CN111012780A - 小檗碱在防治牙髓炎中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了小檗碱在防治牙髓炎中的应用。小檗碱能够促进LPS‑HDPF细胞增殖，降低炎症因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的表达水平，且上调miR‑21表达水平，下调KBTBD7的表达水平；过表达miR‑21或沉默KBTBD7可加强BBR对LPS‑HDPF细胞增殖的促进作用，显著性抑制炎症因子水平；miR‑21靶向负调节KBTBD7；在BBR处理LPS‑HDPF细胞中，miR‑21inhibitor促进IKK、p65磷酸化水平，抑制IκBα蛋白的表达，沉默KBTBD7抑制IKK、p65磷酸化水平，促进IκBα蛋白的表达。

Description

小檗碱在防治牙髓炎中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及到一种小檗碱在防治牙髓炎中的应用。
背景技术
牙髓炎是指发生于牙髓组织的炎性病变。牙髓是主要包含神经血管的疏松结缔组织，位于牙齿内部的牙髓腔内。深龋、楔状缺损等牙体硬组织疾病如不能得到及时有效地控制和治疗，均可引发牙髓炎，成为口腔中最为多发和常见的疾病之一。专利CN107970259A公开了一种治疗急性牙髓炎的药物组合物，其包括吗啉硝唑、人工牛黄和苦参碱，实验结果表明，三种药物具有显著的协同作用，具有良好的抗菌抗炎效果。专利CN106047908B公开了靶向人JNK1基因的小干扰RNA及其应用，该RNA能在JNK1基因的转录后进行干扰，降低炎症牙髓干细胞中p-JNK的表达，特异性降低牙髓干细胞的凋亡，促进牙髓干细胞的成牙本质分化，可为治疗牙髓炎提供新的方案。
成纤维细胞是来源于疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，而牙髓成纤细胞作为牙髓中的主体细胞，故又称为牙髓细胞，它在牙髓组织创伤修复过程中发挥重要作用，其合成的基质包绕和支持着牙髓组织中各种有形成分，并且是血管和细胞之间传递营养和废料的重要介质，同时，对于抵抗外界的细菌和毒素产物，牙髓细胞在牙髓组织中又是一道先天屏障发挥作用。因此，牙髓细胞的健康状态往往反映了牙髓活动及抵御外界有害刺激的潜能。
小檗碱(BBR)，是从我国传统中药黄连中提取出的生物碱。小檗碱一直作为抗感染药物应用于临床，其不但具有抗菌作用，对病毒和真菌感染有一定的作用。多年的临床研究发现，小檗碱可用于治疗阿尔兹海默症、帕金森病、抑郁症、肺动脉高压等疾病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治牙髓炎的药物。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
小檗碱在防治牙髓炎中的应用。
小檗碱在防治内毒素脂多糖(LPS)诱导的牙髓炎中的应用。小檗碱能够促进LPS-HDPF细胞增殖，降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，且上调miR-21表达水平，下调KBTBD7的表达水平；过表达miR-21或沉默KBTBD7可加强BBR对LPS-HDPF细胞增殖的促进作用，显著性抑制炎症因子水平；miR-21靶向负调节KBTBD7；在BBR处理LPS-HDPF细胞中，miR-21inhibitor促进IKK、p65磷酸化水平，抑制IκBα蛋白的表达，沉默KBTBD7抑制IKK、p65磷酸化水平，促进IκBα蛋白的表达。
所述小檗碱的有效剂量≥25uM。
一种防治牙髓炎的药物，有效成分为小檗碱，小檗碱通过miR-21/KBTBD7轴调控NF-κB信号通路促进LPS-HDPF细胞增殖，抑制细胞炎症水平，达到调控人牙髓成纤维细胞炎症因子的分泌的目的。
所述防治牙髓炎的药物还包括药学上可接受的赋型剂，所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
用于本发明药物组合物的赋型剂是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
本发明涉及的药物组合物可配制成若干种剂型，例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。
本发明涉及的药物组合物可以制成药物、食品、保健食品、饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂。
本发明与现有技术相比，小檗碱通过miR-21/KBTBD7轴调控NF-κB信号通路促进LPS-HDPF细胞增殖，抑制细胞炎症水平，这为如何调控人牙髓成纤维细胞炎症因子的分泌提供了新的机制，对防治牙髓炎具有十分重要的意义。
附图说明：
图1为实施例1中第4代HDPF细胞的显微镜照片，其中(A)显微镜观察分离培养的HDPF细胞形态图；(B)免疫细胞化学检测HDPF中波形蛋白特征图；(C)免疫细胞化学检测HDPF中角蛋白特征图；(D)免疫细胞化学检测FSP的表达图；(E)免疫细胞化学检测Stro-1的表达图。
图2为实施例1中不同浓度LPS诱导后HDPF的MTT曲线图。
图3为实施例1中不同浓度LPS诱导后HDPF细胞经EdU荧光染色得到的高倍显微镜照片(左)及MetaXpress软件分析细胞平均荧光强度图(右)，定量为EdU阳性细胞数量。
图4为实施例1中ELISA检测不同浓度LPS诱导后HDPF细胞上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量图，其中，*P<0.05。
图5为实施例2不同处理组HDPF细胞的MTT曲线图。
图6为实施例2中不同处理组HDPF细胞经EdU荧光染色得到的高倍显微镜照片(左)及MetaXpress软件分析细胞平均荧光强度图(右)，定量为EdU阳性细胞数量。
图7为实施例2中ELISA检测不同处理组HDPF细胞上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量图。
图8为实施例2中不同处理组HDPE细胞经定量RT-PCR检测miR-21(左)和KBTBD7mRNA(右)的表达水平图。
图9为实施例2中不同处理组HDPF细胞经Western blot检测KBTBD7蛋白表达水平图。
图10为实施例2中不同处理组HDPF细胞的显微镜照片。
图11为实施例3中不同处理组HDPE细胞经定量RT-PCR检测miR-21(左)和KBTBD7mRNA(右)的表达水平图。
图12为实施例3中不处理同组HDPF细胞经Western blot检测KBTBD7蛋白表达水平图。
图13为实施例3中不同处理组HDPF细胞的MTT曲线图。
图14为实施例3中不同处理组HDPF细胞的MTT曲线图。
图15为实施例3中不同处理组HDPF细胞经EdU荧光染色得到的高倍显微镜照片(左)及MetaXpress软件分析细胞平均荧光强度图(右)，定量为EdU阳性细胞数量。
图16为实施例3中不同处理组HDPF细胞经EdU荧光染色得到的高倍显微镜照片(左)及MetaXpress软件分析细胞平均荧光强度图(右)，定量为EdU阳性细胞数量。
图17为实施例3中ELISA检测不同处理组HDPF细胞上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量图。
图18为实施例3中ELISA检测不同处理组HDPF细胞上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量图。
图19为生物信息学软件Starbase预测KBTBD7与miR-21-5p的靶向位点及设计的KBTBD7突变位点。
图20为实施例3中经不同处理组HDPE细胞经定量RT-PCR检测miR-21(左)和KBTBD7mRNA(右)的表达水平图。
图21为实施例3中经不同处理组HDPF细胞经Western blot检测KBTBD7蛋白表达水平图。
图22为实施例3中经不同处理组HDPF细胞的荧光活图。
图23为不同处理组HDPE细胞IKK与p65蛋白的磷酸化水平，及IκBα的蛋白表达水平图(A)，定量评估IKK磷酸化、p65磷酸化、IκBα蛋白水平图(B-D)，*P<0.05。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
临床收集因正畸减数或阻生拔除的健康恒牙(牙体完整，无牙髓、根尖周炎及牙周炎)，经患者及其家属知情同意书，签署同意书，并实验获得我院委员会批准。无菌条件下，用PBS充分将换牙洗净后，劈开牙齿，获取牙髓组织，将牙髓组织置于EP管中，无血清α-MEM培养液(Gibco，美国)漂洗3次后，将牙髓组织充分剪碎；在60mm2培养皿底壁滴加大约500uL含20％胎牛血清(杭州四季青，中国)、100L青霉素(Sigma公司，美国)和100ug/mL链霉素(Gibco，美国)的α-MEM培养液，充分摇匀，使底壁均匀湿润，将牙髓组织碎块平铺于底壁，上覆无菌盖玻片，轻压使组织块固定后，小心加入上述培养液2mL，置培养箱中37℃、5％CO2、饱和湿度条件孵育。每隔3d进行定量换液，并用显微镜观察细胞形态特征及生长情况。当细胞出现融合后以胰蛋白酶(0.2％胰蛋白酶)消化收集细胞，经过计数后，按1:2传代。
HDPF免疫细胞化学荧光染色鉴定
取传代培养第4代HDPF细胞制备细胞悬液，调整细胞浓度，以1×104/ml的密度制备细胞爬片，长至60％至80％后，PBS漂洗3次，每次5min，4％多聚甲醛固定15min，PBS漂洗3次，每次5min，透化：1％Tritonx-100(PBS稀释)冰上处理2min，PBS漂洗3次，每次5min，利用5％的血清封闭1h，PBS漂洗3次，每次5min，进行免疫细胞化学染色法进行波形蛋白(兔抗人波形蛋白抗体，1:200，Cell signaling technology，MA，USA)和角蛋白染色(兔抗人角蛋白抗体，1:200，Cell signaling technology，MA，USA)，以及FSP(ab86436，1:200，Abcam，USA)和Stro1(ab214086，1:200，Abcam，USA)蛋白和KBTBD7蛋白一抗(ab230126,1:100，Abcam，USA)4℃孵育过夜，加入羊抗兔Alexa Flouor 488(1:200)或FITC荧光二抗(1:100)，避光条件下孵育2h，DAPI(1:150)对细胞核进行染色，荧光显微镜拍照并记录。
结果如图1A-E所示：牙髓成纤维细胞(HDPF)传代培养第4代细胞呈星形，形态不规则，有胞质突起互相连接(图1A)，第4代细胞经免疫细胞化学技术鉴定，波形蛋白染色光镜下观察可见胞浆呈棕黄色，胞核呈蓝色(图1B)，角蛋白染色可见胞浆无染色，胞核呈蓝色(图1C)，证实细胞来源于间叶组织，符合牙髓组织学特征，同时通过免疫细胞化学检测牙成纤维细胞表面标志物FSP(Fibroblast surface protein)的表达情况，以及检测干细胞表面标志物，Stro-1作为阴性对照，检测结果发现，HDPF细胞表达大量的FSP蛋白，而不表达Stro-1，进一步证实了我们分离培养的为人牙髓成纤维细胞(图1D和1E)。通过鉴定证明，从牙髓组织分离出的细胞为牙髓成纤维细胞，为后续的实验打下良好的基础。
内毒素脂多糖(LPS)诱导人牙髓成纤维细胞
取对数期生长的HDPF细胞，分为组5组，5组中分别加入生理盐水(即0ug/mL)、0.1ug/mL、1ug/mL、5ug/mL和10ug/mL的内毒素脂多糖(Escherichia coli(E.coli)LPS055:B5L2880，Sigma，用含1％胎牛血清的α-MEM培养液稀释)处理。
MTT实验
HDPF细胞培养12h、24h、48h、72h和96h，进行细胞计数。取100μL的待测细胞悬液(细胞数为104～105个)于96孔细胞培养板中，每组细胞设3个复孔，37℃，5％CO2细胞培养箱内培养，向每孔中加入20μL MTT液(5mg/mL，Sigma公司，USA)，继续细胞培养箱内37℃，5％CO2孵育4h，终止培养，弃去培养液。每孔再加入DMSO，剂量为150μL，轻匀摇动10min，促进结晶溶解。在酶联免疫检测仪上570nm波长下测定各孔的吸光度值(OD570值)；将吸光度值设置为纵坐标，时间设置为横坐标后绘制MTT曲线图。每组的吸光度值重复测量三次取平均值。
5-ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)荧光染色
根据EdU Apollo in-vitro flow cytometry kit(RiboBio,Guangzhou,China)使用说明检测HDPF细胞增殖情况。HDPF细胞培养48h后加入EdU溶液(50umol/L)孵育2h，随后用PBS洗涤，4％多聚甲醛固定细胞，然后用Apollo溶液染色。最后，HDPF细胞用Hoechst33342(Invitrogen,CA,USA)染色30min用于观察细胞核。图片用高倍显微镜下MetaXpress软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)进行分析。
MTT实验与EdU实验结果表明：与对照组(未加入LPS)相比，0.1ug/mL LPS处理组人牙髓成纤维细胞增殖无明显变化，1ug/mL LPS可轻度抑制人牙髓成纤维细胞增殖，但无明显差异，5ug/mL和10ug/mL LPS可显著性抑制人牙髓纤维细胞的增殖，且呈浓度依赖性(图2和3，P<0.01)。
ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平
用ELISA试剂盒(R&D，USA)检测HDPF细胞培养基上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。所有操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。
ELISA实验结果显示，与对照组(未加入LPS)相比，0.1ug/mL LPS处理组IL-1β、IL-6及TNF-α的水平无显著性差异，而1ug/mL、5ug/mL和10ug/mL LPS可以显著性促进炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，并呈浓度依赖性(图4，P<0.01)。综合上述实验结果，因5ug/mL和10ug/mL LPS既能显著性抑制细胞增殖，又能显著性促进炎症因子水平，而10ug/mL LPS对细胞增殖抑制作用过强，不利于细胞生长及后续实验指标的检测，故后续实验我们采用5ug/mL LPS处理人牙髓成纤维细胞48h诱导HDPF细胞产生炎症。
实施例2：
取对数期生长的HDPF细胞，分为Blank组、LPS组、1-BBR组、5-BBR组、10-BBR组、25-BBR组(又称BBR组)、50-BBR组、LPS+1-BBR组、LPS+5-BBR组、LPS+10-BBR组、LPS+25-BBR组(又称LPS+BBR组)、LPS+50-BBR组。其中，Blank组为空白对照组，在细胞培养基中加入生理盐水；LPS组在细胞培养基中添加5ug/mL的内毒素脂多糖干预HDPF；1-BBR组、5-BBR组、10-BBR组、25-BBR组、50-BBR组分别在细胞培养基中添加1uM、5uM、10uM、25uM和50uMBerberine(BBR，成都思科华生物技术有限公司)；LPS+1-BBR组、LPS+5-BBR组、LPS+10-BBR组、LPS+25-BBR组、LPS+50-BBR组为在细胞培养基中加入5ug/mL的内毒素脂多糖预处理12h，然后分别加入1uM、5uM、10uM、25uM和50uM BBR。
MTT实验(具体方法同实施例1)
MTT实验结果发现：25uM及以下浓度的小檗碱对细胞增殖无明显影响，而50uM小檗碱会降低细胞增殖能力，但无显著差异，说明低浓度的小檗碱对细胞无毒副作用(图5)。
5-ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)荧光染色(具体方法同实施例1)
EdU实验结果显示：与LPS组相比，LPS+1-BBR组和LPS+5-BBR组细胞增殖能力(MTT实验)与EdU染色阳性细胞数无明显变化，LPS+10-BBR组细胞增殖能力与EdU染色阳性细胞数有上升趋势，但无显著性差异，而LPS+25-BBR与LPS+50-BBR组细胞增殖能力显著性升高，EdU染色阳性细胞数显著性增多，而LPS+25-BBR与LPS+50-BBR组细胞增殖能力与EdU染色阳性细胞数无明显差异(图5和图6，P<0.01)。
ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平(具体方法同实施例1)
ELISA实验结果发现：与LPS组相比，LPS+1-BBR、LPS+5-BBR与LPS+10-BBR组炎症因子水平无明显变化，LPS+25-BBR与LPS+50-BBR组炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平显著性减少(图7，P<0.01)。这些结果表明，BBR可以促进LPS-HDPF细胞增殖及抑制炎症反应避免产生毒副作用。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
将HDPF细胞溶解于1ml Trizol(Invitrogen公司)中，按Trizol说明书提取RNA，定量后，逆转录成cDNA，按荧光定量PCR(Takara,Dalian,China)试剂盒说明书配置PCR反应体系，设置反应条件，应用ABI7500定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)进行Real-timequantitative RT-PCR实验，反应条件为95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸34s，40个循环,检测分析miR-21、KBTBD7的表达水平。所有RT-PCR反应引物如下表1所示，所有引物由金唯智生物科技有限公司合成。miRNA的内参用U6，mRNA的内参用GAPDH，数据分析采用2-ΔΔCt法，公式如下:ΔΔCt＝[Ct(目的基因)-Ct(内参基因)]实验组-[Ct(目的基因)-Ct(内参基因)]对照组。
表1引物序列
Figure BDA0002330708360000071
Western blot检测
取上述处理48h后的HDPF细胞，用预冷的PBS缓冲液冲洗3次后加入规格为100μL/50mL培养瓶的蛋白抽提裂解液裂解细胞，静置于冰上30min。4℃，12000rpm，离心10min，吸取清分装于0.5mL离心管中并置于-20℃保存或BCA试剂盒(beytime,Shanghai,China)进行蛋白定量，加入6×SDS上样缓冲液100℃进行蛋白变性，SDS电泳分离蛋白，用4℃预冷的转膜液转膜1.5h，TBST配置的5％脱脂奶粉封闭液封闭1h，以TBST配置的KBTBD7(ab230126，1:1000)和β-actin(ab4970s，1:1000，Abcam，USA)，Phospho-IKKα/β(2697，1:200)、IKKβ(8943，1:500)、Phospho-NF-κB p65(3033，1：200)、NF-κB p65(8242，1：500)和IκBα(9242，1:500)一抗(Cell signaling technology，MA，USA)4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min，室温孵育山羊抗鼠IgG(1:5000，北京康维世纪生物科技有限公司，中国，北京)2h，TBST清洗后显影检测蛋白的表达水平。
HDPF免疫细胞化学荧光染色鉴定(具体方法同实施例1)
实验结果表明：与Blank组相比，BBR组(即25-BBR组)miR-21的表达水平无明显变化，而miR-21在LPS诱导的HDPF细胞中低表达，加入BBR可以显著性回调miR-21的表达水平(图8，P<0.01)。
通过定量PCR、Western blot以及免疫细胞化学检测KBTBD7的表达情况，结果显示，与Blank组比较，BBR组KBTBD7的mRNA和蛋白表达水平有下降趋势，但无明显差异，LPS组KBTBD7的mRNA和蛋白表达水平显著性增加，与LPS组相比，LPS+BBR组KBTBD7的mRNA和蛋白表达水平显著性降低(图8-10，P<0.01)。这些结果表明，BBR可以促进LPS-HDPF细胞增殖及抑制细胞炎症因子水平，同时上调miR-21的表达，下调KBTBD7的表达。
实施例3：细胞转染
取对数期生长的HDPF细胞，分为Blank组、LPS组、LPS+BBR组、LPS+BBR+mimic NC组(又称mimic NC组)、LPS+BBR+miR-21mimic组(又称miR-21mimic组)、LPS+BBR+inhibitorNC组(又称inhibitor NC组)、LPS+BBR+miR-21inhibitor组(又称miR-21inhibitor组)、LPS+BBR+sh-NC组(又称sh-NC组)和LPS+BBR+sh-KBTBD7组(又称sh-KBTBD7组)。其中，除Blank组，其他组均加入5ug/mL的内毒素脂多糖预处理12h，然后向LPS+BBR+mimic NC组、LPS+BBR+miR-21mimic组、LPS+BBR+inhibitor NC组、LPS+BBR+miR-21inhibitor组、LPS+BBR+sh-NC组和LPS+BBR+sh-KBTBD7组中，分别转染mimic NC(miR-21模拟物阴性对照)、miR-21mimic(miR-21模拟物)、inhibitor NC(miR-21抑制剂阴性对照)、miR-21inhibitor(miR-21抑制剂)(均购于RiboBio，Guangzhou，China)、sh-NC(short hairpin RNA阴性对照)、sh-KBTBD7(short hairpin KBTBD7RNA)质粒(由GenePharma公司设计与合成，Shanghai，China)，12h后向除Blank组和LPS组，其余各组中加入25uM Berberine(BBR，成都思科华生物技术有限公司)。转染使用lipfectamine 2000转染试剂盒(Invirtrogn,USA)，所有转染操作均严格按照lipfectamine 2000转染说明书进行。将转染成功的细胞加入α-MEM无血清培养基培养，8h更换α-MEM(10％FBS)培养基，置于5％CO2、37℃、95％湿度的恒温培养箱中继续培养以用于后续实验。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(具体方法同实施例2)Western blot检测(具体方法同实施例2)：
我们进一步探讨miR-21在BBR处理的LPS-HDPF细胞中，对细胞增殖以及炎症反应的影响，通过转染相应质粒，检测结果显示，与mimic NC组相比，miR-21mimic组miR-21表达水平显著性升高；与inhibitor NC组相比，miR-21inhibitor组miR-21表达水平显著性降低(图11，P<0.01)，说明miR-21过表达与沉默效果良好。
为探讨KBTBD7在BBR诱导的LPS-HDPF细胞中的作用，我们构建了沉默KBTBD7的质粒。与sh-NC组相比，sh-KBTBD7组KBTBD7的mRNA和蛋白表达水平显著性降低，说明KBTBD7沉默效果良好(图11和12，P<0.01)。
MTT实验(具体方法同实施例1)
MTT实验结果发现：与LPS+BBR+mimic NC组相比，LPS+BBR+miR-21mimic组细胞增殖能力显著性增强；与LPS+BBR+inhibitor NC组相比，LPS+BBR+miR-21inhibitor组OD值显著性降低(图13)。
与LPS+BBR+sh-NC组相比，LPS+BBR+sh-KBTBD7组细胞增殖能力显著性增强，(图14，P<0.01)。
5-ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)荧光染色(具体方法同实施例1)
EdU实验结果显示：与LPS+BBR+mimic NC组相比，LPS+BBR+miR-21mimic组EdU染色阳性细胞数显著性增多；与LPS+BBR+inhibitor NC组相比，LPS+BBR+miR-21inhibitor组EdU染色阳性细胞数显著性减少(图15，P<0.01)。
与LPS+BBR+sh-NC组相比，LPS+BBR+sh-KBTBD7组EdU染色阳性细胞数显著性增多(图16，P<0.01)。说明沉默KBTBD7的表达可以明显加强BBR促进LPS-HDPF细胞增殖的作用。
ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平(具体方法同实施例1)
ELISA实验结果发现：与LPS+BBR+mimic NC组相比，LPS+BBR+miR-21mimic组炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平显著性降低；与LPS+BBR+inhibitor NC组相比，LPS+BBR+miR-21inhibitor组炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平显著性升高(图17，P<0.01)。
以上结果表明，过表达miR-21可以加强BBR对LPS-HDPF细胞的作用，抑制miR-21的表达可部分消除BBR对LPS-HDPF细胞促进增殖和抑制炎症的作用。
与LPS+BBR+sh-NC组相比，LPS+BBR+sh-KBTBD7组炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平显著性降低(图18，P<0.01)，说明沉默KBTBD7的表达可以明显加强BBR对LPS-HDPF细胞炎症反应的抑制作用。
荧光素酶双报告基因实验
通过在线预测软件Target Scan及Starbase确定miR-21-5p和KBTBD7结合的靶位点，根据预测结果，分别设计KBTBD7和miR-21-5p结合位点的突变序列和野生序列。将突变序列和野生序列片段克隆并与Promega载体结合，分别命名为MT-KBTBD7和WT-KBTBD7，将MT-KBTBD7或WT-KBTBD7和miR-21-5p mimic或miR-21-5p inhibitor共转染HEK-293T细胞，转染48小时后，使用荧光素酶双报告基因试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司)检测各组细胞的荧光活性强度。
通过上述实验结果，我们推测miR-21与KBTBD7之间存在靶向关系且调节KBTBD7的表达，为验证我们的推测，我们通过生物学在线软件Starbase预测发现KBTBD7 3’-UTR与miR-21-5p之间存在结合位点(图19)。如图20和21所示，与mimic NC组相比，miR-21mimic组miR-21表达水平显著性升高，而KBTBD7的mRNA和蛋白表达水平显著性降低；与inhibitorNC组相比，miR-21inhibitor组miR-21表达水平显著性降低，而KBTBD7的mRNA和蛋白表达水平显著性升高(图20和21，P<0.01)，结果说明miR-21负向调节KBTBD7的表达。
为了证实miR-21-5p与KBTBD7 3’-UTR之间的靶向关系，我们构建了野生型KBTBD73’-UTR荧光素酶启动子质粒(命名为WT-KBTBD7)和突变型KBTBD7 3’-UTR荧光素酶启动子质粒(包含10个与miR-21-5p预测结合的突变位点，命名为MT-KBTBD7)，采用KBTBD7启动子荧光素酶报告基因检测，结果显示，WT-KBTBD7与miR-21-5p mimic共转染时，与对照组相比，荧光活性显著性的降低(P<0.01)；当WT-KBTBD7与miR-21-5p inhibitor共转染时，荧光活性与对照组相比显著性地升高(P<0.01)；而当MT-KBTBD7与miR-21-5p mimic或miR-21-5p inhibitor共转染时，与对照组相比荧光活性均无明显差异(图22)。这些结果表明，KBTBD7与miR-21-5p直接相互结合。
上述结果表明，BBR通过miR-21靶向调节KBTBD7，从而调控LPS诱导的HDPF细胞增殖及炎症反应。
小檗碱通过NF-κB信号通路调控LPS-HDPF细胞增殖及炎症水平
实验结果发现，LPS+BBR组相较于LPS组蛋白IKK与p65的磷酸化水平显著性降低，而IκBα的蛋白水平显著性增加(图23A-D，P<0.01)；与LPS+BBR+mimic NC组相比，LPS+BBR+miR-21mimic组蛋白IKK与p65的磷酸化水平显著性降低，而IκBα的蛋白水平显著性增加(图23A-D，P<0.01)；LPS+BBR+miR-21inhibitor组相较于LPS+BBR+inhibitor NC组蛋白IKK与p65的磷酸化水平显著性升高，而IκBα的蛋白水平显著性降低(图23A-D，P<0.01)；与LPS+BBR+sh-NC组相比，LPS+BBR+sh-KBTBD7组蛋白IKK与p65的磷酸化水平显著性降低，而IκBα的蛋白水平显著性升高(图23A-D，P<0.01)。综合上述结果表明，小檗碱调节miR-21/KBTBD7轴，并通过NF-κB信号通路发挥生物学功能。

Claims (5)

1.小檗碱在防治牙髓炎中的应用。
2.小檗碱在防治内毒素脂多糖诱导的牙髓炎中的应用。
3.根据权利要求2所述的小檗碱在防治内毒素脂多糖诱导的牙髓炎中的应用，其特征在于，所述小檗碱的有效剂量≥25 uM。
4.一种防治牙髓炎的药物，其特征在于，有效成分为小檗碱。
5.根据权利要求4所述防治牙髓炎的药物，其特征在于，所述防治牙髓炎的药物还包括药学上可接受的赋型剂。
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吉晓蕙: "黄连素根管治疗的疗效观察", 《社区卫生保健》 *

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