CN117695394A - Setdb1抑制剂在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及Setdb1抑制剂在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的应用。所述器官包括心脏和肺，本发明结合体外、体内模型，发现敲除Setdb1基因或抑制Setdb1能够减轻心、肺纤维化水平，SETDB1有望成为治疗多器官纤维化的新靶点，并为目前除肺外其他器官尚无特异性药物治疗纤维化的现状提供潜在治疗方案。

Description

Setdb1抑制剂在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及Setdb1抑制剂在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的应用。

背景技术

器官纤维化(Organ Fibrosis)是一种在多种类型组织损伤尤其是在慢性炎症性疾病过程中，组织中成纤维细胞(Fibroblast)活化成为肌成纤维细胞(Myofibroblast)并造成细胞外基质过度沉积，导致组织结构和功能的改变，器官功能障碍和衰竭的修复失调结局。器官纤维化可以影响多种器官如心脏、肺脏、肾脏、皮肤、肝脏等，据统计因纤维化引起的死亡人数占总死亡人数比例的45％，严重影响人类的健康和生活质量。

器官纤维化的发生是一个高度复杂、异质且动态的过程，由于对其机制的不充分了解，针对器官纤维化本身的治疗方案和手段仍非常局限。目前仅有少数药物被批准用于治疗特发性肺纤维化(IPF)如吡非尼酮，尼达尼布等，但是它们大多疗效有限，治疗机制未明确且存在众多不良反应。而针对其他器官纤维化则尚无特异性的药物可用。

抑制受损组织中成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化被认为是抑制器官纤维化的可行方式。结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶1(SET Domain Bifurcated HistoneLysine Methyltransferase 1，Setdb1)是一种H3组蛋白9号赖氨酸位点的三甲基化酶，其参与的H3K9me3表观遗传学修饰被认为是异染色质的标志，在维持基因组稳定和细胞命运及功能方面发挥重要作用。但是截止目前尚未见Setdb1参与器官纤维化的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供Setdb1抑制剂的新用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供Setdb1抑制剂在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的应用。

本发明通过TGF-β1诱导离体心脏成纤维细胞活化，经小干扰RNA敲低Setdb1，抑制了心肌成纤维细胞活化；通过AngII/PE或博莱霉素诱导小鼠模型心脏纤维化、特发性肺纤维化，在体敲除成纤维细胞Setdb1后，减轻了AngII/PE诱导的病理性心脏纤维化和博来霉素诱导的肺纤维化，表明SETDB1可以作为治疗多器官纤维化的新靶点。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述器官包括心脏和肺。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述抑制剂为：

针对Setdb1基因的shRNA、siRNA；

针对Setdb1基因的小分子化合物；

实施Setdb1基因敲除的慢病毒、腺病毒；或

针对Setdb1蛋白特异的抗体。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明提供所述Setdb1作为标志物在制备器官纤维化检测和/或疗效评价试剂中的应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述器官包括心脏和肺。

在本发明的一具体实施例中，利用TGF-β1诱导心脏成纤维细胞活化，经qPCR检测发现，Setdb1在TGF-β1处理后表达水平显著升高，且伴随心脏成纤维细胞活化、迁移和收缩水平升高。

第二方面，本发明提供一种治疗和/或预防器官纤维化的药物，所述药物包含所述siRNA。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物还包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括常规的稀释剂、pH调节剂，如注射用水、枸橼酸钠等。

本发明具有如下有益效果：

本发明结合体外、体内模型，发现敲除Setdb1基因或抑制Setdb1能够减轻心、肺纤维化水平，SETDB1有望成为治疗多器官纤维化的新靶点，并为目前除肺外其他器官尚无特异性药物治疗纤维化的现状提供潜在治疗方案。

本发明创新性提出了通过调控表观遗传学修饰分子SETDB1治疗器官纤维化的新思路和新方向。

附图说明

图1为qPCR评估TGF-β1诱导的离体心脏成纤维细胞活化标志物表达水平的统计图，图中，Nc：转染对照siRNA，Si：转染si-Setdb1；Nc+T：转染对照siRNA并TGF-β1处理，Nc+T：转染si-Setdb1并TGF-β1处理。

图2为免疫荧光评估TGF-β1诱导的离体心脏成纤维细胞活化标志物aSMA表达结果。

图3为划痕实验评估TGF-β1诱导的离体心脏成纤维细胞迁移表型结果。

图4为Transwell实验评估TGF-β1诱导的离体心脏成纤维细胞迁移表型结果。

图5为胶收缩实验评估TGF-β1诱导的离体心脏成纤维细胞收缩表型结果。

图6为Masson染色评估AngII/PE诱导的在体心脏纤维化水平结果。

图7为免疫荧光评估AngII/PE诱导的在体心脏肌成纤维细胞活化标志物aSMA表达结果。

图8为免疫荧光评估AngII/PE诱导的在体心脏肌成纤维细胞活化标志物POSTN表达结果。

图9为天狼猩红染色评估博莱霉素诱导的在体肺纤维化水平结果。

图10为免疫荧光评估博莱霉素诱导的在体肺肌成纤维细胞活化标志物aSMA表达结果。

图11为免疫荧光评估博莱霉素诱导的在体肺肌成纤维细胞活化标志物POSTN表达结果。

图12为SETDB1-TTD-IN-1的化学结构式。

图13为免疫荧光评估AngII/PE诱导的在体心脏纤维化水平结果。

图14为免疫荧光评估AngII/PE诱导的在体心脏肌成纤维细胞活化标志物aSMA表达结果。

图15为免疫荧光评估AngII/PE诱导的在体心脏肌成纤维细胞活化标志物POSTN表达结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：离体敲低心肌成纤维细胞Setdb1抑制心肌成纤维细胞活化

1实验方法

1.1si-Setdb1构建

委托北京擎科有限公司合成Setdb1小干扰RNA(siRNA)及对照siRNA，序列如下：

si-Setdb1(SEQ ID NO.1)：5'-GCAAGAACCCUCUAUUAGU-3'(dT)；

1.2si-Setdb1转染心脏成纤维细胞

使用Xfect RNA Transfection Reagent试剂盒(Clontech,Code No.631450)向心肌成纤维细胞转染si-Setdb1：

(1)配置转染试剂：以6孔板1个孔为例

EP管-1：加入si-Setdb1 RNA 10nmol，Xfect Reaction Buffer补至100μl；

EP管-2:加入Xfect RNA Transfection Polymer 10μl，Xfect Reaction Buffer补至100μl；

对照RNA序列配制同理：

将EP管-1，EP管-2混合，摇匀，室温静置15min等待转染颗粒形成。

(2)心脏成纤维细胞准备

a)弃去原有培养液，PBS洗涤细胞2遍，弃上清；

b)6孔板每孔加入2ml Opti-MEM减血清培养基(Gibco，31985070)；

(3)心脏成纤维细胞si-Setdb1，Nc-Setdb1转染

a)转染颗粒形成后，6孔板每孔加入200μl混合后的转染试剂；

b)将细胞放入37℃CO₂孵箱转染5h；

c)5h后弃上清，PBS洗涤细胞2遍，换液10％ FBSDMEM培养基，37℃CO₂孵箱孵育24h。

1.3细胞饥饿处理

转染后24h，弃去原培养基，PBS洗涤细胞2遍，换液0％ FBSDMEM培养基，37℃CO₂孵箱孵育过夜。

1.4TGF-β1诱导心脏成纤维细胞活化

(1)饥饿处理过夜后，弃去原培养基，PBS洗涤细胞2遍，换液10％ FBS DMEM培养基；

(2)以6孔板为例，每孔加入TGF-β1因子(Novoprotein，Cat.No.:CK33)至10ng/ml浓度，37℃CO₂孵箱孵育48h。

1.5检测心肌成纤维细胞活化标志物和表型

(1)qPCR检测心脏成纤维细胞活化标志物(Setdb1、Postn、Acta2)的表达水平。

(2)免疫荧光(IF)检测心脏成纤维细胞活化标志物aSMA的表达。

(3)划痕实验检测心脏成纤维细胞的迁移表型。

(4)Transwell实验检测心脏成纤维细胞的迁移表型。

(5)胶收缩实验检测心脏成纤维细胞的收缩表型。

(Si：si-Setdb1；T：TGF-β1)

2实验结果

如图1所示，敲低Setdb1降低了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞活化标志物的表达水平。

如图2所示，敲低Setdb1降低了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞活化标志物aSMA的表达。

如图3、图4所示，敲低Setdb1抑制了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞的迁移表型。

如图5所示，敲低Setdb1抑制了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞的收缩表型。

综上，AAV9-Tcf21-Cre转染Setdb1 flox/flox小鼠实现成纤维细胞Setdb1特异性敲除(Setdb1 cKO)，减轻了AngII/PE诱导的病理性心脏纤维化和博来霉素诱导的肺纤维化。

实施例2：在体敲低或抑制成纤维细胞SETDB1减轻心脏纤维化、特发性肺纤维化

1实验方法

方案(一)：AAV9-Tcf21-Cre病毒特异性敲除Setdb1-flox/flox小鼠(c57BL6J)成纤维细胞Setdb1

(1)Setdb1-flox/flox小鼠构建

委托上海南方模式生物有限公司构建Setdb1-flox/flox小鼠(c57BL6J)。

(2)AAV9-Tcf21-Cre病毒构建

委托汉恒科技公司构建用于敲除Setdb1-flox/flox小鼠Setdb1基因的AAV9-Tcf21-Cre病毒。

(3)Setdb1-flox/flox鼠中表达AAV9-Tcf21-Cre病毒

1×10¹¹vg/只的剂量AAV9-Tcf21-Cre病毒内眦静脉注射到Setdb1-flox/flox 6周小鼠中，表达1周。

(4)构建AngII/PE诱导的心脏纤维化小鼠模型

注射病毒1周后，小鼠背侧皮下包埋渗透泵(Alzet，2004)给予血管紧张素II(AngII)：1.5μg/g/d和苯肾上腺素(PE):50μg/g/d，2周后利用免疫荧光法、天狼猩红染色、Masson染色等方法评估心脏肌成纤维细胞状态和心脏纤维化程度。

评估心脏纤维化程度，包括免疫荧光、天狼猩红染色。

(5)构建博莱霉素诱导的特发性肺纤维化小鼠模型

注射病毒1周后，小鼠气管内注射1.5μg/g博莱霉素，4周后利用免疫荧光法、天狼猩红染色、Masson染色等方法评估肺纤维化程度。结果：如图6所示，在体敲除心脏成纤维细胞Setdb1表达减轻了AngII/PE诱导的心脏纤维化。

如图7、图8所示，在体敲除心脏成纤维细胞Setdb1表达减轻了AngII/PE诱导的心脏肌成纤维细胞活化。

如图9所示，在体敲除成纤维细胞Setdb1表达减轻了博莱霉素诱导的肺纤维化。

如图10，如11所示，在体敲除成纤维细胞Setdb1表达减轻了博莱霉素诱导的肺肌成纤维细胞活化。

方案(二)：SETDB1抑制剂TTD抑制小鼠(c57BL6J)成纤维细胞中SETDB1

SETDB1-TTD-IN-1(以下或简称为TTD)是一种有效，选择性和内源性结合剂竞争性的SETDB1-TTD抑制剂，结构式如图12所示，K_d值为88nM。SETDB1-TTD-IN-1可用于SETDB1-TTD关联的生物学功能和疾病的研究。

(1)构建博莱霉素诱导的特发性心脏纤维化小鼠模型

小鼠背侧皮下包埋渗透泵(Alzet，2004)给予血管紧张素II(AngII)：1.5μg/g/d，苯肾上腺素(PE):50μg/g/d，每3天经腹腔注射10μg/g TTD，2周后评估心脏纤维化程度。

(2)构建博莱霉素诱导的特发性肺纤维化小鼠模型

小鼠气管内注射1.5μg/g博莱霉素，每3天经腹腔注射10μg/g TTD，4周后评估肺纤维化程度。

2实验结果

如图13所示，TTD减轻了AngII/PE诱导的心脏纤维化。

如图14所示，TTD减轻了AngII/PE诱导的心脏肌成纤维细胞活化。

如图15所示，TTD减轻了AngII/PE诱导的心脏肌成纤维细胞活化。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.Setdb1抑制剂在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述器官包括心脏。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述器官包括肺。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为：

针对Setdb1基因的shRNA、siRNA；

针对Setdb1基因的小分子化合物；

实施Setdb1基因敲除的慢病毒、腺病毒；或

针对Setdb1蛋白的特异性抗体。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物包括SETDB1-TTD-IN-1。

7.权利要求1中所述Setdb1作为标志物在制备器官纤维化检测和/或疗效评价试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述器官包括心脏和肺。

9.一种治疗和/或预防器官纤维化的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求5中所述siRNA。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体。