CN117138058A - 用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及伤口敷料，具体涉及一种用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用，所述用于修复骨缺损的脂质体为CTL，所述CTL是经CSSH修饰的TL，所述CSSH为壳聚糖经改性制备的巯基化壳聚糖；所述TL为二氢槲皮素脂质体。将用于修复骨缺损的脂质体负载在水凝胶中，其可通过激活Wnt/β‑catenin信号通路和促进成骨相关蛋白的表达促进骨再生，修复骨缺损，且骨修复作用明显，修复效果好，修复速度快。

Description

用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及伤口敷料，具体涉及一种用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用。
背景技术
骨组织作为人体的坚硬组织，在日常生活中可以支持人的各种活动并保护各种器官。此外，骨组织具有维持体内钙磷平衡的作用。然而，骨组织容易受到外界因素的损伤，小面积的骨折可以通过机体自身功能修复，大面积的骨缺损通常难以依靠自身修复，必须通过治疗促进骨缺损的修复。在目前的骨缺损临床治疗中，自体骨和异体骨移植是最常见的骨修复方法。然而，这种骨移植的方法具有一些局限性，例如供应来源有限、自身发生的排斥反应和免疫应答有限。这些缺点限制了骨缺损修复过程的发展，对人们的生活带来了极大的困扰。组织生物工程支架在组织修复中的应用在近年来得到了广泛的应用，例如纳米纤维膜、金属支架、微球和水凝胶。
水凝胶作为一种具有三维网络结构的生物组织工程支架能够模拟细胞外基质（ECM）为细胞的增殖和黏附提供合适的微环境；此外，水凝胶组织生物工程支架具有良好的生物相容性、吸收大量受损组织部位的渗出液、透气性良好、为药物缓释提供平台和亲水性良好的优点，因此水凝胶已经成为医学组织工程研究的热点，例如促进伤口修复、止血支架和修复骨缺损。可注射水凝胶由于其可以将水凝胶注射到不规则的骨缺损模型中得到广泛的研究。可注射水凝胶的一般为聚合物和多糖类化合物作为基质通过化学反应制备得到的，例如壳聚糖及其衍生物、海藻酸钠、明胶、透明质酸和葡聚糖。
羧甲基壳聚糖（CMCS）是一种壳聚糖（CS）的衍生物，CMCS相比于CS可以溶于水中并且具备于CS相似的生物活性，例如抗氧化和抑菌能力。葡聚糖（Dex）具有良好的生物相容性和生物降解性，其结构上具有丰富的羟基基团，可被氧化生成醛基（-CHO）并与CMCS中的氨基（-NH2)形成席夫碱反应制备可注射水凝胶。可注射水凝胶作为一种组织生物工程支架用于骨修复的应用得到了广泛的研究。然而，仅仅依靠水凝胶自身的性质用于促进骨修复远远不够，在水凝胶中添加活性成分用于促进骨缺损的修复是目前的研究策略之一，但现有现有负载活性成分的水凝胶因活性成分生物利用度低等多种原因导致修复骨缺损的效果并不理想。
发明内容
鉴于上述技术问题和缺陷，本发明提供一种用于修复骨缺损的脂质体，该脂质体为CTL，所述CTL是经CSSH修饰的TL，所述CSSH为壳聚糖经改性制备的巯基化壳聚糖；所述TL为二氢槲皮素脂质体。
本发明还提供一种用于修复骨缺损的脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）CTL的合成
首先取壳聚糖溶于乙酸水溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，然后在室温下避光搅拌；按照比例向其中加入半胱氨酸，随后调节溶液pH在5-6之间，在室温下避光反应；最后使用透析溶液透析，透析溶液分别为pH = 5的HCl水溶液、含有1%NaCl且pH为 5-6的HCl水溶液，每过12个小时更换透析溶液，两种透析溶液交替更换，透析后的产物为CSSH；
（2）TL的制备
首先取大豆卵磷脂、胆固醇和二氢槲皮素溶于甲醇和氯仿的混合溶液中，将装有上述溶液的圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中除去所有的试剂后，将圆底烧瓶置于真空干燥箱中以完全除去有机试剂；随后加入PBS进行水合，水合结束后通过超声细胞破碎仪超声以完全分散得到TL混悬液；其中，所述大豆卵磷脂、胆固醇和二氢槲皮素的质量比为9: 1.5 : 1；
（3）CTL的制备
将步骤（2）的TL混悬液与CSSH水溶液混合后在常温下搅拌，得到CTL混悬液。
进一步，步骤（3）在得到CTL混悬液之后，通过离心处理，去除未包封的二氢槲皮素。
本发明提供的用于修复骨缺损的脂质体负载在水凝胶中，其作为活性成分可通过激活Wnt/β-catenin信号通路和促进成骨相关蛋白的表达促进骨再生，修复骨缺损；因此，其可以在制备促进骨再生、修复骨缺损的药物中应用；也可以作为Wnt/β-catenin信号通路的激活剂在制备用于预防或治疗由Wnt信号途径异常失活所引起的疾病的药物中应用，所述疾病包括骨损伤、骨质疏松；也可以在制备用于促进成骨相关蛋白表达的药物中应用，所述成骨相关蛋白包括OCN、OSX、BSP、BMP2、CD31、ALP、CoL-Ⅰ、OPN、Runx2。
本发明还提供一种水凝胶，所述水凝胶内负载上述用于修复骨缺损的脂质体，该水凝胶具有合适的生物降解性、缓释性、生物相容性和溶胀性能，可通过激活Wnt/β-catenin信号通路和促进成骨相关蛋白的表达促进骨再生，修复骨缺损；因此，其可以在制备促进骨再生、修复骨缺损的药物中应用；也可以作为Wnt/β-catenin信号通路的激活剂在制备用于预防或治疗由Wnt信号途径异常失活所引起的疾病的药物中应用，所述疾病包括骨损伤、骨质疏松；也可以在制备用于促进成骨相关蛋白表达的药物中应用，所述成骨相关蛋白包括OCN、OSX、BSP、BMP2、CD31、ALP、CoL-Ⅰ、OPN、Runx2。
进一步，所述水凝胶是以氧化葡聚糖和羧甲基壳聚糖作为基质，通过化学反应制备得到。
本发明还提供一种负载上述用于修复骨缺损的脂质体的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）氧化葡聚糖的制备
首先称取葡聚糖加入到蒸馏水中溶解，随后将高碘酸钠加入到葡聚糖溶液中，避光反应；然后加入乙二醇终止反应，使用双蒸水透析，透析后的产物为氧化葡聚糖；
（2）水凝胶的制备
将5%的羧甲基壳聚糖加入到CTL溶液中搅拌均匀后，加入5%的氧化葡聚糖水溶液混合得到水凝胶；其中，5%的羧甲基壳聚糖与5%的氧化葡聚糖的体积比为1：1；所述CTL为上述用于修复骨缺损的脂质体。
本发明的优点和有益效果：
（1）本发明将TAX（二氢槲皮素）负载在脂质体内，同时通过巯基化壳聚糖（CSSH）修饰脂质体，既能解决脂质体在复杂的体内环境中结构容易被破坏，导致药物提前泄露的技术问题，同时还能有效提高TAX的生物利用度。
（2）本发明将TAX负载在脂质体内后，抗氧化能力明显增强，考虑是因为纳米粒子保护了TAX被溶液氧化，保护了TAX；而且经CSSH修饰后的脂质体在CSSH与TAX协同作用下，表现出更强的抗氧化能力，更有利于促进骨缺损的修复。
（3）本发明将TAX负载在脂质体内后，抑菌能力明显增强，考虑是因为脂质体可以破坏细菌的细胞膜，脂质体与TAX协同作用从而提高了抑菌能力；而且经CSSH修饰后的脂质体表现出更强的抑菌能力，可能是因为CSSH具有正电荷，可以吸附到细菌表面，破坏其细胞膜的完整性，导致细胞内容物泄漏，并最终导致细菌的死亡，这对于骨缺损的修复具有重要作用。
（4）本发明将修饰后得的CTL加入到CMCS和氧化葡聚糖（ODEX）形成的水凝胶中，该水凝胶能够激活Wnt/β-catenin信号通路，促进成骨相关蛋白（OCN、OSX、BSP、BMP2）表达，骨修复作用明显，修复效果好，修复速度快（8周颅骨缺损处几乎完全修复，考虑是因为CTL的加入提高了水凝胶体外生物活性，从而加速了骨修复的进程），可用于促进颅骨修复。
（5）本发明提供的水凝胶为多孔结构，有利于骨缺损部位进行气体交换；此外，其还具有合适的溶胀性，能够吸收骨缺损部位的伤口渗出液，可以避免骨缺损处的感染和二次损伤，可有效促进骨缺损部位的修复。
（6）本发明提供的水凝胶具有良好的稳定性，可以使水凝胶体系在外部张力的作用下仍然可以保持完整的水凝胶结构，这对于骨缺损的修复具有积极的作用。
（7）本发明提供的水凝胶具有安全的抗溶血作用，降解速率合适，且经CSSH修饰后改善了TL纳米粒子体系的缓释性能，使内部负载的药物活性成分可以实现长达超过28天的持续释放。
附图说明
图1是水凝胶对大鼠颅骨临界骨缺损的修复；其中，（A）CTL的制备流程；（B）氧化葡聚糖和水凝胶的制备流程。
图2是巯基化壳聚糖及CTL的表征；其中，（A）CS和CSHH的红外光谱分析；（B）CS和CSHH的1HNMR分析；（C）TL的粒径大小；（D）TL的Zeta电位大小；（E）CTL的粒径大小；（F）CTL的Zeta电位；（G）TL的TEM图像；（H）CTL的TEM图像。
图3 是ODEX的水凝胶表征；其中，（A）DEX和ODEX的FTIR光谱图；（B）DEX和ODEX的1HNMR图；（C）水凝胶的FTIR光谱图；（D）水凝胶的SEM图（50 μM）。
图4是水凝胶的性能；其中，（A）水凝胶的频率扫描；（B）水凝胶的时间扫描；（C）水凝胶的溶胀率；（D）水凝胶的降解速率；（E）水凝胶的ABTS自由基清除率；（F）水凝胶的DPPH自由基清除率；（*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与对照组相比)。
图5是水凝胶的抑菌和抗溶血性能；其中，（A）水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落计数实验；（B）大肠杆菌的定量；（C）金黄色葡萄球菌的定量；（D）抗溶血作用定量；（E）水凝胶的体外释放结果；（*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与对照组相比)。
图6是水凝胶的细胞实验；其中，（A）MC3T3-E1的ARS和ALP染色；（B）MC3T3-E1的DAPI、EdU和Merge染色；（C）MC3T3-E1的CCK-8在1、3、5天内的吸光度变化；（D）EdU染色定量分析；(*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与对照组相比)。
图7是大鼠颅骨缺损的修复；其中，（A）大鼠颅骨缺损模型的建立；（B）微计算机断层扫描技术图像；（C）BV/TV的定量；（D）Tb.N的定量；（E）Tb.Sp的定量；（F）Tb.Th的定量；(*p＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与模型组相比)。
图8是大鼠颅骨组织病理学染色；其中，（A）大鼠颅骨的H&E染色；（B）大鼠颅骨的Masson染色，图中HB：原生宿主骨；FT：纤维组织；NB：新生骨。
图9是大鼠颅骨的ALP、CD31和COL-1的免疫组化染色；其中，（A）ALP免疫组化染色；（B）CD31免疫组化染色；（C）COL-1免疫组化染色；（D）ALP的表达定量分析；（E）CD31的表达定量分析；（F）COL-1的表达定量分析；(*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与模型组相比)。
图10是大鼠颅骨OCN、OPN和Runx2的免疫组化染色；其中，（A）OCN免疫组化染色；（B）OPN免疫组化染色；（C）Runx2免疫组化染色；（D）OCN的表达定量分析；（E）OPN的表达定量分析；（F）Runx2的表达定量分析；(*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与模型组相比)。
图11是Wnt信号通路相关蛋白的表达；其中，（A）Wnt信号通路相关蛋白的条带；（B）Wnt蛋白的表达定量；（C）FZD蛋白的表达定量；（D）Cyclin-D1蛋白的表达定量；（E）β-catenin蛋白的表达定量；(*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01代表与模型组相比)。
图12是成骨相关蛋白的表达；其中，（A）成骨相关蛋白的条带；（B）OCN蛋白的表达定量；（C）OSX蛋白的表达定量；（D）BSP蛋白的表达定量；（E）BMP2蛋白的表达定量；(*p ＜0.05，**p ＜ 0.01代表与模型组相比)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1、材料与方法
1.1 材料与试剂
壳聚糖（CS）、半胱氨酸（Cys）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）和羧甲基壳聚糖（CMCS由麦克林生化试剂有限公司提供。磷酸盐缓冲溶液（PBS）购自索莱宝生物科技有限公司。大豆卵磷脂和胆固醇来自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。葡聚糖（DEX）从上海源叶生物科技有限公司购买。高碘酸钠（NaIO4）由上海源叶生物科技有限公司提供。Anti-Wnt、anti-Frizzled（FZD）、anti-β-catenin、anti-CyclinD1、anti-Osteocalcin（OCN）、anti-Osterix（OST）、anti-Bone Sialoprotein（BSP）、anti-Bone Morphogenetic Protein 2（BMP2）和二抗都购买于武汉三鹰生物技术有限公司。
1.2 巯基化壳聚糖的合成
如图1A所示，本发明CSSH的合成根据以往的报道进行了修改，首先取1.0g的CS溶于0.5%乙酸水溶液，向其中加入终浓度为50 mmol/L的EDC和NHS，然后在室温下避光搅拌15min。按照一定比例向其中加入Cys (nCys : nCS=1:1)，随后使用1 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH在5到6之间，在室温下避光反应5h。最后使用透析溶液透析3天（分子量为3500 Da的透析袋），透析溶液分别为pH = 5的HCl水溶液、含有1%NaCl的HCl水溶液（pH = 5-6），每过12个小时更换透析溶液，两种透析溶液交替更换，透析后的产物（CSSH）冻干后放置在4℃下保存。
1.3 巯基化壳聚糖的表征
1.3.1 巯基化壳聚糖的傅里叶红外光谱
将冻干后的CSSH和CS置于傅里叶变换红外光谱中进行检测它们的官能团，使用波长范围为4000-400 cm-1，分辨率为2 cm-1。
1.3.2 巯基化壳聚糖的1HNMR
使用400 MHz的核磁共振波谱仪对CS和CSSH进行结构鉴定，称取适量的CS溶解于D2O与CD3COOD 的混合液（体积比为 98：2）中，浓度为10 mg/mL。称取适量CSSH溶解于D2O中，浓度为10 mg/mL，将两者分别装入核磁管后使用波谱仪进行检测。巯基取代度由核磁共振测定，通过计算-SH和H2的峰面积比来得出。
1.4 巯基化壳聚糖修饰二氢槲皮素脂质体的制备
继续如图1A所示，本发明TL的制备根据以往的研究方法制备并进行修改。首先取大豆卵磷脂90 mg、胆固醇15 mg和TAX 10 mg溶于25 mL甲醇和氯仿的混合溶液（甲醇：氯仿=4：1）中。将装有上述溶液的圆底烧瓶置于40℃的旋转蒸发仪中除去所有的试剂后，将圆底烧瓶置于40℃的真空干燥箱中以完全除去有机试剂。随后加入10 mL的PBS（pH 7.2-7.4）进行水合，水合结束后通过超声细胞破碎仪（100 W，5 min）超声以完全分散得到二氢槲皮素脂质体（TL）混悬液。将TL混悬液与1%的CSSH水溶液混合后在常温下以500 rpm搅拌一个小时，得到CTL的混悬液；之后取CTL的混悬液，通过离心法去除未包封的TAX，并用于下述实验。
脂质体的包封率是通过高效液相色谱（HPLC）得到的。简而言之，取脂质体混悬液1mL加入15 mL的甲醇超声破乳5 min后使用甲醇定容到25 mL（Wtotal）。取脂质体混悬液1 mL通过离心法去除未包封的TAX，加入15 mL的甲醇超声破乳5 min后使用甲醇定容到25 mL（W）。脂质体的包封率（EE）是通过公式（1）计算得到的。
EE（%）=W/Wtotal×100% （1）
1.41 脂质体的理化性质
脂质体的Zeta电位、粒径大小和多分散系数是通过Zeta电位及粒度分析仪测定的（Nanobrook 90 plus, zeta Brookhaven, USA）。将稀释后的TL和CTL置于比色皿中放入仪器内测量，温度设置为25℃，分散角度为90°。
1.42 脂质体的微观形态观察
脂质体的微观形态是通过透射电镜（TEM）观察的，首先将稀释后的脂质体溶液滴到微珊铜网上，然后使用0.2%的磷钨酸溶液进行负染。风干后将微珊铜网置于TEM下进行观察。
1.5 氧化葡聚糖的制备
如图1B所示，氧化葡聚糖（ODEX）的制备是通过高碘酸钠制备的。简而言之，首先称取2 g的葡聚糖（DEX）加入到50 mL蒸馏水中溶解，随后4 g的高碘酸钠缓慢加入到DEX溶液中，避光反应5 h。然后加入4 mL的乙二醇终止反应，使用分子量为3500 Da的透析袋在双蒸水中透析三天后冻干，最后得到ODEX。
1.6 氧化葡聚糖的表征
1.6.1 氧化葡聚糖的傅里叶红外光谱
将冻干后的DEX和ODEX置于傅里叶变换红外光谱中进行检测它们的官能团，使用波长范围为4000-400 cm-1，分辨率为2 cm-1。
1.6.2 氧化葡聚糖的1HNMR
使用400 MHz的核磁共振波谱仪对DEX和ODEX进行结构鉴定，称取适量的DEX和ODEX溶解于D2O中，浓度为10 mg/mL，将两者分别装入核磁管后使用波谱仪进行检测。
1.7 水凝胶的制备
继续如图1B所示，将5%的CMCS与5%的ODEX按照体积比1：1进行混合搅拌，在玻璃小瓶中倒置液体不流动既为形成空白水凝胶（BLG），将5%的CMCS分别加入到TAX溶液（10%乙醇溶液）、TL脂质体溶液（去除未包封的TAX）和CTL脂质体溶液（去除未包封的TAX）中搅拌均匀后加入等体积的5%ODEX水溶液混合得到水凝胶，分别命名为TG、TLG和CTLG（三种载药水凝胶中TAX的含量均为1.12mg/mL）。
1.8 水凝胶的性能考察
1.8.1 水凝胶的微观形态观察
将冻干后的水凝胶置于扫描电镜（SEM）下观察水凝胶的微观形态。将水凝胶切成均匀的小块，利用导电胶将水凝胶样品粘贴在SEM载物架上对样品喷金处理40 s，然后将其固定于扫描台，进行SEM观察。
1.8.2 水凝胶的傅里叶红外光谱
将冻干后的水凝胶置于傅里叶变换红外光谱检测它们的官能团特征峰，FTIR的波长范围为4000-400 cm-1，分辨率为2 cm-1。
1.8.3 水凝胶的流变学性能
水凝胶的动态流变测试采用TA流变仪（Kinexus，马尔文仪器公司，英国）进行测试。所有水凝胶样品均制备为直径10 mm、高度2 mm的圆盘。水凝胶的时间扫描振荡测试在1%应变、1 Hz频率和1.0 mm间隙（CD模式）下进行600秒。频率扫描测试在0.1-00 rad/s的剪切速率下进行。
1.9 水凝胶的体外实验
1.9.1 水凝胶的溶胀和降解
水凝胶的溶胀和降解是通过重量变化的方法测定的。简而言之，水凝胶的溶胀是将1 mL水凝胶冻干后加入到装有10 mL PBS（pH = 7.4）的玻璃瓶中，在37℃以100 rpm的转速孵育水凝胶。水凝胶的初始重量记为W0，吸收PBS直至重量平衡的水凝胶记为W（使用滤纸吸干水凝胶表面水分），水凝胶的溶胀率计算如公式（2）所示。
Swelling rate (%)=W0/W×100% （2）
取1 mL水凝胶加入到装有10 mL PBS（pH = 7.4）的玻璃瓶中，在37℃以100 rpm的转速孵育水凝胶。水凝胶的初始重量记为W2，在规定的时间点取出水凝胶并使用滤纸擦干水凝胶表面的水分后称重（W1）。水凝胶的降解率的计算如公式（3）所示。
Degradation rate (%)=（W1- W2）/ W2×100% （3）
1.9.2 抗氧化
水凝胶的体外抗氧化能力通过测定清除ABTS自由基和DPPH自由基实验测定。ABTS工作液通过混合ABTS溶液和过硫酸钾混合并在黑暗的环境下孵育12h制备的，制备完成后的工作液用无水乙醇稀释溶液，直到734 nm处的吸光度为0.70 ± 0.02。将水凝胶浸提液（1 mg/mL）加入到稀释后的ABTS工作液中并在黑暗环境下孵育5min后，在734 nm的紫外波长下检测溶液的吸光度。水凝胶对于ABTS自由基清除率计算方式（4）如下：
ABTS scavenging activity(%)=（A0- A）/ A0×100% （4）
其中， A0 是无样品溶液ABTS的吸光度， A 是有样品溶液ABTS的吸光度；
制备1 mg/mL的DPPH甲醇溶液做为工作液，然后与水凝胶浸提液（1 mg/mL）和DPPH溶液等体积混合，在37℃下反应后在517 nm的紫外波长下测量吸光度值。甲醇作为空白对照，DPPH自由基清除率计算方式（5）如下：
DPPH scavenging activity(%)=（1- Asample/ Ablank）×100% （5）
其中， Asample 是样品的吸光度，Ablank 是无样品的吸光度。
1.9.3 抑菌
水凝胶的抗菌能力通过菌落计数法测定，采用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌作为实验对象。简而言之，将S. aureus和E. coli在摇床中培养18h（37℃和100 rpm），然后使用无菌PBS 分别稀释菌液，得到1.0×105CFU/mL浓度的细菌悬浮液。将灭菌后的水凝胶浸提液置于24孔板中，每个水凝胶浸提液的孔里加20 µL稀释后的细菌悬液，以无样品的孔作为对照，放入培养箱中37℃孵育。2 h后取出孔板，每孔加入1 mL培养液，轻晃摇匀。然后取20 µL菌悬浮液涂于固体琼脂平板上，培养24 h后观察菌落生长情况，对菌落进行技术。最后，用以下公式（6）计算水凝胶的抑菌率。
Antibacterial rate (%)=1-Q/W×100% （6）
其中，W是对照组的细菌数量，Q是样品组的细菌数量。
1.9.4 抗溶血
进行溶血测定以评估水凝胶的血液相容性。在抗凝管中加入50 μL水凝胶，同时加入1 mL生理盐水并在37°C下孵育30 min。使用1 mL不含水凝胶的曲拉通-100X作为阳性对照，1 mL不含水凝胶的生理盐水作为阴性对照。然后分别加入20 μL新鲜血液并在37°C下孵育1小时。然后将离心管以2000 rpm离心5 min。最后拍摄照片后测量上清液在545 nm处的吸光度。水凝胶溶血率使用以下公式（7）计算：
溶血率 (%)=(OD样品-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照) （7）
其中，OD样品是样品的吸光度，OD阴性对照是阴性对照的吸光度，OD阳性对照是阳性对照的吸光度。
1.9.5 水凝胶的体外释放
取新鲜配制的2 mLTG、TLG和CTLG，然后置于装有20 mLPBS（pH = 7.2）的离心管中。将离心管置于恒温振荡器中，设置转速为100 rpm，温度为37℃。分别在第0、1、2、4、6、8、12、16、20、24、28天取出2 mL的浸提液，并添加同样温度的2 mLPBS。TAX的定量通过HPLC进行检测。
1.10 水凝胶的体外细胞实验
1.10.1 CCK-8
通过CCK-8测定水凝胶对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）检测的增殖能力。将细胞用胰酶消化并离心收集，得到细胞浓度为2.0×104cells/mL的细胞悬液，取500µL细胞悬液接种于48孔板中进行培养，待细胞贴壁后，按照实验分组更换水凝胶浸提液进行培养，隔天换液。将细胞培养 1、3和5天后，吸出孔板中的培养基，用PBS洗涤数次。将新鲜培养基与CCK-8溶液按照体积比为10:1进行CCK-8工作液的配制，取200 µLCCK-8工作液加入样品孔中，将孔板用锡箔纸包住置于培养箱中孵育1小时。孵育完成后利用酶标仪测定各组的吸光度（波长450 nm）。
1.10.2 EdU染色
水凝胶对MC3T3-E1的增殖能力进一步通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（Edu，Solarbio）染色来评估。简单地说，将细胞按2.0 × 104个/孔的密度接种到48孔板中，在不同的处理条件下培养24 h（水凝胶浸提液处理和未加水凝胶浸提液处理）。然后，将150 μL完全培养基和0.15 μLEdU工作液与培养结束后，用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）获得培养细胞，用PBS冲洗3次，然后用4%多聚甲醛固定10 min。用2 mg/mL甘氨酸中和固定的细胞，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。用Triton X-100（0.4%）溶液使细胞膜渗透10 min，然后用PBS冲洗3次。将标记的细胞重悬于Apollo staining solution中，孵育10min，然后用 PBS冲洗3次。最后在显微镜下随机挑选三个不同位置进行拍照，并通过Image J软件对其进行定量分析。
1.10.3 碱性磷酸酶染色
碱性磷酸酶（ALP）活性可用于评估MC3T3-E1的早期成骨分化。简而言之，将细胞以2.0×104cells/mL的浓度接种到24孔细胞培养板中，并用1.5 mL基础培养基培养至80%密度。然后在每个孔中加入1.5 mL骨诱导培养基。培养期间每3天更换一次培养基。按照制造商的说明使用碱性磷酸酶染色（偶氮偶联法）试剂盒（Solarbio）对每个孔进行染色并拍照。
1.10.4 茜素红染色
茜素红染色(ARS)试剂盒检测钙沉积和细胞外基质矿化。简单地说，MC3T3-E1细胞在含有4种水凝胶的成骨诱导培养基中培养。第14天，用4%多聚甲醛固定细胞，然后在室温下用茜素红染色液染色10 min。最后在显微镜下观察每个孔的ARS并拍照。
1.11 体内实验
1.11.1 动物饲养与手术方案
50只6-8周龄（180-220g）雄性SD大鼠（长春市亿斯实验动物技术有限责任公司），随机分为5组（n = 10），分别为模型组、BLG治疗组、TG治疗组、TLG治疗组和CTLG治疗组。所有动物实验流程均通过吉林农业大学实验伦理委员会的指导方针进行。实验伦理批准号为：2022–12–10–004。
大鼠适应性饲养一周后（自由饮水饮食，整个饲养过程均在SPF环境中进行），腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠便于后续的手术操作。将大鼠俯卧在手术操作台上，对大鼠头部进行脱毛处理，然后使用棉签蘸取1%的碘伏对大鼠皮肤进行消毒，75%的酒精棉签脱碘。沿颅骨的正中线切开大鼠皮肤（2 cm），逐层分离皮肤、软组织和骨膜，暴露出颅骨。使用带有环形钻头的打磨机在不超过1200 rpm的速度在颅骨进行钻孔，使用生理盐水在手术中冲洗环形钻头避免钻头发热对大鼠组织造成损伤。在大鼠颅骨中线两侧造成5 mm的临界骨缺损。然后除了模型组以外，在骨缺损出注射50 μL经过灭菌处理的水凝胶，使用手术缝合针线逐层缝合大鼠头部组织。最后用碘伏棉球擦拭伤口消毒，并肌肉注射抗生素预防感染（连续五天肌肉注射青霉素钠40万IU/天）。
1.11.2 微计算机断层扫描技术
在治疗8周后，将大鼠行二氧化碳安乐死，而后取出颅骨样品，将其放入4%多聚甲醛中固定48 h。使用Micro-CT在70 kV和200 μA条件下获取影像图像。并使用Scanco软件三维重建图像，计算骨体积分数（BV/TV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量(Tb.N)以定量评估原始缺损区域的骨再生情况。
1.11.3 组织病理学染色
取出大鼠颅骨样本后，首先将其固定在4%多聚甲醛48 h。随后使用含有15%的EDTA脱钙液中进行脱钙30天，每三天更换脱钙液。脱钙完成后将大鼠颅骨组织包埋到石蜡中切成5 μm的切片并根据制造商的说明进行苏木精&伊红（H&E）染色和Masson染色，最后在显微镜下观察各组大鼠颅骨的新生骨组织的变化。
1.11.4 免疫组化染色
颅骨组织中的相关成骨蛋白CD31、ALP、CoL-Ⅰ、OCN、OPN和Runx2的表达水平通过免疫组化染色验证。将脱钙后的颅骨组织切片与5%牛白蛋白（BSA）孵育30 min。然后，将切片与一抗在4℃下孵育过夜。将样品洗涤三次，随后与相应的二抗孵育。洗涤三次后，在显微镜下进行拍照，并使用Image J计算阳性区域的面积。
1.11.5 Western bolt分析
大鼠颅骨的蛋白通过冷冻组织研磨机（中国上海净信实业发展有限公司）得到的。将得到的蛋白样品通过添加上样缓冲液在100℃煮沸10 min。随后将得到的样品放置室温后通过样品通过合适浓度的SDS-PAGE分离胶转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜中，并在10%脱脂牛奶中室温下封闭2 h，将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后在室温下与二级抗体进一步孵育1 h。用ECL发光溶液检测蛋白带信号（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学有限公司），并使用ImageJ软件定量条带的强度。
1.11.6 数据分析
所有实验至少重复三次，并以均数±标准差(SD)显示。数据检验为正态分布，通过单因素方差分析(ANOVA)分析和事后检验确定显著差异。p<0.05为差异有统计学意义(*p<0.05或**p<0.01)。所有实验均至少进行三次，并以均数±标准差(SD)表示。
2.结果
2.1 CSSH的表征
对于多糖类化合物的改性是否成功，通常采用FTIR和1HNMR检测其中的特征峰变化，从而证明多糖类化合物的成功修饰。CSSH的FTIR和1HNMR结果如图2（A-B）所示。在FTIR图像中可以看到相比于CS，CSSH在2500-2600 cm-1处出现了一个信号较弱的新峰，这是-SH的伸缩振动峰。-SH特征峰的出现初步证明了CSSH的成功合成。3400 cm-1附近的宽大峰为CS分子中O-H及N-H的伸缩振动峰， 2870 cm-1处的峰代表C-H的伸缩振动峰，在1650 cm-1和1315 cm-1处的峰值代表了CS分子中的酰胺带（C=O）吸收峰。1HNMR的结果同样证明了CSSH的成功合成。在化学位移3.5-4.0 ppm之间是CS中糖环上的H3-H6的特征峰，而H2的特征峰的化学位移在3.2 ppm附近。在2.0 ppm附近的特征峰为CS中乙酰氨基的特征峰。相比于CS的图谱中的特征峰，CSSH的图谱中H3-H6、H2和乙酰氨基的特征峰得到了保留，并且在2.82ppm处出现了新的特征峰，这个特征峰是-SH的特征峰。通过FTIR和1HNMR的结果证实了CSSH的成功合成。此外，通过计算-SH和H2的峰面积之比得到-SH的取代度为10.15%。
2.2 CTL的表征
纳米粒子的粒径和Zeta电位对于纳米粒子的形态具有重要的作用。TL和CTL的粒径大小和Zeta电位结果如图2（C-F）所示。TL的粒径为97.66 ± 1.35 nm，Zeta电位为-49.33 ± 2.88 mV。CTL的粒径为248.90 ± 14.03 nm，Zeta电位为+36.68 ± 5.43 mV。相比于TL的粒径，CTL的粒径提高了151.24 nm，这要归因于CSSH的修饰扩大了纳米粒子的粒径。Zeta电位是代表纳米粒子稳定性的重要参数。较高的电位（绝对值大于30mV）可以增强纳米粒子之间的相互排斥力以防止聚集，从而提高其整个载药系统的稳定性。由于CS中的正电荷可以通过电荷作用与TL表面的负电荷结合从而成功修饰，CSSH与CS具有相同的性质，通过结果Zeta电位的结果发现相比于TL，CTL成功逆转了TL的负电位，这也可以证明CSSH成功修饰在了TL的表面。通过TEM的结果显示（图2G-H），TL和CTL的微观形态为球形纳米粒子，分散性良好。而且CTL的表面具有一层浅色的外壳，这可能是CSSH形成一层保护壳。通过对TL和CTL的表征结果表明了CSSH成功修饰了TL。
2.3 ODEX的表征
ODEX的FTIR和1HNMR的结果如图3（A-B）所示。相比于DEX，可以发现ODEX的FTIR光谱图中在1726 cm-1处出现了新的较弱的特征峰，这归因于ODEX中C=O的伸缩振动引起的特征峰。这证明DEX被成功氧化，在其结构上引入了醛基，1HNMR的结果同样证实这一点。相比于DEX，ODEX的化学位移在9-10 ppm处出现了一个醛基的质子峰，FTIR和1HNMR的结果均可证明DEX被NaIO4成功氧化。
2.4 水凝胶的表征
为了验证水凝胶是否成功将药物负载，通过FTIR对其结构进行分析。水凝胶的FTIR谱图如图3C所示。通过对比BLG、TG、TLG和CTLG的特征峰发现四种水凝胶具有类似的特征峰，此外并没有发现TAX、TL和CTL的特征峰，FTIR的结果证明水凝胶成功负载到了水凝胶内部。
为了观察水凝胶的微观形态以及多孔结构，本发明通过SEM对水凝胶的微观形态进行了观察。四种水凝胶的SEM图形在图3D中显示。可以通过SEM看到四种水凝胶具有均匀的多孔结构，此外BLG、TG、TLG和CTLG的孔径变化的原因可能是由于水凝胶内部网络交联程度的变化。以往的报道称水凝胶的交联程度与水凝胶表面的光滑程度有关，水凝胶的交联程度越高，水凝胶的表面越粗糙。另外，随着水凝胶交联程度的提高，水凝胶的孔径会缩小，多孔网络结构排列越紧密。水凝胶的多孔结构有利于气体的交换，可以有效促进受损组织的修复。此外，水凝胶的多孔结构能够吸收受损组织处的伤口渗出液和细胞的黏附，这对于受损组织的修复是有利的。
2.5 水凝胶的流变学特性
G'和G''分别代表水凝胶中的储能模量与损耗模量，当G'＞G''时，证明水凝胶从液体变为固态，证明了水凝胶的形成。BLG、TG、TLG和CTLG的流变学特性检测结果如图4A-B所示。通过10 min的时间扫描，四种水凝胶均随着时间的增加，G'也在升高。而且CTLG的G'增幅最为明显，这也就说明了CTLG的交联程度较强，在10 min时，CTLG的G'接近1×104Pa。此外，通过频率扫描振荡实验发现，在0.1-100 rad/s范围内，四种水凝胶的G'均大于G''，这些证据表明制备的四种水凝胶具有良好的稳定性。这可能是由于ODEX中的醛基与CMCS中的氨基形成的席夫碱反应制备的水凝胶具有良好的性能。由于CTLG优异的性能，可以使水凝胶体系在外部张力的作用下仍然可以保持完整的水凝胶结构，这对于骨缺损的修复具有积极的作用。
2.6 水凝胶的溶胀和降解
水凝胶的溶胀对于吸收受损组织的渗出液和止血具有重要的调节作用，同时，这也可以避免受损组织由于渗出液造成的二次损伤。骨缺损发生后，骨缺损处会产生大量的伤口渗出物，如果不及时处理会造成骨缺损处的感染和二次损伤。BLG、TG、TLG和CTLG的溶胀结果如图4C所示，可以看到四种水凝胶中BLG的溶胀率最高，达到了1418.20 ± 52.85%。其次，TG、TLG和CTLG的溶胀率分别为1226.09 ± 14.71%、1131.28 ± 83.15%和1114.32± 52.47%。溶胀的结果表明水凝胶的溶胀率从大到小为BLG、TG、TLG和CTLG，溶胀率的变化可能是由于水凝胶的交联程度的变化引起的，交联程度越高，水凝胶的孔径越小，导致水凝胶的吸收率越低。由CMCS和ODEX制备的可注射水凝胶具有可生物降解的性能。对于骨缺损的修复，水凝胶支架过快的降解会使支架作为细胞黏附和组织新生的支撑作用消失，然而过慢的降解会影响新生骨组织的生长。BG、TG、TLG和CTLG的降解速率结果如图4D所示。BG在降解28天后，已经接近于消失，仅剩余1.51 ± 0.35%。TG在降解28天后，水凝胶的重量剩余10.22 ± 3.76%。TLG在28天的重量剩余18.78 ± 4.38%，CTLG在28天后的重量剩余23.07± 3.20%。对于降解速率的差异是由于水凝胶内部交联网络的交联程度不同引起的，水凝胶内部交联程度越高，其分子间作用力会更强，这也可以降低外界环境对于水凝胶结构破坏的影响。水凝胶的溶胀和降解作为组织修复工程支架具有重要的作用，本发明的实验证明由CMCS和ODEX为基质的水凝胶支架具有合适的溶胀和降解性能用于骨缺损的修复。
2.7 水凝胶的抗氧化性能
骨缺损发生后，大鼠体内的微环境的变化会导致氧化应激水平的升高，阻碍正常骨再生的过程。本发明通过DPPH自由基清除和ABTS自由基清除实验探究水凝胶的抗氧化能力。实验结果如图4E-F所示。BLG的ABTS自由基清除率为64.69 ± 4.68%，相比于BLG，TG、TLG和CLTG的ABTS自由基清除率均显著高于BLG（p ＜ 0.01）。TG的ABTS自由基清除率为83.16 ± 1.41%，TLG的ABTS自由基清除率为85.93 ± 0.34%，而CTLG的ABTS自由基清除率为93.85 ± 0.11%%。相对于DPPH自由基的清除，TG、TLG和CLTG的DPPH自由基清除率均显著高于BLG（p ＜ 0.01），BLG、TG、TLG和CTLG的DPPH自由基清除率分别为59.68 ± 1.73%、77.49 ± 1.05%、88.93 ± 1.29%和94.32 ± 0.89%。相比于BLG，其他三种水凝胶抗氧化能力的提高归因于在水凝胶支架中加入了TAX，TL的抗氧化能力优于TAX的原因可能是因为纳米粒子保护了TAX被溶液氧化，保护了TAX。除此之外，CTL的抗氧化能力的提高是由于在TL的外层引入了具有抗氧化性能的CSSH，提高了CTL的抗氧化能力。
2.8 水凝胶的抑菌能力分析
对于组织修复工程支架的抑菌性能对于骨缺损的修复具有重要作用。根据报道，感染性骨缺损是阻碍骨修复过程的重要难题之一，抗生素对于细菌具有优良的抑制作用，但是抗生素的滥用具有全身毒性和产生耐药性细菌的风险，在水凝胶组织工程支架中加入安全性良好和具有抑菌作用的天然产物是解决抗生素缺点的有效策略。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的代表性菌株通常被用来测试组织生物工程支架的抑菌性能。相比于对照组组，BLG、TG、TLG和CTLG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均显著升高（p ＜ 0.01）（图5A-C）。对于大肠杆菌，BLG、TG、TLG和CTLG的抑菌率分别为18.02 ± 2.61%、59.93 ± 3.14%、84.55 ± 2.36%和93.88 ± 1.59。对于金黄色葡萄球菌，BLG、TG、TLG和CTLG的抑菌率分别为26.69 ± 3.09%、44.48 ± 1.10%、59.58 ± 2.49%和88.56 ± 2.83%。根据以往的报道，由于CMCS具有良好的性能，将同样具有抑菌作用的TAX加入到CMCS和ODEX基质水凝胶中有效提高了水凝胶组织生物工程支架的抑菌性能。然而，加入TL和CTL的水凝胶抑菌性能相比加入TAX得到改善，可能是因为脂质体可以破坏细菌的细胞膜从而提高了抑菌能力。此外，由于CSSH具有正电荷，CTL可以通过吸附到细菌表面，破坏其细胞膜的完整性，导致细胞内容物泄漏，并最终导致细菌的死亡。
2.9 水凝胶的抗溶血和体外释放
根据国际标准（SO/TR 7405），血液接触的生物材料的溶血率低于5%被认为是安全的。水凝胶的溶血实验结果如图5D所示。BLG、TG、TLG和CTLG的溶血率均低于5%。水凝胶的体外释放结果如图5E所示。在4天内，水凝胶中的TAX快速释放，这可能是由于水凝胶内部或纳米粒子表面的TAX经过水凝胶的降解快速释放。28天后TG中TAX的累计释放率为96.21 ±2.04%，TLG中TAX的累计释放率为82.96 ± 4.93%，而CTLG中TAX的累计释放率为70.48 ±3.41%。其中CTLG中TAX释放的速率缓慢的原因一方面可能是因为CTLG降解率缓慢，CTL在水凝胶内部得到了一定程度上的保护。另一方面可能是因为CSSH修饰TL后改善了纳米粒子体系的缓释性能。上述实验结果证明，BLG、TG、TLG和CTLG具有安全的抗溶血作用；此外，该水凝胶体系可以改善药物的缓释性能，符合骨修复水凝胶组织生物工程支架的要求。
2.10 水凝胶的细胞实验
细胞实验通常用来评价组织生物工程支架的生物安全性以及对细胞的增殖作用。CCK-8作为验证细胞增殖的实验可以通过吸光度测定水凝胶细胞的增殖作用。MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞是一种广泛用于成骨细胞学研究的细胞系，因此常用于测定骨修复生物材料促进成骨细胞的增殖和分化。BLG、TG、TLG和CTLG的CCK-8实验结果在图6C中显示。在第一天，各个水凝胶处理组与对照组在450 nm下的吸光度没有显著的差异。培养MC3T3-E1三天后，相比于对照组，其余处理组的吸光度均得到显著提高（p ＜ 0.05 or p ＜ 0.01）。同样，当不同水凝胶处理MC3T3-E1五天后，相比于对照组，其余处理组的吸光度均得到显著提高（p ＜ 0.01）。其中对照组、BLG处理组、TG处理组、TLG处理组和CTLG处理组在第五天的吸光度分别为0.95 ± 0.08、1.28 ± 0.13、1.55 ± 0.13、1.95 ± 0.04和2.41 ± 0.06。EdU是一种胸苷类似物，其中末端甲基被5位的炔基取代，可以在DNA复制过程中结合到细胞DNA中。因此，EdU染色同样可以用于检测细胞的增殖进程。EdU染色的结果如图6B和D所示。根据EdU定量分析结果显示，相比于对照组，TG、TLG和CTLG处理组的EdU阳性表达率显著高于对照组（p ＜ 0.01）。然而，BLG处理组的EdU阳性表达率虽然有一定程度上的改善，但是并没有显著升高。
成骨分化早期阶段的生化标志物是ALP活性，这是骨形成部位内无机磷酸盐富集所必需的。ALP染色可以用于评估经不同水凝胶处理后，用于评估MC3T3-E1的成骨增殖和分化。此外，ARS染色可以用于评估成熟骨细胞中的钙沉积。ALP和ARS染色的结果如图6A所示，根据结果可以发现四种处理组均可以提高MC3T3-E1的成骨分化和钙沉积，CTLG处理后的结果更明显。
2.11 水凝胶促进大鼠颅骨骨再生
通过微计算机断层扫描技术对水凝胶治疗8周后的颅骨修复程度。图7B显示了各个处理组8周后大鼠颅骨的修复作用，根据微型CT结果显示，模型组在8周后几乎没有新生的骨组织，这是因为对于临界骨缺损，机体几乎不能通过自身进行修复受损的骨组织。其中BLG、TG、TLG和CTLG治疗后，大鼠的颅骨缺损处出现了不同程度的修复作用，特别的，CTLG治疗组形成大量新生骨组织并几乎完全覆盖了缺损。为了更清晰的探究CTLG的骨修复作用，本发明对颅骨的微型CT结果进行了定量分析(图7C-F)。在治疗八周后模型组、BLG治疗组、TG治疗组、TLG治疗组和CTLG治疗组的BV/TV的定量结果分别为11.84 ± 4.32%、14.81 ±1.02%、23.77 ± 3.35%、40.49 ± 2.66%和50.06 ± 7.86%。TG、TLG和CTLG的BV/TV的定量结果要显著优于模型组（p ＜ 0.01）。对于Tb.N的定量分析结果，TG、TLG和CTLG的Tb.N显著优于模型组（p ＜ 0.01）。其中模型组、BLG治疗组、TG治疗组、TLG治疗组和CTLG治疗组的Tb.N定量结果分别为0.11 ± 0.03 mm-1、0.12 ± 0.01 mm-1、0.18 ± 0.01 mm-1、0.30 ±0.04 mm-1和0.33 ± 0.04 mm-1。而对于Tb.Th的定量分析结果，TG、TLG和CTLG的Tb.Th显著优于模型组（p ＜ 0.01），模型组和BLG组的Tb.Th定量结果分别为1.06 ± 0.11 mm和1.17± 0.10 mm，TG、TLG和CTLG治疗组的Tb.Th定量结果分别为1.25 ± 0.14 mm、1.35 ±0.011 mm、1.53 ± 0.24 mm，定量结果同样显示骨修复得到了显著改善（p ＜ 0.01）。Tb.Sp越小说明骨修复的程度越高，这与BV/TV、Tb.N和Tb.Th表达的趋势是相反的。Tb.Sp定量的结果显示，TG、TLG和CTLG的定量结果显著低于模型组（p ＜ 0.01）。模型组、BLG治疗组、TG治疗组、TLG治疗组和CTLG治疗组的Tb.Sp定量结果分别为8.86 ± 2.39 mm、7.08 ±0.51 mm、4.13 ± 0.32 mm、2.03 ± 0.37 mm和1.54 ± 0.54 mm。根据微型CT及其参数结果分析可得，在水凝胶中加入TAX可以促进大鼠颅骨骨缺损中的骨再生，通过脂质体包封TAX提高了TAX的生物利用度，此外，使用CSSH修饰TL加速了骨修复的进程，这可能因为CTL的加入提高了水凝胶体外生物活性有关。
2.12 组织病理学和免疫组化染色
组织病理学染色可以直观地反应出组织修复的程度，根据H&E染色和Masson染色结果可以看出（图8），在模型组中，仅有少量的新生纤维组织，这也就意味着在8周的治疗阶段内，模型组的大鼠颅骨缺损不能够依靠自身修复。在BLG治疗组中可以看到在颅骨缺损的部位连续的纤维组织生成，但是没有观察到新生的骨组织。经过TG和TLG治疗后，在大鼠颅骨的缺损部位可以看到有少量的新生骨组织生成，但是仍然有大量的纤维组织。CTLG治疗后的骨修复作用最为明显，在骨缺损的部位充斥着大量的新生骨组织与原生宿主骨相连。组织病理学染色的结果显示CTLG治疗后相比于其他治疗组可以明显促进骨缺损的修复。ALP、CD31和COL-1作为组织生长的标志物，通过加入活性成分可以促进它们的表达以改善骨缺损。ALP、CD31和COL-1的免疫组化染色及定量结果如图9所示，TG、TLG和CTLG治疗后，颅骨中的ALP、CD31和COL-1的表达与模型组相比得到了显著的改善（p ＜ 0.05 or p ＜0.01），其中CTLG处理组ALP、CD31和COL-1的表达最高。此外，OCN、OPN和Runx2是骨再生的关键基因，它们的表达与骨再生的进度呈正相关。Runx2被称为成骨细胞转录激活剂，被确定为成骨细胞分化的关键调节因子，在成骨细胞分化过程中发挥了重要作用，在调节成骨基因表达和在早期维持成骨细胞的分化起到重要的作用。OCN是基质沉积和矿化有关的标志物，与成骨细胞晚期的分化有关。根据以往的报道，OPN是成骨分化的中间或相对较早的标志物，与成骨细胞的矿化和基质合成有关。OCN、OPN和Runx2免疫组化染色及其定量结果在图10中显示。经不同水凝胶治疗后，各组大鼠颅骨中OCN、OPN和Runx2的表达在不同程度上得到了改善。其中，相比与模型组，TG治疗组、TLG治疗组和CTLG治疗组大鼠颅骨中的OCN、OPN和Runx2的表达显著升高（p ＜ 0.05 or p ＜ 0.01）。
2.13 Western Blot分析
本发明通过Western Blot实验探究了CTLG通过激活Wnt信号通路和促进成骨相关蛋白表达促进骨修复的作用机制。Wnt信号通路作为一种典型的骨修复信号通路，FZD是Wnt信号通路的上游靶点，位于细胞外膜，起类似G蛋白偶联受体的作用，FZD的过度表达能够激活Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路的激活能够促进Cyclin D1的表达从而促进细胞的增殖。OCN、OSX、BSP和BMP2是骨生成的相关蛋白。OCN是骨中最丰富的非胶原蛋白，可以用于评估成骨分化晚期骨形成的生物学指标，而OSX在骨组织形成和重建的初始调节中起着重要作用。BMP2可以调节骨折修复过程中参与软骨和骨形成的各种细胞的分化，BSP是一种酸性非胶原糖蛋白。它在正常成骨细胞和破骨细胞的骨矿化、分化和活性中发挥重要作用。因此，对于促进成骨相关的蛋白的表达在促进骨缺损的愈合具有重要意义。通过图11可以观察到，与模型组相比，CTLG治疗后可以显著提高Wnt信号通路相关蛋白（Wnt、FZD、β-catenin和Cyclin D1）的表达（p ＜ 0.01）。此外，BLG、TG和TLG治疗组中Wnt信号通路相关蛋白表达也得到不同程度的改善，但CTLG治疗组的效果最好。根据OCN、OSX、BSP和BMP2的定量结果显示，CTLG治疗组的表达最高（见图12），而且相比于模型组，CTLG治疗组中的成骨相关蛋白的表达得到了显著的升高（p ＜ 0.01）。
以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于修复骨缺损的脂质体，其特征在于，该脂质体为CTL，所述CTL是经CSSH修饰的TL，所述CSSH为壳聚糖经改性制备的巯基化壳聚糖；所述TL为二氢槲皮素脂质体。
2.权利要求1所述的用于修复骨缺损的脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）CTL的合成
首先取壳聚糖溶于乙酸水溶液，向其中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，然后在室温下避光搅拌；按照比例向其中加入半胱氨酸，随后调节溶液pH在5-6之间，在室温下避光反应；最后使用透析溶液透析，透析溶液分别为pH = 5的HCl水溶液、含有1%NaCl且pH 为 5-6的HCl水溶液，每过12个小时更换透析溶液，两种透析溶液交替更换，透析后的产物为CSSH；
（2）TL的制备
首先取大豆卵磷脂、胆固醇和二氢槲皮素溶于甲醇和氯仿的混合溶液中，将装有上述溶液的圆底烧瓶置于旋转蒸发仪中除去所有的试剂后，将圆底烧瓶置于真空干燥箱中以完全除去有机试剂；随后加入PBS进行水合，水合结束后通过超声细胞破碎仪超声以完全分散得到TL混悬液；其中，所述大豆卵磷脂、胆固醇和二氢槲皮素的质量比为9: 1.5 : 1；
（3）CTL的制备
将步骤（2）的TL混悬液与CSSH水溶液混合后在常温下搅拌，得到CTL混悬液。
3.根据权利要求2所述的用于修复骨缺损的脂质体的制备方法，其特征在于，步骤（3）在得到CTL混悬液之后，通过离心处理，去除未包封的二氢槲皮素。
4.权利要求1所述的一种用于修复骨缺损的脂质体在制备促进骨再生、修复骨缺损的药物中应用。
5.一种水凝胶，其特征在于，所述水凝胶内负载权利要求1所述的用于修复骨缺损的脂质体。
6.根据权利要求5所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶是以氧化葡聚糖和羧甲基壳聚糖作为基质，通过化学反应制备得到。
7.权利要求6所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氧化葡聚糖的制备
首先称取葡聚糖加入到蒸馏水中溶解，随后将高碘酸钠加入到葡聚糖溶液中，避光反应；然后加入乙二醇终止反应，使用双蒸水透析，透析后的产物为氧化葡聚糖；
（2）水凝胶的制备
将5%的羧甲基壳聚糖加入到CTL溶液中搅拌均匀后，加入5%的氧化葡聚糖水溶液混合得到水凝胶；其中，5%的羧甲基壳聚糖与5%的氧化葡聚糖的体积比为1：1；所述CTL为权利要求1所述的用于修复骨缺损的脂质体。
8.权利要求5或6所述的水凝胶在制备促进骨再生、修复骨缺损的药物中应用。
9.权利要求5或6所述的水凝胶作为Wnt/β-catenin信号通路的激活剂在制备用于预防或治疗由Wnt信号途径异常失活所引起的疾病的药物中应用，所述疾病包括骨损伤、骨质疏松。
10.权利要求5或6所述的水凝胶在制备用于促进成骨相关蛋白表达的药物中应用，所述成骨相关蛋白包括OCN、OSX、BSP、BMP2、CD31、ALP、CoL-Ⅰ、OPN、Runx2。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117679555A (zh) * 2024-02-04 2024-03-12 吉林农业科技学院 落叶松纤维素水凝胶及其制备方法与促进骨骼修复的应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090143331A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Dimitrios Stroumpoulis Polysaccharide gel formulation having increased longevity
US20110076332A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-31 Xiaojun Yu Dextran-chitosan based in-situ gelling hydrogels for biomedical applications
KR20110088702A (ko) * 2010-01-29 2011-08-04 전남대학교산학협력단 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법
CN116139344A (zh) * 2023-02-20 2023-05-23 武汉理工大学 一种促进成骨细胞生成的骨修复材料及其制备方法
CN116370404A (zh) * 2023-03-28 2023-07-04 福州大学 用于骨肉瘤诊疗一体化的可注射复合水凝胶及其制备方法
CN116570760A (zh) * 2023-07-11 2023-08-11 吉林农业科技学院 促进慢性伤口愈合的多功能缓释敷料及其制备方法与应用
CN116637068A (zh) * 2023-06-05 2023-08-25 吉林大学 一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法及其应用
CN116688224A (zh) * 2022-02-28 2023-09-05 苏州大学 促进骨软骨再生的复合水凝胶支架及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090143331A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Dimitrios Stroumpoulis Polysaccharide gel formulation having increased longevity
US20110076332A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-31 Xiaojun Yu Dextran-chitosan based in-situ gelling hydrogels for biomedical applications
KR20110088702A (ko) * 2010-01-29 2011-08-04 전남대학교산학협력단 티올 키토산이 코팅된 에이코사펜타에노산 함유 리포좀 및 이의 제조방법
CN116688224A (zh) * 2022-02-28 2023-09-05 苏州大学 促进骨软骨再生的复合水凝胶支架及其制备方法和应用
CN116139344A (zh) * 2023-02-20 2023-05-23 武汉理工大学 一种促进成骨细胞生成的骨修复材料及其制备方法
CN116370404A (zh) * 2023-03-28 2023-07-04 福州大学 用于骨肉瘤诊疗一体化的可注射复合水凝胶及其制备方法
CN116637068A (zh) * 2023-06-05 2023-08-25 吉林大学 一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法及其应用
CN116570760A (zh) * 2023-07-11 2023-08-11 吉林农业科技学院 促进慢性伤口愈合的多功能缓释敷料及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIHUI WENG ET.AL.: "Non-cytotoxic, in situ gelable hydrogels composed of N-carboxyethyl chitosan and oxidized dextran", 《 BIOMATERIALS》, vol. 29, no. 29, pages 3905, XP023611035, DOI: 10.1016/j.biomaterials.2008.06.025 *
SOK KUAN WONG ET.AL.: "Quercetin as an Agent for Protecting the Bone: A Review of the Current Evidence", 《INT. J. MOL. SCI.》, vol. 21, no. 17, pages 8 *
李日旺: "脂质体的稳定化修饰及其原位成型水凝胶的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技Ⅰ辑》, pages 15 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117679555A (zh) * 2024-02-04 2024-03-12 吉林农业科技学院 落叶松纤维素水凝胶及其制备方法与促进骨骼修复的应用
CN117679555B (zh) * 2024-02-04 2024-04-12 吉林农业科技学院 落叶松纤维素水凝胶及其制备方法与促进骨骼修复的应用

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