有人曾使用大肠杆菌表达出了有活性的蛋白，但表达量极低。近年来其他表达宿主(比如毕赤酵母)也有一些报道，但没有大规模生产的相关报道，因此目前的蛋白酶K生产工艺大大限制了其在市场中的应用。

因此一个操作简单、成本低且高产的大规模工业生产工艺对蛋白酶K的市场应用具有实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在毕赤酵母中大规模制备蛋白酶K的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种重组蛋白酶K编码序列，所述重组蛋白酶K编码序列如SEQ ID NO.8所示，或者所述重组蛋白酶K编码序列与SEQ ID NO.8相比具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第一方面所述的重组蛋白酶K编码序列。

本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的载体或染色体整合有本发明第一方面所述的重组蛋白酶K编码序列。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述真核细胞为毕赤酵母细胞。

本发明的第四方面，提供了一种制备蛋白酶K的方法，包括步骤：

(i)在适合的条件下，培养本发明第三方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的蛋白酶K；和

(ii)分离所述的蛋白酶K。

在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为20℃-40℃；优选为25℃-37℃，如25-30℃。

在另一优选例中，所述步骤(i)中所述宿主细胞为酵母细胞。

在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述酵母细胞的培养基为BSM培养基。

在另一优选例中，所述步骤(i)中发酵培养所述酵母细胞的过程中，设置转速为：200-1000rpm。

在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述酵母细胞的发酵条件为：

搅拌：200-1000rpm，

温度：25-30℃，

溶氧：20-50％，和/或

pH：4.5-5.5。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1蛋白酶K小量表达筛选结果；

图2筛选菌株发酵液点奶粉平板检测活性结果；

图3各菌株发酵样品检测蛋白表达情况；

具体实施方式

本发明提供了一株含有新的编码蛋白酶K基因的菌株，使用该菌株进行高密度发酵，在诱导后表达量可达20mg/mL以上，且表达产物纯度较高，后续仅需超滤浓缩后过阳离子柱纯化即可得到高纯度的蛋白酶K产品，整个流程操作简单，周期短，成本低，产量高。在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

在本发明优选的实施方式中，根据本发明的重组蛋白酶K的氨基酸序列(SEQ IDNO.1)如下：

APAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDEN

MVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEA

SHPEFEGRAQMVKTYYASSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGM

DFVASDHNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVC

TVGATDRYDRRSSFSNYGSVLDIFAPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGRTTA

ANACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

在本发明优选的实施方式中，重组蛋白酶K的基因序列如下(经大肠杆菌同义密码子偏好性优化，SEQ ID NO.8)：

GCTCCTGCTGTTGAACAAAGATCTGAAGCTGCTCCATTGATCGAAGCTAGAGGTGAAATGGTTGCTA

ATAAGTATATTGTTAAATTTAAAGAAGGTTCTGCTTTGTCTGCTTTGGATGCTGCTATGGAAAAAAT

TTCTGGTAAACCTGATCATGTTTACAAAAATGTTTTTTCTGGTTTTGCTGCTACTTTGGATGAAAAT

ATGGTTAGAGTTTTGAGAGCTCATCCTGATGTTGAATATATTGAACAAGATGCTGTTGTTACTATTA

ATGCTGCTCAAACTAATGCTCCATGGGGTTTGGCTAGAATTTCTTCTACTTCTCCTGGTACTTCTAC

TTATTACTATGATGAATCTGCTGGTCAAGGTTCTTGTGTTTATGTTATTGATACTGGTATTGAAGCT

TCTCATCCTGAATTTGAAGGTAGAGCTCAAATGGTTAAAACTTATTATGCTTCTTCTAGAGATGGTA

ATGGTCATGGTACTCATTGTGCTGGTACTGTTGGTTCTAGAACTTATGGTGTTGCTAAAAAAACTCA

ATTGTTTGGTGTTAAAGTTTTGGATGATAATGGTTCTGGTCAATATTCTACTATTATTGCTGGTATG

GATTTTGTTGCTTCTGATCATAATAATAGAAATTGTCCAAAAGGTGTTGTTGCTTCTTTGTCTTTGG

GTGGAGGTTATTCTTCATCTGTTAATTCTGCTGCAGCTAGATTGCAATCTTCTGGTGTTATGGTTGC

TGTTGCTGCTGGTAATAACAATGCTGATGCTAGAAATTATTCTCCTGCTTCTGAACCATCTGTTTGT

ACTGTTGGTGCTACTGATAGATATGATAGAAGATCTTCTTTTTCTAATTATGGTTCTGTTTTGGATA

TTTTTGCTCCTGGTACTTCAATTTTGTCTACTTGGATTGGTGGTTCTACTAGATCTATTTCTGGTAC

TTCTATGGCTACTCCACATGTTGCTGGTTTGGCTGCTTATTTGATGACTTTGGGTAGAACTACTGCT

GCTAATGCTTGTAGATATATTGCTGATACTGCTAATAAAGGTGATTTGTCTAATATTCCATTTGGTA

CTGTTAATTTGTTGGCTTATAATAATTATCAAGCT

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的重组酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的突变体酶可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得目的酶。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；

(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在0.1-1.5mM；

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。

本发明的目的蛋白存在于宿主细胞发酵液中。宿主细胞发酵液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TMHeparinHPColumns。

5.膜过滤

超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。

本发明的主要优点在于：

本发明筛选获得了表达产量极高的蛋白酶K优化编码基因以及携带该优化编码基因的新的表达蛋白酶K菌株，使用该菌株进行高密度发酵，在诱导后表达量可达20mg/mL以上，且表达产物纯度较高，后续仅需超滤浓缩后过阳离子柱纯化即可得到高纯度的蛋白酶K产品，整个流程操作简单，周期短，成本低，产量高。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：重组蛋白表达菌株的构建

1、毕赤酵母密码子偏好性优化

本发明中蛋白酶K的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)：

APAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDEN

MVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEA

SHPEFEGRAQMVKTYYASSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGM

DFVASDHNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVC

TVGATDRYDRRSSFSNYGSVLDIFAPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGRTTA

ANACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQA

对上述蛋白序列的密码子，依据毕赤酵母密码子偏好性进行优化，经优化的部分编码基因例举如下：

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列1(SEQ ID NO.2)：GCACCTGCGGTGGAGCAGCGGTCTGAAGCTGCGCCTTTGATCGAGGCCCGGGGTGAGATGGTTGCAAATAAGTACATTGTGAAATTCAAAGAGGGATCTGCACTCTCGGCTTTGGACGCAGCAATGGAAAAAATCTCGGGCAAACCAGATCATGTCTACAAGAACGTATTTTCTGGCTTTGCCGCAACTCTCGATGAGAATATGGTACGAGTATTGCGAGCGCATCCTGACGTCGAGTATATCGAACAAGATGCCGTCGTTACCATCAACGCCGCGCAAACCAACGCGCCATGGGGACTCGCACGGATAAGCAGCACCTCACCTGGAACGTCCACTTACTACTACGACGAGTCCGCGGGCCAAGGGTCATGTGTTTATGTCATTGATACGGGAATAGAGGCCAGCCACCCAGAATTTGAAGGTCGCGCTCAGATGGTTAAGACTTATTATGCGTCAAGTCGAGATGGAAATGGGCATGGTACCCACTGTGCGGGTACCGTAGGTTCCCGGACGTATGGTGTCGCAAAAAAAACTCAGCTCTTCGGGGTTAAAGTACTTGATGACAATGGATCGGGGCAATACTCAACCATCATTGCCGGAATGGATTTCGTTGCCAGCGATCATAACAATCGCAACTGTCCTAAAGGTGTTGTGGCGAGCCTCTCCTTGGGTGGAGGGTATAGTAGCTCGGTGAACTCTGCTGCTGCTCGACTCCAATCATCGGGCGTAATGGTGGCTGTCGCAGCAGGAAACAATAACGCGGACGCTCGAAATTATAGCCCGGCTTCGGAGCCGAGTGTTTGCACGGTTGGAGCAACGGATCGATATGATCGACGCAGCTCGTTCAGCAATTACGGTTCAGTTCTTGACATTTTTGCCCCCGGCACCTCGATTCTGTCGACGTGGATTGGGGGGTCAACCCGGTCCATTAGCGGGACATCGATGGCAACCCCACACGTGGCCGGCTTGGCGGCGTATTTGATGACGTTGGGTAGGACTACTGCTGCGAATGCTTGTCGTTACATTGCAGATACGGCAAACAAAGGTGACCTTAGTAATATCCCTTTTGGCACAGTAAATCTCTTGGCTTATAACAACTATCAGGCC

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列2(SEQ ID NO.3)：GCTCCAGCTGTTGAACAAAGATCTGAAGCTGCTCCATTGATCGAAGCTAGAGGTGAAATGGTTGCTAACAAGTACATCGTTAAGTTCAAGGAAGGTTCTGCTTTGTCTGCTTTGGACGCTGCTATGGAAAAGATCTCTGGTAAGCCAGACCACGTATACAAGAACGTGTTCAGCGGTTTTGCGGCTACTCTCGACGAAAACATGGTTAGAGTTTTGAGAGCTCACCCAGACGTTGAATACATCGAACAAGACGCTGTTGTTACTATCAACGCTGCTCAAACTAACGCTCCATGGGGTTTGGCTAGAATCTCTTCTACTTCTCCAGGTACTTCTACTTACTACTACGACGAATCTGCTGGTCAAGGCTCGTGTGTCTACGTCATCGACACTGGTATCGAAGCTTCTCACCCAGAATTCGAAGGTAGAGCTCAAATGGTTAAGACTTACTACGCTTCTTCTAGAGACGGTAACGGTCACGGTACTCACTGTGCTGGTACTGTTGGTTCTAGAACTTACGGTGTTGCTAAGAAGACTCAATTGTTCGGTGTTAAGGTTTTGGACGACAACGGTTCTGGTCAATACTCTACTATCATCGCTGGTATGGACTTCGTTGCTTCTGACCACAACAACAGAAACTGTCCAAAGGGTGTTGTTGCTTCTTTGTCTTTGGGTGGTGGTTACTCTTCTTCTGTTAACTCTGCTGCTGCTAGATTGCAATCTTCTGGTGTTATGGTTGCTGTTGCTGCTGGTAACAACAACGCTGACGCTAGAAACTACTCTCCAGCTTCTGAACCATCTGTTTGTACTGTTGGTGCTACTGACAGATACGACAGAAGATCTTCTTTCTCTAACTACGGTTCTGTTTTGGACATCTTCGCTCCAGGTACTTCTATCTTGTCTACTTGGATCGGTGGTTCTACTAGATCTATCTCTGGTACTTCTATGGCTACTCCACACGTTGCTGGTTTGGCTGCTTACTTGATGACTTTGGGTAGAACTACTGCTGCTAACGCTTGTAGATACATCGCTGACACTGCTAACAAGGGTGACTTGTCTAACATCCCATTCGGTACTGTTAACTTGTTGGCTTACAACAACTACCAAGCT

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列3(SEQ ID NO.4)：GCCCCCGCCGTCGAGCAGCGCTCCGAGGCCGCCCCCCTCATCGAGGCCCGCGGTGAGATGGTCGCCAACAAGTACATCGTCAAGTTCAAGGAGGGTTCCGCCCTCTCCGCCCTCGACGCCGCCATGGAGAAGATCTCCGGTAAGCCCGACCACGTCTACAAGAACGTCTTCTCCGGTTTCGCCGCCACCCTCGACGAGAACATGGTCCGCGTCCTCCGCGCCCACCCCGACGTCGAGTACATCGAGCAGGACGCCGTCGTCACCATCAACGCCGCCCAGACCAACGCCCCCTGGGGTCTCGCCCGCATCTCCTCCACCTCCCCCGGTACCTCCACCTACTACTACGACGAGTCCGCCGGTCAGGGTTCCTGCGTCTACGTCATCGACACCGGTATCGAGGCCTCCCACCCCGAGTTCGAGGGTCGCGCCCAGATGGTCAAGACCTACTACGCCTCCTCCCGCGACGGTAACGGTCACGGTACCCACTGCGCCGGTACCGTCGGTTCCCGCACCTACGGTGTCGCCAAGAAGACCCAGCTCTTCGGTGTCAAGGTCCTCGACGACAACGGTTCCGGTCAGTACTCCACCATCATCGCCGGTATGGACTTCGTCGCCTCCGACCACAACAACCGCAACTGCCCCAAGGGTGTCGTCGCCTCCCTCTCCCTCGGTGGTGGTTACTCCTCCTCCGTCAACTCCGCCGCCGCCCGCCTCCAGTCCTCCGGTGTCATGGTCGCCGTCGCCGCCGGTAACAACAACGCCGACGCCCGCAACTACTCCCCCGCCTCCGAGCCCTCCGTCTGCACCGTCGGTGCCACCGACCGCTACGACCGCCGCTCCTCCTTCTCCAACTACGGTTCCGTCCTCGACATCTTCGCCCCCGGTACCTCCATCCTCTCCACCTGGATCGGTGGTTCCACCCGCTCCATCTCCGGTACCTCCATGGCCACCCCCCACGTCGCCGGTCTCGCCGCCTACCTCATGACCCTCGGTCGCACCACCGCCGCCAACGCCTGCCGCTACATCGCCGACACCGCCAACAAGGGTGACCTCTCCAACATCCCCTTCGGTACCGTCAACCTCCTCGCCTACAACAACTACCAGGCC

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列4(SEQ ID NO.5)：GCCCCCGCTGTAGAACAGCGTAGTGAAGCAGCGCCGCTTATTGAAGCGCGTGGGGAGATGGTCGCCAACAAGTATATTGTAAAGTTTAAGGAGGGTTCCGCGTTATCAGCTTTGGATGCGGCTATGGAAAAGATCTCCGGCAAGCCAGACCACGTGTACAAAAATGTTTTTTCTGGATTTGCAGCGACTTTAGACGAGAATATGGTGCGTGTACTTCGTGCGCATCCTGATGTGGAATACATCGAGCAGGACGCGGTGGTAACAATCAATGCAGCTCAGACTAATGCTCCATGGGGTTTGGCTCGTATCTCATCTACTTCACCCGGCACGTCTACATACTATTATGACGAATCCGCAGGCCAAGGGAGCTGCGTATACGTGATAGACACAGGAATTGAGGCTAGTCACCCGGAATTCGAGGGCCGTGCGCAGATGGTGAAAACATACTACGCCTCCAGTAGGGACGGTAACGGTCACGGCACTCACTGTGCAGGCACGGTAGGGAGTAGGACCTATGGGGTAGCTAAAAAAACTCAGCTTTTTGGCGTGAAGGTACTTGATGATAATGGCTCTGGCCAGTATTCCACTATCATAGCAGGTATGGATTTCGTTGCAAGTGACCATAATAATCGTAACTGTCCAAAAGGCGTAGTCGCGAGCCTTTCACTAGGTGGAGGGTACAGTTCATCTGTAAACAGTGCGGCTGCACGTCTGCAAAGCAGCGGAGTTATGGTAGCAGTCGCAGCGGGGAATAATAATGCAGATGCTAGGAACTACTCCCCAGCGAGTGAACCGTCTGTGTGCACGGTGGGGGCCACTGATAGATATGATCGTAGGTCTTCCTTTAGCAACTACGGATCAGTCTTAGATATATTTGCACCGGGCACGAGTATCTTGTCAACATGGATAGGTGGGAGTACTAGGTCAATTTCTGGGACGTCCATGGCTACTCCACACGTCGCGGGATTGGCGGCTTACCTAATGACATTGGGCAGGACCACAGCCGCCAATGCCTGCAGATATATCGCTGATACGGCCAATAAGGGCGACCTGTCCAATATACCCTTCGGCACCGTGAATTTACTTGCTTATAATAACTATCAGGCG

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列5(SEQ ID NO.6)：GCCCCCGCCGTGGAACAACGTTCAGAAGCAGCCCCCCTTATTGAAGCAAGAGGTGAGATGGTCGCCAACAAGTATATTGTTAAGTTCAAAGAAGGAAGTGCTTTGTCCGCTTTAGATGCAGCAATGGAAAAGATTAGTGGCAAACCCGATCATGTATACAAGAATGTATTCTCCGGCTTCGCAGCTACGCTTGATGAGAATATGGTAAGAGTGCTGAGGGCACACCCCGATGTAGAATATATCGAACAAGATGCTGTGGTTACCATCAACGCAGCACAAACCAATGCCCCCTGGGGCTTAGCACGTATCAGTTCAACAAGTCCCGGAACTTCAACATACTATTACGACGAAAGTGCTGGCCAGGGATCATGCGTCTATGTCATCGACACTGGCATAGAAGCATCTCACCCCGAATTTGAGGGACGTGCACAGATGGTTAAAACATATTACGCTAGTTCTAGGGACGGAAATGGCCACGGCACCCATTGCGCCGGTACAGTCGGAAGTCGTACATACGGTGTAGCCAAGAAAACTCAATTGTTTGGCGTAAAGGTATTGGACGATAACGGAAGTGGCCAGTACTCTACCATCATTGCCGGCATGGATTTCGTCGCATCTGACCATAACAATAGAAATTGCCCTAAAGGAGTGGTGGCATCTTTGTCTCTTGGAGGAGGCTACAGTTCATCTGTCAACTCAGCTGCTGCTAGATTACAGTCATCCGGTGTAATGGTCGCAGTTGCTGCAGGAAATAATAATGCCGACGCACGTAACTATAGTCCCGCAAGTGAACCTAGTGTCTGCACTGTGGGAGCTACTGATAGGTATGATAGAAGATCATCATTTTCTAACTACGGATCAGTCCTTGACATCTTTGCCCCTGGCACATCCATCCTATCAACATGGATTGGCGGCTCAACACGTTCAATATCAGGAACTTCTATGGCAACACCTCACGTAGCTGGCTTGGCCGCTTACCTTATGACCTTGGGACGTACCACCGCAGCTAATGCTTGTAGGTATATTGCCGATACGGCTAATAAGGGAGACCTAAGTAATATTCCTTTCGGAACAGTGAACCTATTAGCTTATAACAACTACCAGGCT

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列6(SEQ ID NO.7)：GCTCCAGCTGTTGAGCAACGTTCTGAGGCTGCTCCACTGATCGAGGCTAGAGGTGAGATGGTTGCCAACAAGTACATTGTTAAGTTCAAGGAGGGTTCCGCTTTGTCTGCTTTGGATGCTGCCATGGAGAAGATCTCTGGAAAGCCAGACCACGTTTACAAGAACGTTTTCTCTGGTTTCGCTGCTACTCTTGACGAGAACATGGTTAGAGTTTTGAGAGCCCACCCAGACGTCGAATACATTGAACAAGATGCTGTTGTTACCATTAACGCTGCTCAAACTAACGCTCCATGGGGTTTGGCTAGAATCTCCTCTACTTCTCCAGGTACCTCTACTTACTACTACGATGAGTCCGCTGGTCAAGGTTCTTGTGTCTACGTTATTGATACCGGTATTGAAGCTTCCCATCCAGAGTTCGAAGGAAGAGCTCAAATGGTTAAGACTTACTACGCTTCTTCTCGTGACGGTAACGGTCATGGTACCCACTGTGCCGGTACTGTTGGTTCCAGAACCTACGGTGTTGCTAAAAAGACCCAATTGTTCGGTGTTAAGGTTTTGGATGATAACGGTTCAGGTCAATACTCTACTATTATTGCTGGTATGGACTTTGTTGCTTCCGACCATAACAACAGAAACTGTCCTAAGGGTGTTGTTGCTTCCTTGTCTTTGGGTGGTGGTTACTCTTCTTCTGTTAACTCTGCCGCTGCTAGATTGCAGTCATCCGGAGTCATGGTTGCTGTTGCTGCTGGTAACAACAACGCTGATGCTAGAAACTACTCCCCTGCTTCTGAGCCTTCTGTTTGTACCGTTGGTGCTACCGACAGATACGACAGAAGATCTTCCTTCTCTAACTACGGTTCTGTTTTGGATATCTTCGCCCCAGGTACCTCTATCCTGTCCACTTGGATTGGTGGATCTACCAGATCTATTTCCGGTACTTCTATGGCTACCCCTCACGTCGCTGGTTTGGCCGCTTACTTGATGACTTTGGGACGTACTACCGCTGCTAATGCTTGTAGATACATTGCTGACACTGCTAACAAGGGTGACTTGTCTAACATCCCATTCGGTACTGTTAACTTGCTGGCCTACAACAACTACCAAGCT

毕赤酵母密码子偏好性优化基因序列7(SEQ ID NO.8)：GCTCCTGCTGTTGAACAAAGATCTGAAGCTGCTCCATTGATCGAAGCTAGAGGTGAAATGGTTGCTAATAAGTATATTGTTAAATTTAAAGAAGGTTCTGCTTTGTCTGCTTTGGATGCTGCTATGGAAAAAATTTCTGGTAAACCTGATCATGTTTACAAAAATGTTTTTTCTGGTTTTGCTGCTACTTTGGATGAAAATATGGTTAGAGTTTTGAGAGCTCATCCTGATGTTGAATATATTGAACAAGATGCTGTTGTTACTATTAATGCTGCTCAAACTAATGCTCCATGGGGTTTGGCTAGAATTTCTTCTACTTCTCCTGGTACTTCTACTTATTACTATGATGAATCTGCTGGTCAAGGTTCTTGTGTTTATGTTATTGATACTGGTATTGAAGCTTCTCATCCTGAATTTGAAGGTAGAGCTCAAATGGTTAAAACTTATTATGCTTCTTCTAGAGATGGTAATGGTCATGGTACTCATTGTGCTGGTACTGTTGGTTCTAGAACTTATGGTGTTGCTAAAAAAACTCAATTGTTTGGTGTTAAAGTTTTGGATGATAATGGTTCTGGTCAATATTCTACTATTATTGCTGGTATGGATTTTGTTGCTTCTGATCATAATAATAGAAATTGTCCAAAAGGTGTTGTTGCTTCTTTGTCTTTGGGTGGAGGTTATTCTTCATCTGTTAATTCTGCTGCAGCTAGATTGCAATCTTCTGGTGTTATGGTTGCTGTTGCTGCTGGTAATAACAATGCTGATGCTAGAAATTATTCTCCTGCTTCTGAACCATCTGTTTGTACTGTTGGTGCTACTGATAGATATGATAGAAGATCTTCTTTTTCTAATTATGGTTCTGTTTTGGATATTTTTGCTCCTGGTACTTCAATTTTGTCTACTTGGATTGGTGGTTCTACTAGATCTATTTCTGGTACTTCTATGGCTACTCCACATGTTGCTGGTTTGGCTGCTTATTTGATGACTTTGGGTAGAACTACTGCTGCTAATGCTTGTAGATATATTGCTGATACTGCTAATAAAGGTGATTTGTCTAATATTCCATTTGGTACTGTTAATTTGTTGGCTTATAATAACTATCAAGCT

将以上述蛋白酶K的优化基因序列，分别连接至载体pPinkα-HC，由苏州金维智生物科技有限公司合成。

2、表达菌株的构建

将上述合成的质粒电转化入宿主毕赤酵母菌(PichiaPink-1)中，涂布于PAD平板，28℃倒置培养3-10d获得重组菌株。

挑取上述平板单菌落，接种于BMGY培养基中，28℃、250rpm培养至OD＝2-6，离心收集菌体，加入BMMY培养基，并每24h加入终浓度为0.5％的甲醇诱导。诱导144h后电泳及发酵液点奶粉平板检测表达情况。

结果如下图1，显示了上述7个密码子优化后编码基因的转化子的转化结果。泳道1-7对应于上述密码子优化后编码基因1-7的转化子菌株。

然后对筛选菌株发酵液点奶粉平板检测蛋白酶活性，结果如图2所示。

从结果来看，7号菌株(携带密码子偏好性优化基因序列7)电泳条带最深，奶粉平板水解圈最明显，表达量最高。

实施例2 5L发酵罐发酵

挑取表达量较高的菌株(3、6、7号菌株较高，2、4、5次之)，划线于YPD固体培养基，28℃培养3-5d直至长出单菌落。挑取单菌落于5mL YPD培养基中，28℃、250rpm培养18-24h后按1％接种量转接入100mL YPG培养基中，28℃、250rpm培养18-24h后按5％的接种量接种于装有2L BSM培养基的5L发酵罐中。

发酵条件：搅拌：200-1000rpm，温度：25-30℃，DO：20-50％(DO不足时适当通入纯氧)，pH：补甘油前不控，补甘油后pH用氨水或尿素自控4.8-5.5。补料：DO或pH反弹后启补甘油5-12g/(L*h)，OD达到180-240以后停止补加甘油，1h后开始补甲醇诱导，甲醇补料速率2-7g/(L*h)。甲醇诱导60h后放罐。

对放罐样品使用BCA法检测蛋白浓度，电泳检测蛋白表达条带如图3所示。泳道1和2为3号菌株两批次发酵结果，批次平均发酵蛋白浓度达到3.2mg/mL；泳道3和4为6号菌株两批次发酵结果，批次平均发酵蛋白浓度达到7.3mg/mL；泳道5和6为7号菌株两批次发酵结果，批次平均发酵蛋白浓度达到21.6mg/mL；泳道7为2号菌株发酵结果，泳道8为4号菌株发酵结果，泳道9为5号菌株发酵结果，蛋白含量较低。

实施例3 300L发酵罐放大与纯化

1、300L发酵罐放大

使用和5L罐相同的培养基及种子制备条件对7号菌株进行发酵。

发酵条件：初始培养基150L，搅拌100-300rpm，温度：25-30℃，DO：20-50％(DO不足时适当通入纯氧)，罐压：0.05-0.1MPa，pH：补料前不控，补料后pH用氨水或尿素自控4.8-5.5。补料：DO或pH反弹后启补甘油5-12g/(L*h)，OD达到180-240以后停止补加甘油，1h后开始补甲醇诱导，甲醇补料速率2-7g/(L*h)。甲醇诱导60h后放罐。对放罐样品使用BCA法检测蛋白浓度，最终发酵蛋白浓度达到24.16mg/mL。采用国标方法检测蛋白酶K的比活性为72.8U/mg。

2、纯化

(1)样品处理放罐后的发酵液经过碟片离心机和管式离心机两次离心后，使用超滤系统经超滤膜包浓缩6-10倍，然后使用6-8倍体积的Loading buffer超滤换液，最后经0.22μm过滤膜包过滤备用。

(2)纯化柱准备采用装有3L阳离子交换填料的层析柱进行纯化，上样前依次使用水、30％异丙醇、纯化水、1M NaOH溶液、纯化水、2M NaCl溶液、水清洗离子交换柱，流速300-3000mL/min，时间10-30min。

(3)样品纯化先使用Loading buffer平衡离子交换柱，之后上样，上样完成后再次使用Loading buffer平衡柱子，最后使用Elution buffer洗脱，洗脱时收集洗脱峰。期间流速300-3000mL/min，时间10-30min。

(4)将收集的洗脱峰再次使用超滤系统超滤浓缩，之后使用洗滤buffer换液，加入甘油及防腐剂(终浓度为0.02％的Proclin 300)保存即可。

电泳检测纯化成品，最终纯化的成品纯度较高，符合实际使用的要求。

注：纯化使用的溶液配方如下：

Loading buffer：75mM醋酸钠-醋酸缓冲液、20-80mM NaCl、5-10％甘油、5-10mMCaCl₂，pH 4.0-5.0。

Elution buffer：50mM Tris,100-500mM NaCl,5-10mM CaCl₂,10-20％甘油,pH7.4-8.0。

洗滤buffer：50mM Tris,5-10mM CaCl₂，20-50％甘油，pH 7.4-8.0。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种重组蛋白酶K编码序列，其特征在于，所述重组蛋白酶K编码序列如SEQ ID NO.8所示，或者所述重组蛋白酶K编码序列与SEQ ID NO.8相比具有至少95％的同源性。

2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的重组蛋白酶K编码序列。

3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的载体或基因组中整合有权利要求1所述的重组蛋白酶K编码序列。

4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母细胞。

6.一种制备蛋白酶K的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在适合的条件下，培养权利要求3所述的宿主细胞，从而表达出所述的蛋白酶K；和

(ii)分离所述的蛋白酶K。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为20℃-40℃。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中培养所述酵母细胞的过程中，设置转速为：200-1000rpm。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为25-30℃。