CN117701531A - 一种LbCpf1蛋白的表达及其纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种LbCpf1蛋白的表达及其纯化方法和应用，属于生物技术领域。本发明为解决现有LbCpf1蛋白纯化技术中存在周期长、操作复杂、成本高和蛋白纯度较低的技术问题，本发明提供一种LbCpf1蛋白表达及其纯化方法，所述方法以pET28a‑SUMO质粒为表达载体，利用单次镍柱与超滤管组合纯化LbCpf1蛋白，本发明纯化后的LbCpf1蛋白具有更高表达活性，本发明提供的蛋白纯化方法具有简便易操作、低成本、纯化效率较高和纯化后的蛋白质量较高等优点，并且纯化后的LbCpf1蛋白与商品化Lbcpf1蛋白活性相当，具有较好的商品性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LbCpf1蛋白的表达及其纯化方法和应用。
背景技术
CRISPR技术和相关CRISPR(Cas)蛋白为基因调控和基因组工程提供了强大的工具，不仅用于在基因编辑领域，而且在分子诊断方面也有极大的应用潜力。基于Cas蛋白的反式切割效应，已经开发出许多功能强大的CRISPR诊断方法，甚至可以区分单核苷酸多态性(SNP)。其中LbCpf1蛋白应用最为广泛，可在crRNA介导下结合靶标双链DNA(dsDNA)序列，激活顺式切割活性，同时在非特异性靶标单链DNA(ssDNA)上显示出非特异性的反式切割活性，并且LbCpf1蛋白的反式切割活性适用于开发检测病毒或者基因组突变位点的dsDNA靶标序列检测。然后为制备满足所需纯度的LbCpf1蛋白，需要对重组表达蛋白进行提取和纯化。现有技术中最常以商品化表达质粒6His-MBP-TEV-huLbCpf1制备LbCpf1蛋白，多存在纯化周期长、操作复杂、成本高和纯度低等问题。专利CN114480347A中公开一种通过两次镍柱与肝素柱组合纯化Cas12a(Cpf1)蛋白的方法，但该方法耗时约36h，且表明一次镍柱加分子筛纯化时无法去除Cas12a蛋白的高聚物，从而影响纯化效果，并且该方法操作复杂，成本较高，无法实现在较短周期内获得高纯化Cas12a蛋白。
发明内容
本发明为解决现有LbCpf1蛋白表达及纯化技术中存在周期长、操作复杂、成本高和纯化效果较差的技术问题，本发明提供一种LbCpf1蛋白的表达及其纯化方法和应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明的目的之一在于提供一种LbCpf1蛋白的表达及纯化方法，所述方法包括以下步骤：
通过表达载体表达带有His标签的LbCpf1蛋白，经离心后获得含LbCpf1蛋白的上清液，然后使用单次镍柱和超滤浓缩管对上述LbCpf1蛋白上清液进行纯化及浓缩，获得纯化后的LbCpf1蛋白。
进一步限定，所述的表达载体质粒为pET28a-SUMO。
进一步限定，所述的His标签连接在LbCpf1蛋白的N-末端或C-末端。
进一步限定，所述的LbCpf1蛋白包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步限定，所述的镍柱为镍离子亲和层析柱。
进一步限定，所述的超滤管的截留分子量为30kDa。
进一步限定，所述的单次镍柱纯化步骤中，使用缓冲液A进行水洗，使用缓冲液B和缓冲液C以1.0-2.0mL/min进行线性洗脱；所述缓冲液pH值为pH＝7.5-8.2。
更进一步限定，所述的缓冲液A包含50mM TrisHCl，pH＝7.5，20mM咪唑，500mMNaCl，0.5mM TCEP；
所述的缓冲液B包含40-50mM TrisHCl、20-60mM咪唑、300-500mM NaCl和0.4-0.6mM TCEP；
所述的缓冲液C包含40-50mM Tris HCl、280-320mM咪唑、300-500mM NaCl和0.4-0.6mM TCEP。
本发明的目的之二在于提供一种按照上述方法获得的LbCpf1蛋白。
本发明的目的之三在于提供一种按照上述方法获得的LbCpf1蛋白在猫疱疹病毒检测中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明以pET28a-SUMO质粒为LbCpf1蛋白表达载体，采用单次镍柱对LbCpf1蛋白进行纯化处理，其中镍柱为镍离子亲和层析柱，具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，结合超滤管对经过镍柱纯化后的LbCpf1蛋白进一步纯化浓缩，其目的在于浓缩LbCpf1蛋白及滤掉小分子杂蛋白，从而提高LbCpf1蛋白纯度，并且发现pET28a-SUMO质粒在LbCpf1蛋白纯化过程中发挥一定的作用，使得本发明纯化后的LbCpf1蛋白相较于传统纯化方法获得的LbCpf1蛋白，具有更高的LbCpf1蛋白质量，纯化效果更好，具体表现为：
(1)具有较高的蛋白纯度，本发明表达及纯化的LbCpf1蛋白纯度为94.55％，是传统纯化方法获得的LbCpf1蛋白纯度的1.55倍，是商品化LbCpf1蛋白纯度的1.4倍；
(2)具有较高的蛋白活性，本发明表达及纯化的LbCpf1蛋白活性远远高于传统单次镍柱纯化方法获得的LbCpf1蛋白活性，与商品化LbCpf1蛋白活性相近，具有较好的商品性。
2、本发明提供的纯化方法减少了现有同类技术中对镍柱的使用次数，避免了最为费时费力和极易造成蛋白损耗的蛋白标签切除、肝素柱破除高聚体和凝胶过滤纯化等步骤，简化了蛋白纯化步骤，同时降低了蛋白纯化成本；本发明提供的蛋白纯化时间约为20h，相较于传统单次镍柱纯化方法的蛋白纯化时间缩短了12h，提高了蛋白纯化效率，降低了因纯化时间过长造成的蛋白损耗，从而提高了蛋白纯化质量，达到了在短周期内高效、高质量纯化LbCpf1蛋白。
附图说明
图1为实施例1中LbCpf1蛋白表达结果；
图2为实施例2中LbCpf1蛋白纯化方法各步骤获得的蛋白样本的PAGE胶和考马斯亮蓝染色检测结果，其中1泳道为分子量标志物，2泳道为镍柱纯化流穿液，3-5泳道为镍柱纯化洗涤液，6-8泳道为镍柱纯化的洗脱液；
图3为实施例3中纯化后的LbCpf1蛋白活性测定结果；
图4为实施例3中纯化后的LbCpf1蛋白与商品化LbCpf1蛋白活性比对结果；其中，纵坐标Fluorescence signal为荧光信号值；
图5为实施例4中纯化后的LbCpf1蛋白灵敏性检测结果；
图6为实施例4中纯化后的LbCpf1蛋白特异性检测结果；
图7为对比例1中pMBP-LbCpf1蛋白表达结果；
图8为对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白纯化方法各步骤获得的蛋白样本的PAGE胶和考马斯亮蓝染色检测结果，其中1泳道为分子量标志物，2泳道为镍柱纯化流穿液，3-5泳道为镍柱纯化洗涤液，6-8泳道为镍柱纯化的洗脱液；
图9为实施例2中纯化后的LbCpf1蛋白与对比例2中纯化后的pMBP-LbCpf1蛋白活性比对结果；其中，纵坐标Fluorescence signal为荧光信号值；
图10中A部分为实施例2中LbCpf1蛋白、对比例2中以pMBP-LbCpf1蛋白和商品化LbCpf1蛋白样本的PAGE胶和考马斯亮蓝染色检测结果，其中1泳道为分子量标志物，2泳道为商品化LbCpf1蛋白样本，3泳道为pMBP-LbCpf1蛋白样本，4泳道为本发明表达及纯化的LbCpf1蛋白样本；B部分为实施例2中LbCpf1蛋白、对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白和商品化LbCpf1蛋白样本薄层扫描分析结果图；
图11为实施例2中LbCpf1蛋白、对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白和商品化LbCpf1蛋白样本活性检测结果图，其中，纵坐标Fluorescence signal为荧光信号值。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：LbCpf1蛋白的表达
S1：使用BamHI和HindIII引物对pET28a-SUMO载体质粒进行双酶切，然后利用T4连接酶进行切割位点酶切连接反应，获得酶切连接反应产物，对产物进行转化DH5α感受态细胞，挑选单克隆进行测序鉴定；
S2：取感受态细胞Rosetta(DE3)在冰上融解，然后取1μL S1中获得的pET28a-LbCpf1表达载体质粒，加入到50μL感受态细胞中，冰浴30min，然后42℃热激45s，迅速平稳放回冰中2min；随后添加700μL不含抗生素的无菌培养基，混合均匀，37℃振荡培养1h，吸取约20μL菌液均匀涂布到含50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的LB琼脂培养基平板中，37℃培养过夜；挑取菌落，转移至含50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素培养基中，过夜培养，获得饱和菌液；
S3：取4mL S2中获得的饱和菌液加入到250mL含50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素培养基中，37℃培养至OD值0.6，然后加入IPTG(终浓度为0.4mM)，16℃表达过夜；4℃，5000rpm离心10min，弃去上清液，获得含有LbCpf1蛋白的菌体，80℃保存，并对获得的蛋白进行Western-blot鉴定。
LbCpf1蛋白表达结果如图1所示，以pET28a-SUMO为载体的LbCpf1蛋白成功表达
实施例2：LbCpf1蛋白的纯化
S1：冰上解冻实施例1中获得的含有LbCpf1蛋白的菌体，按照1:4体积加入裂解缓冲液(50mM TrisHCl，pH＝7.5，20mM咪唑，500mM NaCl，0.5mM TCEP)、1:100蛋白酶抑制剂重悬菌体，然后在冰水浴条件下超声破碎，超声功率80W，5s开，5s关，工作时间为30min，超声完毕后，13000rpm高速离心30min，吸取上清液，获得含LbCpf1蛋白的上清液；
S2：纯化蛋白缓冲液的配置：
缓冲液A(50mM TrisHCl，pH＝7.5，20mM咪唑，500mM NaCl，0.5mM TCEP)；
缓冲液B(50mM Tris HCl，pH＝7.5，50mM咪唑，500mM NaCl，0.5mM TCEP)；
缓冲液C(50mM TrisHCl，pH＝7.5，300mM咪唑，500mM NaCl，0.5mM TCEP)；
缓冲液D(20mM HEPES，pH 7.5，0.5mM TCEP，150mM NaCl，50％(v/v)甘油)；
S3：利用双蒸水水洗5个柱体积，再利用缓冲液A平衡镍柱填料5个柱体积，然后添加S1中获得的蛋白上清液，上样量约为30mL，并保留部分流穿液以备电泳；上样完成后先用缓冲液A水洗5个柱体积，然后以1.0mL/min速率用缓冲液B继续清洗镍柱3次，每次2个柱体积，每次保留部分洗涤液以备电泳；最后以1.0mL/min的速率用缓冲液C开始洗脱蛋白，洗脱3次，每次2个柱体积，每次保留40μL洗脱液以备电泳，获得合并收集到的镍柱蛋白纯化样品；
S4：将S3中获得的镍柱蛋白纯化样品加载到30kDa超滤管中，超滤至4mL，取部分样品进行BCA蛋白浓度测定；加载2mL缓冲液D后继续进行超滤，超滤至4mL，多次加载直至95％以上缓冲液C更换成缓冲液D，获得纯化后的LbCpf1蛋白，最后分装冻至-80℃。
对本实施例S3步骤中获得的流穿液、洗涤液和洗脱液，分别进行PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色检测，结果如图2所示，纯化后洗脱液中含有LbCpf1蛋白，大小约160kDa，蛋白浓度较高，经BCA蛋白浓度测定约为3.98mg/mL。
实施例3：LbCpf1蛋白活性检测
将实施例2中获得的100nM LbCpf1、100nM crRNA(如SEQ ID NO.2所示)、500nMFAM TTATTBHQ1探针和100ng/μL靶标质粒添加到1×缓冲液(10mM NaCl，10mM Tris-HCl，15mM MgCl2,0.05％ Tween-20,1mM DTT,pH 9.0)中，设置不同成分缺失对照组，37℃孵育50min，并利用ABI7500记录荧光数据。
蛋白活性检测结果如图3所示，结果表明本实施例纯化后的LbCpf1蛋白仅在各成分均不缺失的情况下才具有活性；将本实施例纯化后的LbCpf1蛋白样品与商品化LbCpf1蛋白单独进行活性对比，结果如图4所示，本实施例纯化后的LbCpf1蛋白活性与商品化LbCpf1蛋白活性相近，具有较高的蛋白活性，表明本实施例纯化后的蛋白活性符合商品化要求。
实施例4：LbCpf1蛋白在猫疱疹病毒检测中的应用
1、灵敏性检测
S1：将猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus1，FHV-1)TK核酸序列(如SEQ ID NO.3所示)克隆到pET-30α质粒中(可委托上海生工操作)，用Nanodrop 2000测浓度，计算拷贝数；
S2：制备重组质粒工作标准品，分别为：
工作标准品1浓度为1.42×102Copies/μL的FHV-1TK基因的重组质粒；
工作标准品2浓度为1.42×101Copies/μL的FHV-1TK基因的重组质粒；
工作标准品3浓度为1.42×100Copies/μL的FHV-1TK基因的重组质粒；
工作标准品4浓度为1.42×10-1Copies/μL的FHV-1TK基因的重组质粒；
工作标准品5浓度为1.42×10-2Copies/μL的FHV-1TK基因的重组质粒；
S3：按RT-RAA(RT-基础型核酸扩增试剂，杭州众测生物科技有限公司)说明书所述的扩增体系：Buffer A25μL、Buffer B 2.5μL、100nM F/R(SEQ ID NO.4-5)和DEPC H2O13.5μL使冻干粉溶解，在1.5ml EP管中混合均匀配制反应液(按4个反应进行配制)，然后吸取20μL分别加入到6个RAA反应试剂试管；随后向上述6个反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准工作品5、5μL标准工作品4、5μL标准工作品3、5μL标准工作品2和5μL标准工作品1为模板，加样完成后将每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为25μL，42℃反应20min；
S4：将实施例2中获得的100nM LbCpf1蛋白、100nM crRNA(如SEQ ID NO.6所示)、500nM FAMTTATTBHQ1探针添加到1×缓冲液(10mM NaCl、10mM Tris-HCl、15mM MgCl2、0.05％ Tween-20、1mM DTT，pH＝9.0)中，待RAA扩增结束后将RAA扩增产物均添加至LbCpf1反应体系中，37℃孵育20min，通过蓝光照射装置观测荧光信号强度进行结果判读。
灵敏性检测结果如图5所示，RAA-CRISPR/Cpf1方法的最低检测限为1.42copies/μL，结果表明实施例2中获得的纯化后的LbCpf1蛋白活性能够满足体外检测要求，通过本发明提供的表达及纯化方法得到的LbCpf1蛋白，具有较好的灵敏性。
2、特异性检测
按照上述灵敏性检测方法对6种常见的宠物病毒，包括猫杯状病毒(Felinecalicivirus,FCV)、猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)、猫冠状病毒(Felinecoronavirus,FCoV)、犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)、犬副流感病毒(Canineparainfluenza virus,CPIV)和FHV-1进行特异性检测，设置无酶水作为阴性对照。
特异性检测结果如图6所示，仅有FHV-1呈现阳性，其他5种病毒检测结果均为阴性，证明实施例2中纯化后的LbCpf1蛋白具有良好活性的同时在体外检测应用中表现出良好的特异性。
对比例1：pMBP-LbCpf1蛋白的表达
本对比例与实施例1的区别之处在于，表达质粒为6His-MBP-TEV-huLbCpf1(购买于Addgene)，其他与实施例1相同。
为清楚描述不同载体表达的LbCpf1蛋白，将实施例1中以pET28a-SUMO为载体表达的LbCpf1蛋白命名为pET28a-LbCpf1，将对比例1中以6His-MBP-TEV-huLbCpf1为载体表达的LbCpf1蛋白命名为pMBP-LbCpf1。
pMBP-LbCpf1蛋白表达结果如图7所示，商品化表达质粒6His-MBP-TEV-huLbCpf1成功表达pMBP-LbCpf1蛋白。
对比例2：pMBP-LbCpf1蛋白的纯化
本对比例与实施例2的区别之处在于，采用的菌体为对比例1中获得的含有以6His-MBP-TEV-huLbCpf1质粒为表达载体的pMBP-LbCpf1蛋白，其纯化方法与实施例2相同。
对本实施例中获得的流穿液、洗涤液和洗脱液进行PAGE胶电泳和考马斯亮蓝染色检测，结果如图8所示，纯化后洗脱液中含有pMBP-LbCpf1蛋白，大小约190kDa，目的蛋白的浓度较低，经BCA蛋白浓度测定为0.202mg/mL，且相较于实施例2洗脱液中的pET28a-LbCpf1蛋白的纯度较低；并将实施例2中获得的纯化后的pET28a-LbCpf1蛋白与本实施例中纯化后的pMBP-LbCpf1蛋白进行等量活性比对，结果如图9所示，结果表明pET28a-LbCpf1蛋白活性远高于pMBP-LbCpf1蛋白，进一步证明以pET28a-SUMO质粒为表达载体在蛋白纯化过程中发挥一定的作用，从而达到了在短周期内，高质量纯化LbCpf1蛋白的目的。
本发明对实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白、对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白和商品化的LbCpf1蛋白集中进行PAGE胶电泳和考马斯亮蓝染色检测，本发明所表达的LbCpf1蛋白与商品化LbCpf1蛋白来源于同一菌种，并且通过薄层扫描对上述3种蛋白样本进行纯度检测，结果如图10所示，实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白纯度为94.55％，对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白纯度为61.13％，商品化LbCpf1蛋白纯度为67.61％，结果证明本发明表达及纯化后的pET28a-LbCpf1蛋白纯度是pMBP-LbCpf1蛋白纯度的1.55倍，是商品化LbCpf1蛋白纯度的1.4倍，具有较高的蛋白纯度。
本发明结合实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白、对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白和商品化的LbCpf1蛋白测定的BCA蛋白浓度，将其换算定量至5mM，同实施例3中的活性鉴定方法进行蛋白活性鉴定，结果如图11所示，实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白活性远远高于对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白活性，此结果与实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白与对比例2中pMBP-LbCpf1蛋白单独活性检测结果相同，如图9所示，进一步证明实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白具有较高的蛋白活性，因此，在LbCpf1蛋白发挥相同作用效果的条件下，本发明提供的pET28a-LbCpf1蛋白的添加量将远远小于pMBP-LbCpf1蛋白的添加量，很大程度降低了使用成本，提高了LbCpf1蛋白的作用效率。
但实施例2中pET28a-LbCpf1蛋白与商品化LbCpf1蛋白单独活性检测结果与此结果存在差异，如图4所示，单独活性检测结果表明pET28a-LbCpf1蛋白与商品化LbCpf1蛋白活性相近；如图11所示，集中活性检测结果显示pET28a-LbCpf1蛋白活性低于商品化LbCpf1蛋白活性，分析可能是由于集中活性检测与单独活性检测的操作流程存在一定差异，以及检测环境的影响，从而导致活性检测结果前后存在差异，但本发明提供的pET28a-LbCpf1蛋白活性仍远远高于pMBP-LbCpf1蛋白活性，并且最接近于商品化LbCpf1蛋白活性，可见，本发明提供的pET28a-LbCpf1蛋白具有较高的蛋白活性，从而在应用中能够达到降低使用成本，提高作用效率的目的。
本发明说明书中未详细描述内容为本领域技术人员公知技术。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种LbCpf1蛋白的表达及其纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
通过表达载体表达带有His标签的LbCpf1蛋白，经离心后获得含LbCpf1蛋白的上清液，然后使用单次镍柱和超滤浓缩管对上述LbCpf1蛋白上清液进行纯化及浓缩，获得纯化后的LbCpf1蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体质粒为pET28a-SUMO。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的His标签连接在LbCpf1蛋白的N-末端或C-末端。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LbCpf1蛋白包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的镍柱为镍离子亲和层析柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超滤管的截留分子量为30kDa。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单次镍柱纯化步骤中，使用缓冲液A进行水洗，使用缓冲液B和缓冲液C以1.0-2.0mL/min进行线性洗脱；所述缓冲液pH值为pH＝7.5-8.2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液A包含50mM Tris HCl，pH＝7.5，20mM咪唑，500mM NaCl，0.5mM TCEP；
所述的缓冲液B包含40-50mM Tris HCl、20-60mM咪唑、300-500mM NaCl和0.4-0.6mMTCEP；
所述的缓冲液C包含40-50mM Tris HCl、280-320mM咪唑、300-500mM NaCl和0.4-0.6mMTCEP。
9.权利要求1-8任一项所述的方法获得的LbCpf1蛋白。
10.权利要求1-8任一项所述的方法获得的LbCpf1蛋白在猫疱疹病毒检测中的应用。
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