CN117679555B - 落叶松纤维素水凝胶及其制备方法与促进骨骼修复的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域,涉及伤口敷料,具体涉及一种落叶松纤维素水凝胶及其制备方法与促进骨骼修复的应用,所述水凝胶以L‑精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与氧化纤维素水溶液为基质,通过化学反应制备得到;所述氧化纤维素是以从落叶松木屑中提取的纤维素为原料,经氧化反应得到的产物;所述落叶松纤维素水凝胶具有止血、抗菌、促进骨骼修复的活性。该水凝胶可注射性好、机械性能好、胶凝速度快、粘连性好、生物相容性好,且具有优异的缓释、止血、抗菌、促进骨骼修复的活性,以该水凝胶为基材,通过与负载的活性成分协同作用,有利于进一步提高骨骼修复的效果。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,涉及伤口敷料,具体涉及一种落叶松纤维素水凝胶及其制备方法与促进骨骼修复的应用。
背景技术
骨组织作为人体的坚硬组织,在日常生活中可以支持人的各种活动并保护各种器官。此外,骨组织具有维持体内钙磷平衡的作用。然而,骨组织容易受到外界因素的损伤,创伤和肿瘤切除是引起骨缺损的常见疾病,可引起许多严重问题,降低生活质量。目前,小面积的骨折主要靠机体自身功能修复,而大面积的骨缺损通常难以依靠自身修复,必须通过治疗,促进骨缺损的修复。在骨缺损临床治疗中,自体骨和异体骨移植是临床上最常见的骨修复方法。然而,这种骨移植的方法具有一些局限性,例如供体短缺、自身发生的排斥反应和免疫应答有限。这些缺点限制了它们的应用,对人们的生活带来了极大的困扰。
近年来,生物活性支架在组织修复中得到了广泛的应用,可以代替骨移植物促进骨再生。用于骨修复的支架应具备以下优点:(1)良好的生物相容性;(2)良好的生物降解性;(3)骨诱导和骨传导的特点;(4)适宜的孔隙度;(5)机械性能优良。
水凝胶作为一种具有三维网络结构的生物组织工程支架能够模拟细胞外基质(ECM)为细胞的增殖和黏附提供合适的微环境。水凝胶组织生物工程支架具有良好的生物相容性,可实现药物的持续释放,诱导骨再生,同时其质地柔软,可减轻周围细胞和组织的炎症反应,与许多柔软的生物组织相匹配,可有效弥补中药外用剂型的不足。因此,水凝胶已经成为医学组织工程研究的热点,例如促进伤口修复、止血支架和修复骨缺损。与传统的水凝胶相比,可注射水凝胶可以填补不规则缺损,提高骨损伤患者的顺应性,避免因植入时间长而增加感染风险。
现有可注射水凝胶一般以聚合物和多糖类化合物作为基质通过化学反应制备得到的。然而,在大多数情况下,可注射水凝胶的力学性能较弱,不能满足骨修复支架的要求,且水凝胶基材基本不具备促进骨骼修复的作用或促进骨骼修复的作用微乎其微,主要利用水凝胶内负载的用于促进骨修复的活性成分来达到促进骨骼修复的目的。此种方式不利于进一步提高骨骼修复的效果。因此,有必要提供一种可注射性好、机械性能好、胶凝速度快、粘连性好、生物相容性好,且具有优异的缓释、止血、抗菌、促进骨骼修复活性的水凝胶基材。
发明内容
鉴于上述技术问题和缺陷,本发明的目的在于提供一种落叶松纤维素水凝胶,该水凝胶可注射性好、机械性能好、胶凝速度快、粘连性好、生物相容性好,且具有优异的缓释、止血、抗菌、促进骨骼修复的活性,以该水凝胶为基材,通过与负载的活性成分协同作用,有利于进一步提高骨骼修复的效果。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种落叶松纤维素水凝胶,所述落叶松纤维素水凝胶以L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与氧化纤维素水溶液为基质,通过化学反应制备得到;所述氧化纤维素是以从落叶松木屑中提取的纤维素为原料,经氧化反应得到的产物;所述落叶松纤维素水凝胶具有止血、抗菌、促进骨骼修复的活性。
作为本发明的优选,所述L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液的浓度为2%,氧化纤维素水溶液的浓度为1-3%,2%的L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与1-3%的氧化纤维素水溶液以2:1的体积混合。
作为本发明的优选,所述落叶松纤维素水凝胶内负载促进骨骼修复的活性成分,所述促进骨骼修复的活性成分包括二氢槲皮素。
作为本发明的优选,所述氧化纤维素水溶液的浓度为2%。
本发明还提供一种落叶松纤维素水凝胶的制备方法,该方法包括以下步骤:
步骤1、从落叶松木屑中提取纤维素;
步骤2、将步骤1的纤维素与高碘酸钠混合于水中,进行氧化反应,得氧化纤维素;
步骤3、将L-精氨酸和壳聚糖混合搅拌,得L-精氨酸修饰的壳聚糖;
步骤4、将L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与氧化纤维素水溶液混合,制备落叶松纤维素水凝胶;所述落叶松纤维素水凝胶具有止血、抗菌、促进骨骼修复的活性。
作为本发明的优选,所述步骤1从落叶松木屑中提取纤维素的具体制备方法为:将落叶松木屑在KOH溶液中搅拌过夜,木屑与碱性溶液的比例保持在1:10 w/v;碱性处理产物用去离子水洗涤至pH=7,再用7%亚氯酸钠和浓盐酸在80℃下漂白,碱性处理产物与7%亚氯酸钠溶液的比例保持在1:20 w/v,将漂白后的产物用去离子水多次洗涤,50℃下干燥,得到纤维素。
作为本发明的优选,所述步骤2氧化纤维素的具体制备方法为:将从落叶松木屑中提取的纤维素与高碘酸钠混合于水中,在黑暗中搅拌,之后用去离子水洗涤,得到氧化纤维素。
作为本发明的优选,所述步骤4将2%的L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与1-3%的氧化纤维素水溶液以2:1的体积混合,制备落叶松纤维素水凝胶。
作为本发明的优选,所述落叶松纤维素水凝胶内负载促进骨骼修复的活性成分,所述促进骨骼修复的活性成分包括二氢槲皮素;负载二氢槲皮素的落叶松纤维素水凝胶的制备方法为:将二氢槲皮素预先溶解在2%的氧化纤维素水溶液中,之后与2%的L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液以1:2的体积混合,所述二氢槲皮素的终浓度为4mg/mL。
本发明提供的落叶松纤维素水凝胶可通过激活PI3K/AKT信号通路促进血管生成,加速骨缺损修复,蛋白印记分析试验表明,水凝胶处理增强了组织中ALP、BMP2、OCN、Osx等成骨标志物的表达,对颅骨修复和新骨形成具有积极作用,因此其可以在制备促进骨骼修复的生物支架中应用。
本发明提供的落叶松纤维素水凝胶经体内和体外止血试验证明,其具有优异的止血效果,因此其可以在制备止血药物中应用。
本发明提供的落叶松纤维素水凝胶可显著提高p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和VEGF的表达;因此,其可以在制备PI3K/AKT信号通路激活剂中应用,通过激活PI3K/AKT信号通路促进血管生成,加速骨缺损修复。
本发明的优点和有益效果:
(1)本发明提供的水凝胶以L-精氨酸接枝壳聚糖(CA)与氧化纤维素作为基材,上述两种物质按照一定比例混合后能够制备均匀多孔且符合骨修复支架要求的水凝胶,同时还能充分发挥壳聚糖的性能,解决壳聚糖水中溶解度差,无法制备水凝胶的技术问题。
(2)本发明提供的水凝胶可注射性好、机械性能好、胶凝速度快、粘连性好、生物相容性好,通过控制DLC水溶液的浓度可制备内部呈现蜂巢状结构的水凝胶,且水凝胶孔径小,尺寸在30-50nn之间,此种结构更利于骨细胞附着,促进骨骼修复。
(3)本发明提供的水凝胶基材可以很好地连接骨缺损部位与周围天然骨组织之间的营养物质和废物交换,有助于细胞增殖和分化;此外,该水凝胶基材既可通过激活PI3K/AKT信号通路促进血管生成,加速骨缺损修复,还能促进ALP、BMP2、OCN、OPN等成骨相关因子的表达,这对颅骨修复和新骨形成极其有利。
(4)本发明提供的水凝胶中精氨酸的引入增强了水凝胶的血管生成活性,有利于骨再生,且水凝胶基材内负载的二氢槲皮素与水凝胶基材协同作用后,可以安全有效地促进骨的再生和重建,为骨组织工程中新的治疗方法提供良好的骨替代品。
(5)本发明提供的水凝胶基材具有优异的抗菌活性,且负载二氢槲皮素可进一步提高水凝胶的抗菌活性,对骨再生有积极的影响,这归因于氧化后的纤维素和接枝壳聚糖的精氨酸加强了壳聚糖的抗菌活性,并且黄酮类化合物的引入也进一步增强了水凝胶的这一作用。
(6)本发明提供的水凝胶基材具有优异的止血活性,水凝胶的止血作用主要归因于壳聚糖和水凝胶良好的组织粘附能力,其可以紧密粘附在创面部位,提供稳定的凝胶网络作为物理屏障,加速血液凝固,而且氧化后的纤维素和接枝壳聚糖的精氨酸加强了壳聚糖的止血活性,从而更有益于骨缺损的修复。
(7)本发明提供的水凝胶具有良好的药物缓释能力,7天的累积释放率为65%,这有利用活性成分(二氢槲皮素)长久、持续发挥作用,从而加速骨缺损修复。
(8)本发明提供的水凝胶基材具有抗氧化活性,且负载二氢槲皮素后水凝胶的抗氧化性能显著提高,对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为73.74±0.67%和92.09±0.10%,可避免因过多活性氧的存在影响骨再生。
附图说明
图1是落叶松木屑(LS)、纤维素(LC)和商品纤维素(CC)的分析图:其中,(A)落叶松木屑和纤维素的SEM图像;(B)落叶松木屑和纤维素的XRD谱图;(C)纤维素和商品纤维素的红外光谱。
图2是氧化纤维素(DLC)、纤维素(LC)、L-精氨酸修饰的壳聚糖(CA)、壳聚糖(CS)与l -精氨酸(L-Arg)的分析图:其中,(A) DLC与LC的XRD谱;(B) DLC与LC的FTIR光谱;(C)DLC氧化度测试;(D) CA、CS与L-Arg的XRD谱;(E) CA、CS与L-Arg的FTIR光谱。
图3是水凝胶DCA1、 DCA2与DCA3的SEM图像。
图4是水凝胶DCA2、水凝胶DCT 、DLC、CA、TAX的分析图;其中,(A) DCA2、DLC、CA的XRD谱;(B) DCA2、DLC、CA的FTIR谱;(C) DCT 、DCA2、TAX的XRD谱;(D) DCT、DCA2、TAX的FTIR谱。
图5是水凝胶的性能试验;其中,(A)DCA1、DCA2、DCA3的制备;(B) DCA1、DCA2、DCA3的凝胶时间;(C) DCA1、DCA2、DCA3凝胶强度;(D) DCA1、DCA2、DCA3溶胀试验;(E) DCA1、DCA2、DCA3降解试验;* P<0.05, * * P<0.01。
图6是水凝胶的流变分析;其中,(A)水凝胶可注射性试验;(B) 水凝胶的弹性分析;(C) 水凝胶的粘度分析。
图7是水凝胶的缓释、抗氧化和抗菌试验;其中,(A) DCT的缓释性能测试;(B) DCT对DPPH自由基的清除率;(C) DCT对ABTS自由基的清除率;(D) DCT抑菌活性试验;** P<0.01。
图8是水凝胶的粘附、细胞毒性、溶血试验;其中,(A)水凝胶黏附试验;(B)水凝胶细胞相容性试验;(C)水凝胶血液相容性试验;* P<0.05,* * P<0.01。
图9是水凝胶的止血试验;其中,(A)水凝胶体外凝血指数;(B)水凝胶体外凝固时间;(C)肝出血水凝胶止血能力试验;(D)截尾水凝胶止血能力试验;* P<0.05, * * P<0.01。
图10是水凝胶的体内骨修复试验;其中,(A)术后8周CT图像;(B) BV/TV定量分析;(C) TB.N定量分析;(D) TB.Th定量分析;(E) TB.Sp定量分析;* P<0.05,* * P<0.01。
图11是骨组织H&E染色。
图12是骨组织Masson染色。
图13是骨组织免疫组化染色;* P<0.05,* * P<0.01。
图14 是Western blot分析图一;其中,(A) PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGF和β-actin的蛋白条带;(B) p-PI3K/PI3K的定量分析;(C) p-AKT/AKT的定量分析;(D)VEGF的定量分析;*p<0.05, **p<0.01。
图15 是Western blot分析图二;其中,(A) ALP、BMP2、OCN、Osx和β-actin的蛋白条带;(B) ALP的定量分析;(C) BMP2的定量分析;(D) OCN的定量分析;(E) Osx的定量分析;* P<0.05,* * P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明,但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数,可参照常规技术进行。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1.材料与方法
1.1 材料与试剂
二氢槲皮素(Taxifolin,TAX)购于中国食品药品监督管理研究院,批号:111816-201102,纯度为98.0%;落叶松木屑(LS)由吉林健维天然生物技术有限公司(中国临江)提供;壳聚糖(CS)脱乙酰度≥95%,粘度:200-400 mPa s,分子量:160-400 kDa,购于中国上海Meryer公司。L-精氨酸(L-Arg,MW: 174.20)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、n -羟基琥珀酸(NHS)、高碘酸钠和商品纤维素(CC)购于中国上海的McLean;PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGF、ALP、OCN、BMP2、Osx、β-actin和山羊抗兔二抗均来自Proteintech (SantaCruz, CA, usa)。
1.2从落叶松木屑中提取纤维素
将50g落叶松木屑(LS)在2M KOH溶液中搅拌过夜,木屑与碱性溶液的比例保持在1:10 (w/v)。碱性处理产物用去离子水洗涤至pH 7,再用7%亚氯酸钠和浓盐酸10ml在80℃下漂白3小时;产物与亚氯酸钠溶液的比例保持在1:20 (w/v)。将漂白后的产物用去离子水多次洗涤,50℃下干燥24小时,得到纤维素(LC)供进一步分析。
利用扫描电子显微镜(SEM, SS-550, Shimadzu, Japan)对落叶松木屑(也称落叶松锯末)和纤维素的表面形貌进行了分析:落叶松木屑和纤维素样品安装在SEM样品支架上,用金溅射40秒。然后,用扫描电镜在4000X的放大倍率下捕获样品图像。
通过傅里叶变换红外(FTIR, FTIR-650, TianjinPortEast, China)分析确定了纤维素中存在的官能团:将纤维素(LC)和商品纤维素(CC)与KBr按1:100 (w/w)的比例混合,在压力下进行实验;扫描波数范围为4000-500cm-1。
采用x射线衍射仪(XRD, D8Advance, Bruker, Germany)对落叶松木屑和纤维素的结晶度进行了分析,扫描范围为10°-30°,扫描速率为2°/min。
1.3氧化纤维素和L-精氨酸修饰的壳聚糖的合成
氧化纤维素(DLC)的制备:将LC 10g与高碘酸钠12.2g混合于1000mL水中;在黑暗中搅拌4天后,用去离子水洗涤,得到DLC。
L-精氨酸修饰的壳聚糖(CA)的制备:将L-精氨酸和CS(重量比1:1)混合搅拌1天,透析2天后获得CA。
采用XRD分析了DLC和CA的结晶度变化,扫描范围为5°~ 50°,扫描速率为2°/min。
采用扫描波数范围为4000 ~ 500cm-1的FTIR分析DLC和CA的官能团变化。
采用盐酸羟胺滴定法测定DLC的氧化程度:将盐酸羟胺上的活性氨基与DLC上的醛基反应,用氢氧化钠电位滴定法测定反应释放的盐酸量。
采用Origin9.0软件绘制pH-V滴定曲线,计算DLC的氧化度。
1.4水凝胶的制备与表征
用DLC交联CA制备水凝胶,将2%的CA水溶液与不同浓度的DLC水溶液(1%、2%和3%)以2:1的体积比交联得到DCA1、DCA2和DCA3。
DCT是通过将TAX预先溶解在2%的DLC水溶液中,之后与2%的CA水溶液以1:2的体积比混合得到,TAX的终浓度为4mg/mL。
通过扫描电镜分析水凝胶的表面形貌,放大比例分别为50X、100X和200X。
采用XRD分析了DCA和DCT的结晶度变化,扫描范围为5°~ 50°,扫描速率为2°/min。
采用扫描波数范围为4000 ~ 500cm-1的FTIR分析DCA和DCT的官能团变化。
1.5水凝胶性能试验
通过倒置离心管记录凝胶时间:将混合物加入离心管中,置于37℃环境中。凝胶时间测量为倒置离心管后30秒内混合物停止流动的时间。
通过织构分析测试水凝胶的力学性能:将直径约2cm,高度约10mm的圆柱形水凝胶用P/0.5圆柱探针以5g的力压缩至水凝胶样品原始高度的30%;压缩前速度为5mm/s,压缩中速度为1mm/s,压缩后速度为5mm/s。
用重量法测定水凝胶的溶胀性能:将冷冻干燥后的水凝胶样品在10mL PBS溶液中37℃浸泡24h,擦去水凝胶表面残留的水分,记录其质量变化。
体外降解试验:将水凝胶浸泡在pH为7.4的PBS中,恒温(37℃),以100 rpm振荡。在预定的时间点,取出水凝胶样品,去除多余的PBS进行称重和计算。
1.6流变学研究
用AntonPaar MCR302流变仪研究了水凝胶的流变特性:所有实验均采用25mm平行板,间隙高度为1mm,温度为25℃;将顶板降低至1mm间隙后,刮去多余的水凝胶;将水凝胶平衡5分钟,在0.1 ~ 100 rad/s范围内,以0.5%的应变扫描角频率。
为了验证水凝胶的可注射性,将用亚甲蓝染色的水凝胶装进1mL注射器中,直接挤压到培养皿中,画出字母“JLAU”。此外,在0.1~100s-1范围内测量了频率为10.0rad/s的剪切速率扫描,表征了水凝胶的剪切变薄行为。
1.7缓释、抗氧化、抗菌试验
将DCT置于3mL PBS溶液中,37℃,100 rpm;在预先计划的时间点取出1mL释放的混合物,用等体积的新鲜培养基代替。用紫外-可见分光光度计(TU-1950,北京浦肯野通用仪器公司,中国)测定DCT释放的TAX的浓度。
通过测定水凝胶对DPPH和ABTS自由基的清除能力来评价水凝胶的抗氧化能力。Vc和TAX作为阳性对照,PBS作为阴性对照。首先用均质机将水凝胶破碎,与DPPH工作液按1:2(v/v)混合;25℃暗置30分钟,在517nm处测定上清吸光度,计算水凝胶对DPPH的清除率。将水凝胶与ABTS工作液按1:9(v/v)的比例混合,在25℃避光保存6分钟。然后,测定上清液在734nm处的吸光度,计算水凝胶的ABTS清除率。
采用平板计数法评价水凝胶的抑菌性能,以金黄色葡萄球菌(购自上海雅吉生物科技有限公司)和大肠杆菌(购自上海雅吉生物科技有限公司)为模型菌。首先,将所有菌株在37℃ LB液体培养基中振荡至对数生长阶段。用LB液体培养基将菌液稀释至600nm吸光度为0.1,再稀释104倍后继续应用。将水凝胶加入菌悬液中,在37℃摇培养箱中孵育2h,取50μL在琼脂平板上孵育24h,计数并计算抑菌率。
1.8粘附、细胞毒性、溶血试验
通过搭接剪切试验定量评价水凝胶的粘接强度。拉力试验采用万能试验机(中国济南恒测试验机WDW-200H),配备50N力传感器,室温下拉伸速率为10mm·min-1。将200 μL的水凝胶样品置于两种皮肤组织表面,并在室温下将粘附面积保持在1cm×1cm,然后测试水凝胶的粘附强度。
根据上述方法进行水凝胶对MC3T3-E1细胞(购自长沙市博辉生物科技有限公司)的细胞毒性实验。简而言之,水凝胶经紫外线照射后,在Αmem培养基中37℃浸泡24h,通过0.22 μm过滤器,得到水凝胶提取物。MC3T3-E1细胞接种于96孔板中,密度为每孔2个×103细胞。细胞黏附24小时后,用水凝胶提取物替代培养基1、3、5天。然后用MTT法测定细胞活力。
根据现有文献报道进行溶血试验。取小鼠新鲜血液,离心(1500rpm) 15分钟,从血液中分离红细胞。得到的红细胞用PBS缓冲液洗涤三次,并以1:20(v/v)的比例稀释。将水凝胶加入红细胞悬浮液中作为治疗组。以0.2% Triton-X-100溶液为阳性对照,PBS缓冲液为阴性对照。37℃孵育1小时后,实验组和对照组分别在3500rpm下离心10分钟。然后记录上清液在545nm处的吸光度,计算溶血率。
1.9止血试验
体外BCI法测定水凝胶的止血性能。冷冻干燥后的水凝胶在37℃离心管中预干5分钟后,加入抗凝全血0.1 mL,然后立即滴入0.2 mol/L的LCaCl2溶液0.02 mL。然后,水凝胶在37℃下继续凝固5分钟,再加入25 mL蒸馏水孵育5分钟。取100μL上清,通过酶标仪测定水凝胶在545nm处的吸光度,计算水凝胶的凝血指数(BCI)。
此外,BCT还用于测定水凝胶的体外止血性能。将冷冻干燥的水凝胶与0.5mL全血接触,每10s倒置一次,测定凝血时间。
通过小鼠肝出血模型和小鼠截尾模型进一步评价水凝胶在体内的止血潜能。简而言之,小鼠被麻醉并固定在手术软板上。通过腹部切口暴露小鼠肝脏,仔细去除肝脏周围的血清。将称重过的滤纸放在肝脏下面。用20G针诱导肝出血,软木板倾斜约30°。立即使用注射器将水凝胶涂抹在出血部位。将吸血滤纸称重,并与对照组(经肝穿刺后未处理)进行比较。预先称重过的滤纸放在机尾下面。用剪刀剪掉老鼠尾巴,将小鼠尾巴在空中放置15秒,以保证正常失血。然后,立即用注射器将水凝胶涂抹在出血部位,并将吸收血液的滤纸称重并与对照组进行比较。
1.10体内骨修复
1.10.1动物外科
体内骨修复实验参照文献报道进行。SD大鼠(8周龄,长春亿斯实验动物技术有限责任公司)麻醉后颅骨出现直径5mm的圆形缺损。然后,将大鼠随机分为三组:(1)对照组;(2) DCA组(DCA水凝胶处理);(3) DCT组(DCT水凝胶处理)。所有实验动物方案经吉林农业大学动物专业委员会批准。
1.10.2显微ct分析
收集颅骨,用4% (w/v)多聚甲醛固定。使用微型CT系统(Quantum GX2,PerkinElmer, USA)评估缺损区域新骨的形成情况。体积分数(BV/TV),小梁数(TB.N),小梁厚度(TB.Th)和小梁间隙(TB.Sp)采用CT Analyser 1.15.2.2软件定量测定。
1.10.3组织评价
颅骨包埋并切片,对OCN和OPN进行苏木精和伊红(H&E)染色、Masson染色和免疫组化(IHC)染色。使用显微镜(Eclipse E100, Nikon, Japan)拍摄图像。
1.10.4 Western Blot实验
颅骨愈合标本与RIPA裂解液(强)混合匀浆,4℃离心,收集上清备用。样品通过SDS-PAGE分离,转移到PVDF膜上。PVDF膜在5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白的TBST溶液中密封2小时,然后与PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、VEGF、ALP、BMP2、OCN、Osx和β-actin在4℃下孵育过夜,与二抗在室温下联合孵育1小时,然后用TBST洗涤3次。用ECL发光液检测蛋白带信号,用ImageJ软件定量。
1.11统计分析
数据以均数±标准差(SD)表示。各组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析。所有检验的显著性水平分别设为* p<0.05和* * p<0.01。采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析。
2.结果
2.1从落叶松木屑中提取纤维素
与落叶松木屑相比,纤维素的扫描电镜(图1A)显示出清晰的纤维结构。纤维素的这种纤维结构可能是由于木质化和木聚糖的去除。而原始落叶松木屑由于杂质的存在,表面比较粗糙。落叶松木屑和纤维素的XRD结果(图1B)表明,碱处理和漂白后纤维素的晶体结构发生了明显的变化。落叶松木屑和纤维素的结晶度指数分别为33%和61%。纤维素的结晶度指数显著提高,达到了报道的商品纤维素的61%的结晶度指数。纤维素和商品纤维素的FTIR光谱相似,如图1C所示。纤维素的C-H键在2900 cm-1处有一个拉伸振动峰,而O-H基团的拉伸振动峰在3333 cm-1处有一个更宽的峰。此外,1050cm-1处有一个峰,代表纤维素中C-O键的弯曲和拉伸振动,890cm-1处的水化峰表明纤维素中含有β-糖苷键。
2.2 DLC和CA的合成
DLC与LC的XRD结果如图2A所示。可以看出,氧化后DLC与LC相比,2θ=12°-19°、22.7°和34.5°处的结晶峰明显减弱。DLC与LC的FTIR结果如图2B所示,可以看到氧化后DLC在1723cm-1处出现了一个新的醛特征峰(C=O)。以上结果均表明纤维素氧化成功,通过pH-VNaOH曲线测得纤维素的氧化程度为81%(图2C)。CA、CS与L-Arg的XRD谱图如图2D所示。在2θ=20°处观察到的强宽峰证实了CS的半晶结构。与CS相比,CA的峰值强度更低、更宽,这表明L-精氨酸使壳聚糖体系中的晶体区域发生变形,导致其结晶度降低。此外,在CA光谱中形成新的峰是L-Arg接枝到CS上的另一个标志。图2E为CA、CS与L-Arg的FTIR光谱。由于酰胺键的形成,C=O峰从1658cm-1移至1638cm-1, -NH2峰从1599cm-1移至1547cm-1,表明L-精氨酸与壳聚糖成功偶联。
2.3水凝胶的SEM分析
连续多孔结构可以促进营养物质和代谢废物的交换,为细胞增殖提供充足的空间。因此,通过SEM观察冻干水凝胶的微观结构(图3)。DCA1、DCA2和DCA3均具有均匀的多孔三维网状结构,其中DCA2的结构更为致密,呈现出蜂巢状,这个浓度下的水凝胶,较DCA1和DCA3的水凝胶孔径小,其尺寸在30-50nn之间,凝胶强度更强(33.00±5.03g),溶胀率更低(25.3±2.14g),相同的情况下,DCA2的比表面积更大,利于骨细胞附着,促进骨骼修复,这可能是因为DCA2的聚合物链上-CHO基团与-NH2基团的摩尔比更接近于1:1。
2.4水凝胶的XRD和FTIR表征
DCA2、DLC、CA的XRD结果如图4A所示,CA与DLC的结合使DCA在2 θ=13°处的衍射峰强度减弱。图4B为DCA2、DLC、CA的FTIR光谱。可以观察到,DLC与CA结合后,在1723cm-1处醛峰消失,在1643cm-1处出现酰胺峰,说明DLC的醛基与CA的氨基反应成功。DCT、DCA2、TAX的XRD结果如图4C所示。与DCA相比,加载TAX后DCT的晶体结构没有发生变化,说明TAX被深度困在DCT内部,而不是停留在表面。图4D为DCT、DCA2、TAX的FTIR光谱,可以看到TAX的C=C特征峰出现在1465cm-1处,说明TAX已成功加载到DCT中。
2.5水凝胶性能试验
通过测量水凝胶的凝胶化时间,可以在5min内将DCA1、DCA2和DCA3凝胶化(图5A、B)。
良好的力学性能也是骨修复材料考虑的因素之一。通过质构分析确定水凝胶的力学性能(图5C)。DCA1、DCA2和DCA3的凝胶强度分别为21.05±2.22g、33.00±5.03g和31.29±3.01g,其中DCA2的力学性能最好。
水凝胶的溶胀率可以间接反映水凝胶的交联密度和力学性能。所有水凝胶在液体中的吸水性都是其自身质量的20倍,表现出良好的溶胀能力。DCA2的溶胀率低于DCA1和DCA3,这可能是由于其交联密度相对较高(图5D)。
水凝胶的体外降解结果如图5E所示。所有水凝胶均表现出较慢的降解速率,且DCA2比DCA1和DCA3更稳定,有利于药物的长期释放。因此,后续实验选择DCA2。
2.6流变分析
通过流变试验探索水凝胶的粘弹性,结果如图6B所示。所有水凝胶的G′值均大于G′值,说明水凝胶网络结构良好。DCA2的G′值最高,说明其力学性能优越,这与质构结果一致。可注射的水凝胶可以在原位形成,并且可以很容易地通过针或导管注射到目标部位,以减少疤痕和患者疼痛。因此,可注射水凝胶具有很大的临床应用潜力。将DCA2倒入注射器中,可通过内径0.45mm的针头而不堵塞,顺利书写字母“JLAU”(图6A)。随着剪切速率的增加,水凝胶的粘度显著降低,说明水凝胶具有剪切减薄的特性(图6C)。结果表明,DCA2具有良好的注射性。
2.7缓释、抗氧化和抗菌试验
7天期间的TAX释放曲线如图7A所示,其中前12小时释放速度较快,12小时后缓慢释放,第7天达到65%的释放率。过多的活性氧不利于骨再生,因为它们促进破骨细胞分化,抑制成骨细胞分化。本发明以DPPH和ABTS自由基清除率评价水凝胶的抗氧化活性。如图7B、C所示,DCA2表现出少量的自由基清除效率,这可能是由于CS本身具有一定的自由基清除能力,对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为29.74±1.42%和41.58±1.05%。值得一提的是,DCT对DPPH和ABTS自由基的清除率分别为73.74±0.67%和92.09±0.10%,与Vc对DPPH和ABTS自由基的清除率(83.40±0.16%和93.80±0.04%)接近。这种现象可以归因于TAX的引入。图7D显示了水凝胶对常见革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的影响。可以看出,37℃ DCA2处理1小时后,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的数量明显减少,DCA2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀伤率为93.79±0.86%和89.02±1.09%,这可归因于氧化后的纤维素和接枝壳聚糖的精氨酸增强了抗菌活性。此外,TAX的引入进一步提高了水凝胶的抗菌活性,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀伤率达到了99.09±0.45%和98.55±0.50%。结果表明,DCT具有较强的抗氧化和抗菌能力,对骨再生有积极的影响。
2.8粘附、细胞毒性、溶血试验
水凝胶的粘附能力使其能够与骨缺损周围的天然骨组织连接,有利于细胞转移和分子信号传递,促进骨再生。通过猪皮肤组织搭接剪切试验测试水凝胶的粘附强度(图8A)。可以发现,DCA2和DCT的破断力分别为0.87±0.07N和2.14±0.51N,表明该水凝胶具有良好的粘附能力。随着TAX的引入,水凝胶的粘附能力得到了增强,这可能是由于TAX丰富的酚羟基与组织表面的胺和硫醇基团之间形成了更多的氢键。综上所述,DCT是一种很有前途的骨缺损粘附生物材料。
理想的骨修复材料还需要具有良好的生物相容性。MTT法检测水凝胶对培养1、3、5d的MC3T3-E1细胞的细胞毒性。结果如图8B所示。在所有组中,水凝胶的细胞活力都保持在100%以上,说明水凝胶没有明显的细胞毒性,并在一定程度上促进了MC3T3-E1细胞的增殖。这可能是由于CA和DLC良好的生物相容性以及TAX促进成骨细胞增殖和分化的能力。
此外,血液相容性是评价植入材料相容性的重要指标。PBS和TritonX-100分别作为空白组和阳性组,测定水凝胶的溶血活性。如图8C所示,水凝胶与血液共培养后,水凝胶组溶液透明。TritonX-100组的溶液是红色的,这可以解释为什么血细胞几乎被它破坏了。测定各组上清溶血率,水凝胶溶血率均低于5%的允许限度。这些结果表明,所有的水凝胶具有较高的生物相容性,可以用于体内修复应用。
2.9止血试验
外伤和手术引起的大量失血可能导致死亡。采用体外全血凝血试验评价其凝血指数(BCI),验证水凝胶的凝血能力。低BCI值表明该材料具有很强的止血作用。选择纱布作为对照组,比较水凝胶的止血效果。结果显示,水凝胶组的BCI值低于纱布组(图9A),说明水凝胶的止血性能优于纱布组。同时记录了水凝胶对血液的吸附行为(图9B)。所有样品均可在4分钟内吸附0.5mL血液,血液吸附良好。水凝胶可能的止血作用如下。首先,水凝胶具有良好的吸水性,可以吸水浓缩凝血因子,加速凝血过程。此外,水凝胶均匀多孔的网状结构可以捕获更多的红细胞。
采用小鼠肝出血和断尾模型(图9C、D)评价黏附水凝胶在体内的止血效果。在小鼠肝出血模型(图9C)中,对照组的滤纸上有大面积的血渍,总失血量约为0.233±0.040g。水凝胶敷于出血部位后,血渍面积明显减少,出血量分别为0.057±0.005g(DCA)和0.070±0.010g(DCT),说明水凝胶止血效果良好。
测试小鼠断尾模型的止血性能(图9D)。与空白组(0.123±0.025g)相比,水凝胶的失血量(0.009±0.003g和0.015±0.004g)明显减少。这些结果清楚地表明,水凝胶在体内具有良好的止血潜力。水凝胶在体内的止血作用主要归因于壳聚糖和水凝胶良好的组织粘附能力,其可以紧密粘附在创面部位,提供稳定的凝胶网络作为物理屏障,加速血液凝固,而且氧化后的纤维素和接枝壳聚糖的精氨酸加强了壳聚糖的止血活性。
通过上述试验可以发现,DCA2的止血效果明显优于DCT,考虑是因为负载药物之后,影响了水凝胶的空间结构,导致水凝胶的蜂巢结构改变,降低了止血能力。
2.10体内骨修复
通过建立直径为5mm的颅骨缺损大鼠模型来评估水凝胶促进骨修复的能力。图10A显示了新骨形成的形态。对照组未进行治疗,新生骨形成较少,而DCA2、DCT水凝胶组在一定程度上促进新生骨形成。这是因为水凝胶很好地连接了缺损部位与周围天然骨组织之间的营养物质和废物交换,有助于细胞增殖和分化,并且精氨酸的引入能够增强水凝胶的血管生成活性,有利于骨再生,特别是DCT组的新骨体积明显高于DCA2组,这是由于TAX和水凝胶在促进新骨形成方面的协同作用。
BV/TV, TB.N和TB.Th通过micro-CT辅助软件进一步分析。如图10B-D所示,水凝胶组BV/TV, TB.N和TB.Th均显著高于对照组,其中DCT水凝胶组BV/TV, TB.N 和TB.Th最高。这说明TAX的引入促进了水凝胶的成骨作用。如图10E所示,TB.Sp的定量结果则呈现相反的趋势。与对照组相比(7.057±0.468mm),DCA2组和DCT组的TB.Sp较低(4.344±1.522mm和2.837±0.690mm),DCT组的TB.Sp最低。再次证明了TAX与水凝胶的协同作用可以有效促进骨再生。
手术8周后,通过组织学染色进一步评估新骨形成情况(图11、12)。8周时,对照组仅在宿主骨周围形成少量新骨,其余缺损区域被疏松的纤维组织填充。DCA2组在成骨细胞包围的纤维组织中形成了几个新的骨组织岛,而DCT组缺损区几乎被新生骨组织和连接骨端的矿化胶原纤维桥接,说明精氨酸的接枝和TAX的引入能有效促进骨再生。同样,免疫组织化学染色(图13)显示,与对照组相比,DCA2在一定程度上促进了OCN、OPN等成骨相关因子的表达,而DCT水凝胶效果更显著。综上所述,这些结果表明DCA2在促进骨修复方面具有一定作用,DCT可以有效促进体内骨的再生和重建。
2.11 Western blot分析
本发明通过Western blot检测DCA2、DCT对PI3K/AKT信号通路的影响,评价DCT的成骨活性。PI3K/Akt信号通路广泛存在于组织中,介导对各种刺激的反应。AKT是PI3K信号通路下游的一种特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,激活AKT核易位可促进关键增殖/分化相关因子的表达和VEGF分泌。VEGF是骨发育过程中血管生成的关键调控因子。VEGF的激活会导致多种促进细胞生长、成骨和血管生成的细胞通路上调。在本发明中,DCA2、DCT治疗显著提高了p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和VEGF的表达水平(图14)。因此,DCA2、DCT可通过激活PI3K/AKT信号通路促进血管生成,加速骨缺损修复。
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)是一种特殊的成骨因子,可以调节骨形态的发生。骨钙素(Osteocalcin, OCN)是成骨细胞分化和成熟的标志。OCN在吸引和结合钙离子,促进钙沉积和骨钙化方面起着重要作用。BMP是一种多功能生长分化因子,属于转化生长因子-β (TGF-β)超家族。BMP2是BMP蛋白中成骨能力最强的蛋白之一,已被证明是骨形成的关键调控因子。在体内和体外均能诱导骨髓间充质细胞分化为骨和软骨组织,促进骨生长和愈合。Osx属于SP基因家族,是负责成骨细胞分化和骨形成的核心转录因子。它在骨组织形成和重建的初始调控中起着重要作用。本发明中,水凝胶处理增强了组织中ALP、BMP2、OCN、Osx等成骨标志物的表达,且DCT的作用比DCA2更显著(图15)。因此,DCA2、DCT对大鼠颅骨修复和新骨形成具有积极作用,尤其DCT,可以安全有效地促进骨的再生重建,为骨组织工程中新的治疗方法提供了良好的骨替代品。
以上所述为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种落叶松纤维素水凝胶,其特征在于,所述落叶松纤维素水凝胶以L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与氧化纤维素水溶液为基质,通过化学反应制备得到;所述氧化纤维素是以从落叶松木屑中提取的纤维素为原料,经氧化反应得到的产物;所述落叶松纤维素水凝胶具有止血、抗菌、促进骨骼修复的活性;
所述L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液的浓度为2%,所述L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液的浓度为2%,氧化纤维素水溶液的浓度为2%,2%的L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与2%的氧化纤维素水溶液以2:1的体积混合;
从落叶松木屑中提取纤维素的具体制备方法为:将落叶松木屑在KOH溶液中搅拌过夜,木屑与碱性溶液的比例保持在1:10 w/v;碱性处理产物用去离子水洗涤至pH=7,再用7%亚氯酸钠和浓盐酸在80℃下漂白,碱性处理产物与7%亚氯酸钠溶液的比例保持在1:20 w/v,将漂白后的产物用去离子水多次洗涤,50℃下干燥,得到纤维素。
2.根据权利要求1所述的一种落叶松纤维素水凝胶,其特征在于,所述落叶松纤维素水凝胶内负载促进骨骼修复的活性成分,所述促进骨骼修复的活性成分包括二氢槲皮素。
3.一种落叶松纤维素水凝胶的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤1、从落叶松木屑中提取纤维素;
步骤2、将步骤1的纤维素与高碘酸钠混合于水中,进行氧化反应,得氧化纤维素;
步骤3、将L-精氨酸和壳聚糖混合搅拌,得L-精氨酸修饰的壳聚糖;
步骤4、将L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与氧化纤维素水溶液混合,制备落叶松纤维素水凝胶;所述落叶松纤维素水凝胶具有止血、抗菌、促进骨骼修复的活性;
所述步骤1从落叶松木屑中提取纤维素的具体制备方法为:将落叶松木屑在KOH溶液中搅拌过夜,木屑与碱性溶液的比例保持在1:10 w/v;碱性处理产物用去离子水洗涤至pH=7,再用7%亚氯酸钠和浓盐酸在80℃下漂白,碱性处理产物与7%亚氯酸钠溶液的比例保持在1:20 w/v,将漂白后的产物用去离子水多次洗涤,50℃下干燥,得到纤维素;
所述步骤4将2%的L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液与2%的氧化纤维素水溶液以2:1的体积混合,制备落叶松纤维素水凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种落叶松纤维素水凝胶的制备方法,其特征在于,所述步骤2氧化纤维素的具体制备方法为:将从落叶松木屑中提取的纤维素与高碘酸钠混合于水中,在黑暗中搅拌,之后用去离子水洗涤,得到氧化纤维素。
5.根据权利要求3所述的一种落叶松纤维素水凝胶的制备方法,其特征在于,所述落叶松纤维素水凝胶内负载促进骨骼修复的活性成分,所述促进骨骼修复的活性成分包括二氢槲皮素;负载二氢槲皮素的落叶松纤维素水凝胶的制备方法为:将二氢槲皮素预先溶解在2%的氧化纤维素水溶液中,之后与2%的L-精氨酸修饰的壳聚糖水溶液以1:2的体积混合,所述二氢槲皮素的终浓度为4mg/mL。
6.权利要求1或2所述的落叶松纤维素水凝胶在制备促进骨骼修复的生物支架中的应用。
7.权利要求1或2所述的落叶松纤维素水凝胶在制备止血药物中的应用。
8.权利要求1或2所述的落叶松纤维素水凝胶在制备PI3K/AKT信号通路激活剂中的应用,所述落叶松纤维素水凝胶通过激活PI3K/AKT信号通路促进血管生成,加速骨缺损修复。
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