CN117683744A - 一种亲本植酸酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亲本植酸酶变体，具体地涉及公开一种亲本植酸酶变体，涉及蛋白质工程技术领域，所述变体相对于其亲本植酸酶，在对应于SEQ ID NO:1的第295位、第349位、第374位上具有一个或多个氨基酸的取代，与亲本植酸酶相比，所述变体具有增加的热稳定性。

Description

一种亲本植酸酶变体
本发明申请是基于申请日为2021年02月03日，申请号为202180006789.X(国际申请号为PCT/CN2021/075123)、名称为“一种亲本植酸酶变体”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及蛋白质工程技术领域。更具体地，涉及一种亲本植酸酶变体。
背景技术
植酸酶(Phytase)，又称为肌醇六磷酸酶，属于正磷酸单酯磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(磷酸盐)的酶类总称。植酸在谷物、豆类、油料等作物种子中含量最为丰富，高达1％～3％，占植物总磷含量的60％～80％。但植酸中的磷不能被直接吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。研究表明，单胃动物(猪、鸡、鸭、鹅等)因为缺乏植酸酶而对植酸中磷的利用率很低。同时，植酸的强烈电负性导致其通常与二价或三价阳离子，如Ca2+、Zn2+、Fe2+等形成不溶性盐类，阻碍小肠对矿物质的吸收。还会与蛋白质，氨基酸以及脂肪酸等形成络合物，影响他们的吸收利用。植酸还会与胃蛋白酶、胰凝乳酶、胰蛋白酶等结合，降低消化酶活性。因此，在单胃动物饲料中添加植酸酶可提高动物饲料中磷的利用率，降低动物排泄物中的磷含量，同时能提高蛋白和饲料的能量利用率。
植酸酶作为饲料添加剂预先加入饲料原料中，经高温制粒等过程(70-95度，时间为30秒-120秒)后，生产出饲料用于动物饲养。植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能满足饲料及饲料加工的要求，成为制约植酸酶推广应用的重要限制性因素之一。鉴于植酸酶对提高畜牧业生产效益和降低磷对环境的污染有重要意义，提高植酸酶的耐热性成为科研领域研究的新热点。
采用包衣技术可以有效降低植酸酶在制粒等高温高湿处理过程中的活性损失，大大提高植酸酶的利用效率。国内外均已针对植酸酶的包衣进行研究且取得了一定进展，著名的酶制剂生产商Novozymes和BASF开发的植酸酶包衣工艺，包衣的植酸酶与未经包衣的植酸酶酶粉相比，其热稳定性得到大幅度提升。专利WO2007044968、CN1981597 A、CN101168734A均公开了植酸酶的包衣工艺。虽然包衣工艺可以显著提升植酸酶的耐热性能，但是包衣的工艺复杂，同时还会延长植酸酶的生产周期，大大增加植酸酶的生产成本。
此外，通过蛋白质工程的方法在野生型植酸酶的氨基酸序列基础上，对特定位置的氨基酸进行突变，也可以筛选获得耐热性能优异的植酸酶。专利WO2019228441A1、US9605245、EP2102334B1等均对植酸酶进行了特定氨基酸的定点突变，使最终获得的植酸酶产品相较于野生型植酸酶的耐热性能有所提升。但是在饲料高温制粒过程中，这些植酸酶产品的酶活仍然会大量损失。
因此，还需要在现有研究的基础上开发耐热性能更为优异的植酸酶产品。
发明内容
具体地，本发明涉及如下各项：
1、一种亲本植酸酶变体，其特征在于，包括：
(a)所述变体相对于其亲本植酸酶，在对应于SEQ ID NO:1的第295位、第349位、第374位上具有一个或多个氨基酸的取代，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:98相比，具有至少80％的序列一致性；
(b)所述变体具有植酸酶活性；并且
(c)与亲本植酸酶相比，所述变体具有增加的热稳定性。
2、项1所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与SEQID NO:98相比，具有至少90％的序列一致性；优选的，具有至少95％的序列一致性；更优选的，具有至少98％的序列一致性。
3、根据项2所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述亲本植酸酶的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:112或SEQ IDNO:115。
4、根据项3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第295位的氨基酸被取代为P、Y、G、K、L或Q；优选地，被取代为P或Y。
5、根据项3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第349位的氨基酸被取代为选自K、L、G、H、R或T；优选地，被取代为K或L。
6、根据项3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第374位的氨基酸被取代为选自R、V、N、S、T、F、K、P或Y；优选地，被取代为R或V。
7、根据项1-6中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体相对于其亲本植酸酶，包含选自下组的氨基酸取代：
T295P；Q349K；E374R；T295Y；Q349L；E374V；
T295P+Q349K；T295P+E374R；T295P+Q349L；T295P+E374V；
T295Y+Q349K；T295Y+E374R；T295Y+Q349L；T295Y+E374V；
Q349L+E374R；Q349K+E374R；Q349L+E374V；Q349K+E374V；
T295P+Q349K+E374R；T295Y+Q349K+E374R；
T295P+Q349L+E374R；T295Y+Q349L+E374R；
T295P+Q349K+E374V；T295Y+Q349K+E374V；
T295P+Q349L+E374V；T295Y+Q349L+E374V。
8、根据项7所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体与其亲本植酸酶的氨基酸序列相比，具有至少90％的序列一致性；优选的，具有至少95％的序列一致性；更优选的，具有至少98％的序列一致性。
9、根据项1-8中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体还进一步包括至少一对引入的二硫键。
10、根据项9所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体包括在与SEQ ID NO:1的第346位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQ ID NO:1的第393位对应的位置上的氨基酸残基之间形成二硫键。
11、根据项1-10中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ IDNO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118。
12、一种核酸，其编码如项1-11中任一项所述的亲本植酸酶变体。
13、一种载体，其包含如项12所述的核酸。
14、一种宿主细胞，其包含项13所述的载体。
15、项14所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。
16、项15所述的宿主细胞，其为真菌细胞，所述真菌细胞选自毕赤酵母细胞或者黑曲霉细胞。
17、一种如项1-11中任一项所述的亲本植酸酶变体的生产方法，其特征在于，该方法包括：
(a)在适于所述亲本植酸酶变体表达的条件下，对项14-16中任一项所述的宿主细胞进行培养；
(b)回收该亲本植酸酶变体。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出pPIC9K-APPA-Y0的质粒图谱。
图2示出实施例1中亲本植酸酶及其变体的热稳定性检测结果。
图3示出实施例3中第295位氨基酸定点饱和突变的变体热稳定性检测结果。
图4示出实施例3中第349位氨基酸定点饱和突变的变体热稳定性检测结果。
图5示出实施例3中第374位氨基酸定点饱和突变的变体热稳定性检测结果。
图6示出实施例4中组合突变的变体热稳定性检测结果。
图7示出实施例5中亲本植酸酶APPA-An1的变体热稳定性检测结果。
图8示出实施例6中亲本植酸酶APPA-An5的变体热稳定性检测结果。
图9示出实施例7中亲本植酸酶APPA-An10的变体热稳定性检测结果。
图10示出实施例8中亲本植酸酶APPA-An15的变体热稳定性检测结果。
图11示出实施例9中亲本植酸酶APPA-An18的变体热稳定性检测结果。
发明详述
本发明的目的在于通过蛋白质工程的方法提供一种耐热性能更为优异的植酸酶产品。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的发明人发现，在亲本植酸酶的基础上，在对应于SEQ ID NO:1的第295位、第349位、第374位上引入一个或多个氨基酸的取代，得到的具有植酸酶活性的变体与其亲本植酸酶相比，具有显著增加的热稳定性；其中，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与SEQ IDNO:98所示的氨基酸序列相比，具有至少80％的序列一致性。
在一些优选实施例中，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列相比，具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性；进一步优选的，所述亲本植酸酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:98所示。
在一些具体实施例中，所述亲本植酸酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:115。
在一些实施例中，所述变体在第295位的氨基酸被取代为P、Y、G、K、L或Q；优选的，被取代为P或Y；进一步优选的，被取代为Y。
在一些实施例中，所述变体在第349位的氨基酸被取代为K、L、G、H、R或T；优选的，被取代为K或L；进一步优选的，被取代为K。
在一些实施例中，所述变体在第374位的氨基酸被取代为R、V、N、S、T、F、K、P或Y；优选的，被取代为R或V；进一步优选的，被取代为R。
在一些优选实施例中，所述变体相对于其亲本植酸酶，包含选自下组的任一组氨基酸取代：
T295P；Q349K；E374R；T295Y；Q349L；E374V；
T295P+Q349K；T295P+E374R；T295P+Q349L；
T295P+E374V；T295Y+Q349K；T295Y+E374R；
T295Y+Q349L；T295Y+E374V；Q349L+E374R；
Q349K+E374R；Q349L+E374V；Q349K+E374V；
T295P+Q349K+E374R；
T295Y+Q349K+E374R；
T295P+Q349L+E374R；
T295Y+Q349L+E374R；
T295P+Q349K+E374V；
T295Y+Q349K+E374V；
T295P+Q349L+E374V；
T295Y+Q349L+E374V。
需要说明的是，所述变体相对于其亲本植酸酶，可以仅包括选自上述任一组的氨基酸取代，也可以在包含选自上述任一组氨基酸取代之外，还包含一些其它突变位点，例如现有技术中已经公开的可以提升植酸酶耐热性能的植酸酶突变位点。
优选地，所述变体与其亲本植酸酶的氨基酸序列相比，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，但小于100％的序列一致性。
在一些实施例中，所述变体还进一步包括至少一对引入的二硫键，例如，引入专利WO 2019228441 A1中公开的任一对或多对二硫键；优选地，所述变体包括在与SEQ ID NO:1的第346位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQ ID NO:1的第393位对应的位置上的氨基酸残基之间形成二硫键；进一步优选地，所述变体在与SEQ ID NO:1的第346位对应的位置上的氨基酸被取代为C，且所述变体在与SEQ ID NO:1的第393位对应的位置上的氨基酸被取代为C。
本领域技术人员可以理解的是，此处的“引入”不限定二硫键是以任何特定的方式生成的。例如，“引入”二硫键，可以包括将待引入二硫键的植酸酶序列的相应位置上的氨基酸残基替换成能够形成二硫键的氨基酸残基(例如，半胱氨酸残基Cys、同型半胱氨酸残基Hey，等等)；和/或在相应位置上插入能够形成二硫键的氨基酸残基。这样的替换和/或插入可以，例如，通过本领域公知的定点诱变方法来实现。“引入”亦包括形成所述二硫键的任何一个或两个氨基酸残基是由于自然突变而产生的情况。
在一些具体实施例中，所述变体的氨基酸序列是SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117或SEQ ID NO:118。
此外，本发明还提供一种核酸，其编码如上任一项所述的亲本植酸酶变体。
此外，本发明还提供一种载体，其包含如上所述的核酸。
此外，本发明还提供一种宿主细胞，其包含如上所述的载体。
在优选的实施例中，所述宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。
进一步优选地，所述宿主细胞为真菌细胞，所述真菌细胞选自毕赤酵母细胞或者黑曲霉细胞。
此外，本发明还提供一种如上任一项所述的亲本植酸酶变体的生产方法，该方法包括：
(a)在适于所述亲本植酸酶变体表达的条件下，对如上任一项所述的宿主细胞进行培养；
(b)回收该亲本植酸酶变体。
本发明的有益效果如下：
在植酸酶或植酸酶突变体的基础上引入如本发明所述的一个或多个突变位点，尤其是同时引入多个突变位点，得到的植酸酶变体与亲本植酸酶相比，在85℃水浴处理5分钟后的残余活力提高了16-27％。因此，本发明的技术方案可以显著提升植酸酶的酶活性质，特别是在耐热稳定性、耐蒸汽稳定性、制粒稳定性方面，显著优于现有的野生型或者突变型植酸酶。
命名及定义
序列一致性：即序列同一性，定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
亲本：是指进行了本发明所述的突变后可以产生本发明变体的植酸酶。所述亲本可以是天然产生(野生型)的植酸酶或由合适的方法制备的其突变体，所述亲本也可以是等位变体。
宿主细胞：是指任何对用包含本发明核酸的载体的转化、转染、转导等易感的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。
取代：是指用不同的氨基酸替代占据某位置的原有氨基酸。
变体：是指具有植酸酶活性的酶，且相对于其亲本植酸酶包含在一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的取代。本发明变体的构建可通过在适于生产变体的条件下，培养含有编码所述变体之核酸序列的宿主细胞来实现，所述变体可随后从得到的培养液中回收。
野生型：是指天然产生的微生物表达的植酸酶，例如自然界中发现的大肠杆菌来源的天然的植酸酶。
在描述本发明的植酸酶变体时，使用了下述命名法以便于参考。在所有情况下，使用了公认的IUPAC单字符或三字符氨基酸缩写。
对于氨基酸的取代，使用了下列命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。例如，在位置226用丙氨酸(alanine)取代苏氨酸(threonine)被命名为“Thr226Ala”或“T226A”。通过加号(“+”)来分开多个突变，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分别在位置205和411用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)、用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)的突变。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1构建毕赤酵母突变体表达菌株
本发明引用了专利WO2019228441中被命名为APPA-M2-O的植酸酶突变体氨基酸序列，其氨基酸序列如本发明中的SEQ ID NO：2所示，本发明将该植酸酶突变体命名为APPA-Y0。APPA-Y0是大肠杆菌来源的野生型植酸酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)经突变筛选、糖基化和二硫键位点引入后获得的植酸酶突变体，具体方法如WO2019228441所述，该突变体具有优良的耐热稳定性能。本实施例是在APPA-Y0序列的基础上做的进一步突变和筛选。
由金斯瑞生物科技股份有限公司合成APPA-Y0在毕赤酵母中表达的核酸序列，将该基因克隆到毕赤酵母载体中，表达载体为pPIC9K，使用酿酒酵母的Alpha因子作为信号肽，植酸酶表达质粒pPIC9K-APPA-Y0如图1所示。
在第一轮变体筛选中，使用APPA-Y0作为亲本植酸酶，为了改善亲本植酸酶的热稳定性，发明人基于APPA-Y0的氨基酸序列和蛋白质结构分析设计了如下37个突变体，如表1所示。设计中每个变体相对于亲本植酸酶APPA-Y0包含有一个氨基酸的取代，将这些变体分别命名为APPA-Y1至APPA-Y37，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3-39所示。
表1第一轮构建的植酸酶变体
变体质粒按照上表变体名称分别命名为pPIC9K-APPA-Y1至pPIC9K-APPA-Y37。为了将亲本植酸酶及其变体进行表达，使用Pichia expression kit(Invitrogen)并参考其说明书对毕赤酵母GS115和质粒进行操作。具体如下，将毕赤酵母GS115菌株使用YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白、2％葡萄糖和1.5％琼脂)平板30℃培养48h后，挑取单克隆到4mLYPD液体培养基(1％酵母提取物、2％蛋白、2％葡萄糖)中，30℃200rpm培养12h，随后转接到30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养4-5h检测到OD600值在1.1-1.3范围后，将培养液在4℃9,000rpm离心2min,分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1mL灭菌水重悬菌体，4℃9,000rpm离心2min,弃上清。重复上述步骤，将预冷的1mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃、9,000rpm离心2min弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1mol/L)重悬菌体，至此感受态制备完成。将表达质粒pPIC9K-APPA-Y0和其他37个变体用BglII进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法转化上述毕赤酵母GS115感受态中，将混合物均匀涂布于MD平板上，30℃倒置培养2-3天，将平板上所有的菌落都用无菌水洗下来后涂布在含不同浓度遗传霉素的YPD(0.5mg/mL-8mg/mL)平板上筛选多拷贝的转化子。在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株命名为APPA-Y0和APPA-Y1至APPA-Y37。将上述筛选获得的克隆分别转接于BMGY培养基中，在30℃、250rpm振荡摇床中培养24h，再转入BMMY培养基中，维持30℃、250rpm条件，每天添加0.5％的甲醇，诱导表达120h后；9000-12000rpm离心10min以去除菌体，得到含植酸酶APPA-Y0和其他37个变体的发酵上清液，SDS-PAGE结果显示APPA-Y1，APPA-Y7,APPA-Y8和APPA-Y16四个变体未能表达，剩余的APPA-Y0和其它33个变体都有表达。
实施例2热稳定性测定
植酸酶活力测定遵循GBT 18634-2009文件标准。将实施例1中的33个变体样品及亲本植酸酶APPA-Y0用水稀释至100U/mL。取9mL水于25mL比色管中，用移液枪吸取酶样品1mL，快速加入到试管中并用混匀器快速混匀后，在85℃恒温水浴中准确放置5min。迅速冷却至室温，用水进行稀释，测定各样品残余活力，从而计算不同处理温度下酶的残余活力，此处将热处理前的酶活定为100％，得到的热稳定性数据如图2所示。
根据上述实验结果，突变点的引入对植酸酶会产生显著影响：
一些突变点的引入会导致植酸酶不能正常表达，如APPA-Y1，APPA-Y7,APPA-Y8和APPA-Y16；
一些突变点的引入会导致植酸酶热稳定性降低，如APPA-Y22和APPA-Y29，上述两个突变体的热稳定性显著低于APPA-Y0的热稳定性；
还有一些突变点的引入显著提高了植酸酶的耐热性，如APPA-Y2(M29L)，APPA-Y4(R50K)，APPA-Y5(G52A)，APPA-Y6(L58M)，APPA-Y10(A105F)，APPA-Y12(T118Q)，APPA-Y25(T295P)，APPA-Y28(L307I)，APPA-Y30(Q349K)，APPA-Y33(M360L)，APPA-Y36(E374R)，其中APPA-Y25(T295P)，APPA-Y30(Q349K)，APPA-Y36(E374R)的表现最好，与亲本植酸酶APPA-Y0相比，变体的残余活力提高了19-22％左右。
实施例3对实施例2中的3个突变位点进行饱和突变
对实施例2中耐热性提高最多的3个突变菌株APPA-Y25，APPA-Y30，APPA-Y36对应的3个突变点T295P，Q349K，E374R进行饱和突变，即分别将295位、349位、374位的氨基酸突变成其他18个氨基酸，对应的序列命名见下表2-4所示。
表2第295位氨基酸的定点饱和突变
表3第349位氨基酸的定点饱和突变
突变体名称 突变位点 序列编号
APPA-Y30-1 Q349A SEQ ID NO：62
APPA-Y30-2 Q349C SEQ ID NO：63
APPA-Y30-3 Q349D SEQ ID NO：64
APPA-Y30-4 Q349E SEQ ID NO：65
APPA-Y30-5 Q349F SEQ ID NO：66
APPA-Y30-6 Q349G SEQ ID NO：67
APPA-Y30-7 Q349H SEQ ID NO：68
APPA-Y30-8 Q349I SEQ ID NO：69
APPA-Y30-9 Q349L SEQ ID NO：70
APPA-Y30-10 Q349M SEQ ID NO：71
APPA-Y30-11 Q349N SEQ ID NO：72
APPA-Y30-12 Q349P SEQ ID NO：73
APPA-Y30-13 Q349R SEQ ID NO：74
APPA-Y30-14 Q349S SEQ ID NO：75
APPA-Y30-15 Q349T SEQ ID NO：76
APPA-Y30-16 Q349V SEQ ID NO：77
APPA-Y30-17 Q349W SEQ ID NO：78
APPA-Y30-18 Q349Y SEQ ID NO：79
表4第374位氨基酸的定点饱和突变
按照实施例1中的方法，使用毕赤酵母表达各变体，随后按照实施例2中的方法测定各变体的热稳定性，结果如图3-5所示。
图中结果表明对3个位置的氨基酸分别进行饱和突变对变体有显著影响：
有的突变甚至导致了不能正常表达，如APPA-Y25-2，APPA-Y25-17，APPA-Y30-3，APPA-Y30-5，APPA-Y30-8，APPA-Y30-12和APPA-Y30-18；
另外一些突变点引入会导致植酸酶稳定性降低，如APPA-Y30-2，APPA-Y36-2和APPA-Y36-9，上述三个突变体的热稳定性显著低于APPA-Y0的热稳定性；
还有一些突变点的引入显著提高了植酸酶的耐热性，如APPA-Y25-6(T295G)，APPA-Y25-9(T295K)，APPA-Y25-10(T295L)，APPA-Y25-13(T295Q)，APPA-Y25-18(T295Y)，APPA-Y30-9(Q349L)，APPA-Y30-6(Q349G)，APPA-Y30-7(Q349H)，APPA-Y30-13(Q349R)，APPA-Y30-15(Q349T)，APPA-Y36-11(E374N)，APPA-Y36-14(E374S)，APPA-Y36-15(E374T)，APPA-Y36-16(E374V)，APPA-Y36-4(E374F),APPA-Y36-8(E374K)，APPA-Y36-12(E374P)，APPA-Y36-18(E374Y)。
通过实施例2和实施例3的实验数据可以看出，当在亲本植酸酶的基础上引入单个氨基酸的取代时，突变点T295P、Q349K、E374R、T295Y、Q349L或E374V的引入带来的效果更好，可以使植酸酶的热稳定性显著提升。
实施例4突变点的组合
将实施例2中的3个突变菌株APPA-Y25，APPA-Y30，APPA-Y36对应的3个突变点T295P，Q349K，E374R进行叠加，按照实施例1中的方法构建相应的变体并在毕赤酵母中表达，具体突变情况参见下表5。按照实施例2中的检测方法进行热稳定性测定，得到的热稳定性数据如图6所示。由检测结果可见，组合突变后的植酸酶变体，与亲本植酸酶APPA-Y0相比，耐热性能均有明显提升；一些突变的叠加使得变体耐热性与APPA-Y0相比提高了16％-27％，说明合适的组合可以创造出更稳定的突变体，可以预见其在饲料造粒中会有良好表现。
表5组合突变后的植酸酶变体
序列名称 突变位点 序列编号
APPA-Y38 T295P+Q349K SEQ ID NO：40
APPA-Y39 T295P+E374R SEQ ID NO：41
APPA-Y40 Q349K+E374R SEQ ID NO：42
APPA-Y41 T295P+Q349K+E374R SEQ ID NO：43
实施例5黑曲霉表达亲本植酸酶APPA-An1的变体
APPA-An1是大肠杆菌野生型植酸酶经突变获得的另一耐热优良突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示：
QSEEELKLESVVIVSRHGVRAPTKFTQLMQDVTPYAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADELLPNQTCPQPGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPGCAITVHHQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDVARVTRAILERAGGSIADFTNHYQPAFRELERVLNFSQSPLCKNREKQNEPCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAWSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAYFDLLQRTPEVARSAATPLLDLIKTALTPNGTQKSAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNYPPGGELVFERWRRLSDNSCWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLPGCEERNAQGMCSCAGFTQIVNEARIPACSL*
为了测试本发明中发现的突变位点在该已有的植酸酶突变体上是否也可以发挥功能，进一步提高植酸酶的稳定性，该实施例将APPA-An1作为亲本植酸酶，将氨基酸取代Q349K、E374R单独或组合添加到APPA-An1的氨基酸序列中，各突变体分别按照APPA-An2～APPA-An4进行命名，如下表所示。按照专利申请CN107353327A中描述的方法，在黑曲霉中表达上述植酸酶突变体。获得摇瓶上清液后按照实施例2描述进行热稳定性测定，85℃条件下孵育5分钟，实验结果如图7所示。实验结果表明，3个变体都表现出显著的稳定性性能提升，体现出比亲本植酸酶APPA-An1更为优秀的稳定性，即在亲本植酸酶中引入本发明的1-2个突变点后可以获得更高稳定性的植酸酶变体，可以预见其在饲料造粒中会有良好表现。
表6亲本APPA-An1的变体
突变体名称 突变位点 序列编号
APPA-An1 亲本 SEQ ID NO：98
APPA-An2 Q349K SEQ ID NO：99
APPA-An3 E374R SEQ ID NO：100
APPA-An4 Q349K+E374R SEQ ID NO：101
实施例6黑曲霉表达亲本植酸酶APPA-An5的变体
APPA-An5是野生型植酸酶经突变获得的另一耐热优良突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：102所示。为了测试本发明中发现的突变位点在该现有的植酸酶突变体上是否也可以发挥功能，进一步提高植酸酶的稳定性，该实施例将APPA-An5作为亲本植酸酶，将T295P、Q349K、E374R单独或组合添加到APPA-An5的氨基酸序列中，各突变体分别按照APPA-An6～APPA-An9进行命名，如下表7所示。按照实施例5的方法，在黑曲霉中表达上述植酸酶变体。获得摇瓶上清液后按照实施例2的描述进行热稳定性测定，85℃条件下孵育5分钟。实验结果如图8所示。我们发现4个突变体都表现出显著的稳定性性能提升，体现出比亲本APPA-An5更为优秀的稳定性，即在亲本植酸酶突变体中引入本发明的1-2个突变点后可以获得更高稳定性的植酸酶突变体，可以预见其在饲料造粒中会有良好表现。
表7植酸酶突变体
突变体名称 突变位点 序列编号
APPA-An5 亲本 SEQ ID NO：102
APPA-An6 T295P SEQ ID NO：103
APPA-An7 Q349K SEQ ID NO：104
APPA-An8 E374R SEQ ID NO：105
APPA-An9 Q349K+E374R SEQ ID NO：106
实施例7黑曲霉表达亲本植酸酶APPA-An10的变体
APPA-An10是野生型植酸酶经突变筛选获得的另一耐热优良突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:107所示。为了测试本发明中发现的突变位点在该现有的植酸酶突变体上是否也可以发挥功能，进一步提高植酸酶的稳定性，该实施例将APPA-An10作为亲本，将T295P、Q349K、E374R单独或组合添加到APPA-An10的氨基酸序列中，各突变体分别按照APPA-An11～APPA-An14进行命名，如下表8所示。按照实施例5的方法，在黑曲霉中表达上述植酸酶变体。获得摇瓶上清液后按照实施例2描述进行热稳定性测定，85℃条件下孵育5分钟。实验结果如图9所示。我们发现4个变体都表现出显著的稳定性性能提升，体现出比亲本APPA-An10更为优秀的稳定性，即在亲本植酸酶突变体中引入本发明的1-3个突变点后可以获得更高稳定性的植酸酶突变体，可以预见其在饲料造粒中会有良好表现。
表8植酸酶突变体
实施例8黑曲霉表达亲本植酸酶APPA-An15的变体
APPA-An15是野生型植酸酶经突变筛选获得的另一耐热优良突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示。为了测试本发明中发现的突变位点在该现有的植酸酶突变体上是否也可以发挥功能，进一步提高植酸酶的稳定性，该实施例将APPA-An15作为亲本，将T295P、E374R单独添加到APPA-An15的氨基酸序列中，各突变体分别按照APPA-An16～APPA-An17进行命名，如下表所示。按照实施例5的方法，在黑曲霉中表达上述植酸酶突变体。获得摇瓶上清液后按照实施例2描述进行热稳定性测定，85℃条件下孵育5分钟。实验结果如图10所示。我们发现2个突变体都表现出显著的稳定性性能提升，体现出比亲本APPA-An15更为优秀的稳定性，即在亲本植酸酶突变体中引入本发明的1个突变点后可以获得更高稳定性的植酸酶突变体，可以预见其在饲料造粒中会有良好表现。
表9植酸酶突变体
突变体名称 突变位点 序列编号
APPA-An15 亲本 SEQ ID NO：112
APPA-An16 T295P SEQ ID NO：113
APPA-An17 E374R SEQ ID NO：114
实施例9黑曲霉表达亲本植酸酶APPA-An18的变体
APPA-An18是野生型植酸酶经突变筛选获得的另一耐热优良突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:115所示。为了测试本发明中发现的突变位点在该现有的植酸酶突变体上是否也可以发挥功能，进一步提高植酸酶的稳定性，该实施例将APPA-An18作为亲本，将T295P、Q349K、E374R单独或组合添加到APPA-An18的氨基酸序列中，各突变体分别按照APPA-An19～APPA-An21进行命名，如下表10所示。按照实施例5的方法，在黑曲霉中表达上述植酸酶变体。获得摇瓶上清液后按照实施例2描述进行热稳定性测定，85℃条件下孵育5分钟。实验结果如图11所示。我们发现3个突变体都表现出显著的稳定性性能提升，体现出比亲本APPA-An18更为优秀的稳定性，即在亲本植酸酶突变体中引入本发明的1-3个突变点后可以获得更高稳定性的植酸酶突变体，可以预见其在饲料造粒中会有良好表现。
表10植酸酶突变体
突变体名称 突变位点 序列编号
APPA-An18 亲本 SEQ ID NO：115
APPA-An19 Q349K SEQ ID NO：116
APPA-An20 Q349K+E374R SEQ ID NO：117
APPA-An21 T295P+Q349K+E374R SEQ ID NO：118
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种亲本植酸酶变体，其特征在于，包括：
(a)所述变体相对于其亲本植酸酶，在对应于SEQ ID NO:1的第295位、第349位、第374位上具有一个或多个氨基酸的取代，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:98相比，具有至少80％的序列一致性；
(b)所述变体具有植酸酶活性；并且
(c)与亲本植酸酶相比，所述变体具有增加的热稳定性。
2.权利要求1所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:98相比，具有至少90％的序列一致性；优选的，具有至少95％的序列一致性；更优选的，具有至少98％的序列一致性。
3.根据权利要求2所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述亲本植酸酶的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:112或SEQID NO:115。
4.根据权利要求3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第295位的氨基酸被取代为P、Y、G、K、L或Q；优选地，被取代为P或Y。
5.根据权利要求3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第349位的氨基酸被取代为选自K、L、G、H、R或T；优选地，被取代为K或L。
6.根据权利要求3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第374位的氨基酸被取代为选自R、V、N、S、T、F、K、P或Y；优选地，被取代为R或V。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体相对于其亲本植酸酶，包含选自下组的氨基酸取代：
T295P；Q349K；E374R；T295Y；Q349L；E374V；
T295P+Q349K；T295P+E374R；T295P+Q349L；T295P+E374V；
T295Y+Q349K；T295Y+E374R；T295Y+Q349L；T295Y+E374V；
Q349L+E374R；Q349K+E374R；Q349L+E374V；Q349K+E374V；
T295P+Q349K+E374R；T295Y+Q349K+E374R；
T295P+Q349L+E374R；T295Y+Q349L+E374R；
T295P+Q349K+E374V；T295Y+Q349K+E374V；
T295P+Q349L+E374V；T295Y+Q349L+E374V。
8.根据权利要求7所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体与其亲本植酸酶的氨基酸序列相比，具有至少90％的序列一致性；优选的，具有至少95％的序列一致性；更优选的，具有至少98％的序列一致性。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体还进一步包括至少一对引入的二硫键。
10.根据权利要求9所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体包括在与SEQ IDNO:1的第346位对应的位置上的氨基酸残基、以及与SEQ ID NO:1的第393位对应的位置上的氨基酸残基之间形成二硫键。
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