CN117683934A

CN117683934A - 一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的ssr引物及方法

Info

Publication number: CN117683934A
Application number: CN202410031427.1A
Authority: CN
Inventors: 李永平; 薛珠政; 张双照; 马慧斐; 黄发茂; 温庆放
Original assignee: Crop Research Institute Of Fujian Academy Of Agricultural Sciences Fujian Provincial Germplasm Resources Center
Current assignee: Crop Research Institute Of Fujian Academy Of Agricultural Sciences Fujian Provincial Germplasm Resources Center
Priority date: 2024-01-09
Filing date: 2024-01-09
Publication date: 2024-03-12

Abstract

本发明提供了一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法，属于分子标记技术领域。本发明的SSR引物能扩增出父本特异性条带和母本特异性条带；本发明的鉴定方法可将芥菜杂交种子与其它杂种以及父母本区分开来，在5h之内即可完成种子纯度鉴定工作，可快速检测出杂交种子的纯度；具有快速、准确、成本低、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的应用价值。

Description

一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法。

背景技术

芥菜(Brassicajuncea(L.)Czern.etCoss.)是十字花科芸苔属一年生草本植物。芥菜含有维生素A、B族维生素、维生素C、维生素D以及纤维素，具有提神醒脑、解除疲劳、解毒消肿、明目利膈、宽肠通便等功效，明《广群芳谱》说芥菜“其气味辛辣，有介然之义”，所以称为“芥菜”。芥菜育种以传统方式为主，侧重杂种优势利用，而杂种优势的充分表现与种子遗传纯度有着密切的联系。由于在芥菜杂交制种过程中，人工去雄不彻底或漏去雄等原因，常会出现假杂交种，导致种子遗传纯度下降，给生产造成巨大的经济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，种子纯度是衡量芥菜杂交种子质量的重要指标，建立准确、高效、快速的芥菜种子纯度鉴定体系有利于芥菜种子高效准确的质量控制，具有重要的商业价值和现实意义。

SSR(Simple sequence repeat)分子标记技术具有数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传、呈共显性且扩增结果稳定、成本低、方法简单等特点，被广泛应用于作物遗传图谱、指纹图谱构建及种子纯度鉴定等研究中。自2016年公布芥菜基因组测序结果以来，芥菜分子标记的开发和应用也逐渐增加。目前，SSR标记已经用于芥菜种质资源评价、遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、种子纯度鉴定等方面，但目前芥菜杂交种子纯度的鉴定的SSR引物效率低且结果稳定性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法。本发明的引物可将芥菜杂交种子与其父母本种子进行有效区分，稳定性高，可快速、准确检测出种子纯度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述SSR引物为BJSSR86，包括正向引物BJSSR86-F和反向引物BJSSR86-R；正向引物BJSSR86-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物BJSSR86-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种芥菜杂交种子纯度的鉴定方法，包含以下步骤：

(1)分别以芥菜亲本基因组DNA和待测样本基因组DNA为模板，用权利要求1所述的SSR引物进行PCR扩增获得扩增产物；

(2)对扩增产物进行电泳，扩增条带有且仅有父本特异性条带和母本特异性条带的杂交种子鉴定为真正的杂交种，否则记为假杂种，并计算种子纯度；

其中，SSR引物BJSSR86扩增出的父本特异性条带为138bp，SSR引物BJSSR86扩增出的母本特异性条带为126bp。

优选的，所述PCR扩体系的总体积为25μL：待测样本DNA75 ng，0.2mmol.L^-1dNTP 1μL，0.4μmol·L^-1的正向引物和反向引物各1μL，Taq酶0.3μL，10×Buffer 2.5μL，ddH₂O补足至25μL。

优选的，PCR扩增程序为：95℃5min，94℃30s、56℃30s、72℃30min35个循环，72℃7min。

优选的，种子纯度的计算方法为：种子纯度＝检测到的真正杂交种个数/种子检测总数×100％。

优选的，所述电泳的进样电压为120v，时间15min；分离电压80v，时间90～120min。

本发明还提供了所述SSR引物或所述鉴定方法在芥菜品种真实性快速鉴定、遗传多样性分析和DUS测试近似品种辅助筛选中的应用。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明中的SSR引物BJSSR86能产生父本特异性标记和母本特异性标记，特异性强；

(2)本发明的鉴定方法可将芥菜杂交种子与与其它杂种以及其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；

(3)本发明的检测方法在5h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、准确、低成本、操作方便等优势，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。

附图说明

图1为96个引物对的扩增情况，其中：

A为使用无特异性的引物进行扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图；

B为使用偏父型的引物进行扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图；

C为使用偏母型的引物进行扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图；

D为使用本发明的引物进行扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果图。

图2为实施例1PCR电泳图；其中，M：Marker；P1：父本；F1：杂交种；P2：母本。

图3为实施例2中18株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱；其中，M：Marker；P1：父本；P2：母本；9：假杂种；1-8，10-18：抽样芥菜杂交种。

图4为实施例3中24株单株及其双亲扩增产物的电泳分析图谱；其中，M：Marker；P1：父本；P2：母本；F1：杂交种；1-24：抽样芥菜杂交种。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1SSR引物筛选

‘福芥1号’由福建省农业科学院作物研究所育成，商品性状良好，生长势强，抗病性较好，是理想的栽培品种，已在全国范围内连续推广2年，市场反应良好。

本发明是依托2022年本中心芥菜‘福芥1号’转录组测序数据，利用生物信息学手段，鉴定获得9526个SSR位点，随机挑选出均匀分布在染色体上的96个SSR位点，设计出引物，以取样于福建省蔬菜中心基地(福清东张)的芥菜‘福芥1号’及其父母本为材料，选出1对共显性差异标记条带的引物BJSSR86，该标记带型清晰、重复性好，能够有效鉴定芥菜‘福芥1号’杂交种子的纯度，序列如下所示：

BJSSR86-F:5’-ATATGATTGGGGATGGGGAT-3’(SEQ ID NO.1)；

BJSSR86-R:5’-GAACCAGACCCTGAACCAAA-3’(SEQ ID NO.2)。以芥菜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物BJSSR86进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果显示，SSR引物BJSSR86能产生138bp的父本特异性条带以及126bp的母本特异性条带。本发明根据96个SSR位点共设计96个引物对，以芥菜‘福芥1号’及其父母本为材料，筛选出1对共显性差异标记条带的引物BJSSR86，能够有效鉴定芥菜‘福芥1号’杂交种子的纯度，共显性差异标记占比为1.04％。其余引物有4对引物偏母型，3对引物偏父型，88对引物无特异性(见图1)。

可见，设计的96个引物对，仅有一个引物对能够准确检测出种子纯度。

实施例2杂交芥菜种子的纯度鉴定

1.芥菜DNA的提取

(1)用酒精擦拭所选取的长势良好，形态完整的芥菜幼嫩叶片，快速剪取2-3片嫩叶放入研钵中，加入1-2勺的PVP，在液氮的条件下迅速研磨成粉状，之后将粉末放入1.5mL的离心管中；

(2)向离心管中加入预热至65℃2％CTAB Buffer 600μL和7μLβ-琉基乙醇，充分混匀后，放入65℃水浴锅中1h，期间多次摇匀；

(3)从水浴锅中取出离心管冷却至室温，加入等体积的加入氯仿/异戊醇600μL，轻缓颠倒混匀静置10min，随后在12000rpm，4℃条件下离心10min；

(4)用移液枪取离心管中的上清液加入另一新的1.5mL离心管中，随后加入100μL3mol/LNaAc和300μL的氯仿/异戊醇充分混匀，在4℃的条件下，离心10min；

(5)再次用移液枪吸取上清液至新的1.5mL离心管中，并加入0.6倍体积异丙醇，轻轻颠倒混匀至能看到白色絮状物，在12000rpm，4℃条件下离10min；

(6)用75％的乙醇洗涤DNA2-3次，随后放于超净工作台上。将风干后的DNA溶于100μL TE溶液，再加入2.5μL RNaseA去除RNA，并存于37℃的水浴锅中20min-30min保存备用；

(7)吸取4μL DNA溶液与2μL溴酚蓝混合，在1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA纯度，保存于4℃或-20℃备用。

2.SSR-PCR扩增

利用上述方法提取待测芥菜和亲本芥菜的基因组DNA，以提取的待测芥菜‘福芥1号’DNA和芥菜‘福芥1号’父本母本DNA为模板，以SSR引物BJSSR86进行扩增，

扩增时采用的反应体系为：基因组DNA 75ng，0.2mmol.L^-1dNTP 1μL，0.4μmol·L^-1的正向引物和反向引物各1μL，Taq酶0.3μL，10×Buffer 2.5μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR扩增时扩增程序为：95℃预变性5min；然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30min；最后72℃延伸7min。

扩增后，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳的进样电压为120v，时间15min；分离电压80v，时间70min。电泳结果如图2所示。

3.EST-SSR结果分析

图1中，M为Marker；P2为母本特异性条带，P1为父本特异性条带；F1为待测杂交种扩增的条带。电泳结果显示，待测杂交种子检测到2条共显性条带，一条来自母本138bp，一条来自父本126bp，鉴定为真正的杂交种。

实施例3

从福建省龙岩市蔬菜试验示范基地的种子纯度鉴定田间取18株芥菜，对其单株编号，分别提取单株DNA，采用实施例2的方法对杂交芥菜种子的纯度进行鉴定，检测结果如图3所示，图3显示，杂交种子17株，母本1株，种子纯度为94.44％。

同时对上述18株芥菜进行田间检测，田间检测的步骤为：对田间采样测试的18株芥菜，进行株型、叶型、叶顶端形状、叶缘齿状、叶波纹大小、叶裂刻、叶面刺毛、叶面蜡粉、叶色叶面光泽、叶柄色、叶柄横切面形状、结球性、抽薹性等表型性状测试，其中有1株的性状与母本的基本一致，其余17株均为杂种1代的性状。

可见，利用本发明的SSR引物检测结果与田间检测结果一致。

实施例4

从福建省蔬菜中心基地(福清东张)的种子纯度鉴定田间取24株芥菜，对其单株编号，分别提取单株DNA，采用实施例2的方法对杂交芥菜种子的纯度进行鉴定，检测结果如图4所示，图4显示，24株芥菜全部为真实杂种，种子纯度为100％。

同时对上述24株芥菜进行田间检测，田间检测的步骤为：对田间采样测试的24株芥菜，进行株型、叶型、叶顶端形状、叶缘齿状、叶波纹大小、叶裂刻、叶面刺毛、叶面蜡粉、叶色叶面光泽、叶柄色、叶柄横切面形状、结球性、抽薹性等表型性状测试，24株均为杂种1代的性状。

可见，利用本发明的SSR引物检测结果与田间检测结果一致。

由以上实施例可知，本发明提供了一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法，可快速、准确地将芥菜杂交种子与其它杂种以及父母本区分开来。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于芥菜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，其特征在于，所述SSR引物为BJSSR86，包括正向引物BJSSR86-F和反向引物BJSSR86-R；

所述正向引物BJSSR86-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

所述反向引物BJSSR86-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种芥菜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，包含以下步骤：

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，PCR扩体系的总体积为25μL：待测样本DNA 75ng，0.2mmol.L^-1dNTP 1μL，0.4μmol·L^-1的正向引物和反向引物各1μL，Taq酶0.3μL，10×Buffer 2.5μL，ddH₂O补足至25μL。

4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃30s、56℃30s、72℃30s，35个循环；72℃7min。

5.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，种子纯度的计算方法为：种子纯度＝真正的杂交种个数/种子检测总数×100％。

6.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述电泳的进样电压为120v，时间15min；分离电压80v，时间60～90min。

7.权利要求1所述的SSR引物或权利要求2所述的鉴定方法在芥菜品种真实性快速鉴定、遗传多样性分析和DUS测试近似品种辅助筛选中的应用。