CN116637068A - 一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法及其应用，包括以下步骤将SDF‑1和BMP‑2溶于PBS中；将4‑arm‑PEG‑NH2和ODEX分别溶于SDF‑1和BMP‑2混合溶液中；将4‑arm‑PEG‑NH2溶液和ODEX溶液混合，并旋转；静置，得生物水凝胶。本发明的技术方案通过搭载细胞因子的生物水凝胶，用于置入骨缺损，提高骨缺损的修复和治疗的效果；其主要由4臂氨基聚乙二醇和氧化葡聚糖通过席夫碱反应交联制得，并在材料制备过程中SDF‑1和BMP‑2。SDF‑1可以诱导骨髓间充质干细胞归巢，使骨髓间充质干细胞定向趋化迁徙至骨缺损部位，BMP‑2是经典的强烈促进骨髓间充质干细胞增殖和分化成骨的细胞因子，PEG‑ODEX水凝胶是一种优秀的药物载体，为SDF‑1和BMP‑2的定位和释放提供了良好稳定环境。该生物水凝胶具有修复骨缺损的作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其涉及一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法。
背景技术
随着世界人口老龄化愈加严重，骨折、骨质疏松等肌肉骨骼疾病迅速增加，
因此，与肌骨疾病相关的医疗费用不断增加。在美国，每年由癌症和创伤造成的大段骨缺损需要进行骨移植的病例超过62万例，耗资约25亿美元。目前主要的手术治疗措施为金属植入物的填充。然而，由于金属植入物磨损和负重不当，导致假体松动移位、假体周围发生炎症、骨吸收和骨溶解等，最后结局为移植物失效，自体骨移植可用来治疗大段骨缺损，被认为治疗大段骨缺损的金标准。然而，骨移植仍有不足之处。自体骨移植，必须从患者的健康供体部位将骨组织取出，然后再植入病变部位，这将延长手术时间；其次自体骨移植物主要取自骨盆或髂骨等骨组织，这可能在一定的程度上引起供体部位出现较为严重的并发症，并且供体部位只能获取少许骨组织。同种异体骨移植物是指从人类的其它个体获得的骨组织，如人类尸体和捐赠者。同种异体骨移植物可能存在免疫排斥、生物活性降低和病原体传播的风险。外科金属植入物和自体/同种异体移植物的天然不足，促使我们对骨组织工程替代方案进行深入探索。
骨组织工程所需的最主要的生物学要素包括种子细胞、细胞外基质支架和促进生长、分化和血管生成的细胞因子。骨组织工程的重点是开发具有适当孔隙度的植入物，以起到支撑作用并为细胞爬行和黏附提供空间，进而起到促进骨组织修复再生的效果。理想的骨组织工程植入物应该具有三维网络的多孔结构，因此三维多孔支架可以作为一种指导新组织生长和再生的临时支架。为了实现骨再生的最佳状态，植入物应随着时间的推移而降解，并由宿主骨组织替代，宿主骨组织根据负荷和功能进行重塑。降解速率应该与骨生长速率相似。植入物应该满足一定的机械条件，并以特定的方式传递细胞因子和生物信号。植入物还可以作为各种生长因子、细胞因子和细胞移植的仓库或载体。虽然局部注射细胞因子治疗在临床应用中表现出了良好的效果，但因子弥散在损伤部位外，修复潜力低。聚合物支架材料可以解决这一问题，为细胞因子提供一个限定的空间，使其定位在损伤部位并持续释放。
综上所述，如何制备一种新型的植入物材料，用于提高骨缺损的修复和治疗的效果，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提出一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，旨在设计一种新型的植入物材料的制备方法，用于提高骨缺损的修复和治疗的效果。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，包括以下步骤：
将SDF-1和BMP-2溶于PBS中；
将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2混合溶液中；
将4-arm-PEG-NH2溶液和ODEX溶液混合，并旋转；
静置，得生物水凝胶。
在本发明一实施例中，所述将SDF-1和BMP-2溶于PBS的步骤中，所述SDF-1和BMP-2的溶度为50μg/L-2000μg/L。
在本发明一实施例中，所述将4-arm-PEG-NH2溶液和ODEX溶液混合，并旋转的步骤中，所述4-arm-PEG-NH2溶液与ODEX溶液的重量比为2:1。
在本发明一实施例中，所述将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2混合溶液中的步骤包括：
取4-arm-PEG-OH溶于二氯甲烷中；
将甲基磺酰氯和三乙胺加入到4-arm-PEG-OH溶液，继续搅拌反应；
用冰无水乙醚沉淀甲基磺酰氯和三乙胺溶液，在45℃下真空干燥，得到干粉；
将干粉和氨水反应7天，降至室温后，用二氯甲烷萃取水相，减压浓缩，滴入冷乙醚中，得4-arm-PEG-NH2。
在本发明一实施例中，所述将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2混合溶液中的步骤还包括：
取右旋糖酐溶于蒸馏水中；
将高碘酸钠加入右旋糖酐溶液，继续搅拌反应24h；
用去离子水对反应后的溶液进行透析；
将透析后的溶液冷冻冻干得ODEX。
为解决上述技术问题，本发明还提出了根据上述的促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法制得的生物水凝胶在骨缺损修复中的应用。
本发明的技术方案，本申请通过搭载细胞因子的生物水凝胶，用于置入骨缺损，提高骨缺损的修复和治疗的效果；其主要由4臂氨基聚乙二醇(4-arm poly(ethyleneglycol)amine,4-arm-PEG-NH2)和氧化葡聚糖(oxidized dextran,ODEX)通过席夫碱(Schiff base)反应交联制得，并在材料制备过程中装载基质细胞衍生因子-1(StromalCell Derived Factor-1，SDF-1)和骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Proteins-2，BMP-2)。本申请中，SDF-1可以诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)归巢，使骨髓间充质干细胞定向趋化迁徙至骨缺损部位，BMP-2是经典的强烈促进骨髓间充质干细胞增殖和分化成骨的细胞因子，PEG-ODEX水凝胶为SDF-1和BMP-2的释放提供了良好稳定的载体环境。经实验验证，该生物水凝胶有修复骨缺损的作用，可以作为骨组织细胞为基础的骨组织的新型支架。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所述用于骨缺损修复的生物水凝胶制备方法制备的生物水凝胶的示意图；
图2为本发明用于修复骨缺损的生物水凝胶制备方法的成胶示意图；
图3为本发明生物水凝胶的电镜扫描结果示意图；
图4为本发明生物水凝胶的流变实验结果示意图；
图5为本发明不同浓度SDF-1对BMSCs趋化作用结果示意图；
图6为本发明不同浓度BMP-2对BMSCs增殖影响结果示意图；
图7为本发明生物水凝胶与BMSCs共培养后活死细胞染色结果示意图；
图8为本发明生物水凝胶与BMSCs共培养后CCK-8检测结果示意图：
图9为本发明空载水凝胶的体内降解速率曲线图；
图10为本发明生物水凝胶的体外药物释放动力学示意图；
图11为本发明生物水凝胶茜素红染色半定量分析示意图；
图12为本发明生物水凝胶促进骨缺损修复micro-CT结果及分析示意图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，旨在设计一种新型的复合置入材料，用于提高骨缺损的修复和治疗的效果。
以下设置多个实施例，其中所有实施例中实验试剂和器材如下：
实验试剂：4-arm-PEG-OH、二氯甲烷、甲基磺酰氯、三乙胺、无水乙醚、氨水、右旋糖酐、高碘酸钠均购自Aladdin，DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)、兔骨髓间充质干细胞、PBS、SDF-1和BMP-2冻干粉均购自Gibco，CCK8试剂盒、活死染色试剂盒、茜素红染色试剂盒均购自北京碧云天，SDF-1和BMP-2Elisa试剂盒购自江源生物。
实验器材：OHAUS-Adventure电子天平取自于美国奥豪斯公司；MilliporeDirect-Q8 UV超纯水机取自于德国默克密理博公司；MS7-H550-S恒温加热磁力搅拌器、透析袋取自于北京大龙兴创实验仪器股份公司；超低温冰箱取自于Thermo Scientific；LABCONCO冷冻干燥机取自于美国LABCONCO公司。
下面将在具体实施例中对本发明提出的促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法的具体结构进行说明：
实施例1
一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备4-arm-PEG-NH2
(1)称取20.0g 4-arm-PEG-OH，溶解于100mL二氯甲烷中。
(2)然后分别加入2.3g甲基磺酰氯和1.1g三乙胺到(1)中的溶液中，继续搅拌反应24h；
(3)反应完成后，用冰无水乙醚沉淀(2)中的溶液，然后在45℃下真空干燥，直到重量恒定；
(4)将(3)中得到的干粉和100mL氨水反应7天，降至室温后，用二氯甲烷萃取水相，减压浓缩至50mL，滴入冷乙醚中，即可制得4-arm-PEG-NH2，-20℃冰箱中保存。
步骤二、制备ODEX
(1)称取2.0g右旋糖酐放入100mL的干烧瓶中，室温条件下加蒸馏水缓慢搅拌至右旋糖酐溶解；
(2)加入792mg高碘酸钠至(1)中的溶液，室温条件下继续搅拌24h；
(3)用去离子水对(2)的溶液进行透析3天(分子量3500Da)(用于去除粗产物)；
(4)将(3)中的溶液于-80℃冷冻过夜后，转移至冻干机中干燥24h，最后对溶液进行冷冻干燥，得到ODEX，-20℃保存。
步骤三、制备SDF-1和BMP-2混合溶液
(1)将SDF-1和BMP-2溶于PBS中。
可以理解地，所述SDF-1和BMP-2的浓度为50μg/L-2000μg/L
此步骤中分别采用SDF-1和BMP-2的浓度为：0μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，250μg/L，500μg/L，1000μg/L，2000μg/L，配制成不同浓度SDF-1的细胞培养基，用于对BMSCs的Transwell实验，验证SDF-1对BMSCs趋化作用的最佳浓度，配制成不同浓度BMP-2的细胞培养基，对BMSCs进行培养，用CCK-8法分别进行对BMSCs增殖的分析，结果如图5所示，其中SDF-1浓度为500μg/L时，对BMSCs的趋化作用最为明显；结果如图6所示。BMP-2浓度为500μg/L时，对BMSCs的增殖作用最为明显。
优选地，所述SDF-1和BMP-2的溶度均为500μg/L。
四、制备生物水凝胶
(1)将步骤一、步骤二中制得的最终产物以10wt％分别溶解在步骤三中的SDF-1和BMP-2的混合溶液中；
(2)将(1)的4-arm-PEG-NH2溶液与ODEX溶液以2:1的重量比混合，旋转10s后，将400μL的混合物加入24孔板中并放置15min，得到生物水凝胶，如图1所示。
可以理解地，所述4-arm-PEG-NH2溶液与ODEX溶液的重量比为2:1。由于4-arm-PEG-NH2和ODEX的反应的是迅速的，因此，需要先将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2的混合溶液中，在4-arm-PEG-NH2和ODEX反应时，形成的水凝胶多孔纤维能够直接物理包裹SDF-1和BMP-2，进而构成生物水凝胶，如图2所示。
本申请通过搭载细胞因子的生物水凝胶，用于置入骨缺损，提高骨缺损的修复和治疗的效果；其主要由4-arm-PEG-NH2和ODEX通过席夫碱反应交联制得，并在材料制备过程中装载SDF-1和BMP-2。SDF-1可以诱导BMSCs归巢，使骨髓间充质干细胞定向趋化迁徙至骨缺损部位，BMP-2是经典的强烈促进骨髓间充质干细胞增殖和分化成骨的细胞因子，PEG-ODEX水凝胶为SDF-1和BMP-2的释放提供了良好稳定的载体环境。经实验验证，该水凝胶有修复骨缺损的作用，可以作为骨组织细胞为基础的骨组织的新型支架。
实施例2
一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备4-arm-PEG-NH2：
(1)称取20.0g 4-arm-PEG-OH，溶解于100mL二氯甲烷中。
(2)然后分别加入2.3g甲基磺酰氯和1.1g三乙胺到(1)中的溶液中，继续搅拌反应24h；
(3)反应完成后，用冰无水乙醚沉淀(2)中的溶液，然后在45℃下真空干燥，直到重量恒定；
(4)将(3)中得到的干粉和100mL氨水反应7天，降至室温后，用二氯甲烷萃取水相，减压浓缩至50mL，滴入冷乙醚中，即可制得4-arm-PEG-NH2，-20℃冰箱中保存。
步骤二、制备ODEX：
(1)称取2.0g右旋糖酐放入100mL的干烧瓶中，室温条件下加蒸馏水缓慢搅拌至右旋糖酐溶解；
(2)加入792mg高碘酸钠至(1)中的溶液，室温条件下继续搅拌24h；
(3)用去离子水对(2)的溶液进行透析3天(分子量3500Da)(用于去除粗产物)；
(4)将(3)中的溶液于-80℃冷冻过夜后，转移至冻干机中干燥24h，最后对溶液进行冷冻干燥，得到ODEX，-20℃保存。
步骤三、制备空载水凝胶：
(1)将步骤一、步骤二中制得的最终产物以10wt％分别溶解在PBS中；
(2)将(1)的4-arm-PEG-NH2溶液与ODEX溶液以2:1的重量比混合，旋转10s后，将400μL的混合物加入24孔板中并放置15min，得空载水凝胶。
步骤四、制备生物水凝胶
(1)将SDF-1和BMP-2溶于PBS中。
(2)将步骤一、步骤二中制得的最终产物以10wt％分别溶解在(1)中的SDF-1和BMP-2的混合溶液中；
(3)将(2)的4-arm-PEG-NH2溶液与ODEX溶液以2:1的重量比混合，旋转10s后，将400μL的混合物加入24孔板中并放置15min，得到生物水凝胶，如图1所示。
生物水凝胶的表征：
(1)由上述方法制备得到的生物水凝胶在-80℃下冷冻12小时之后，冷冻样品冻干24小时。对冻干生物水凝胶进行扫描电子显微镜和流变实验。如图3和图4所示，该水凝胶微观呈交联网络多孔结构，孔径在50μm到100μm之间。该孔径大小也是骨组织工程生物植入物的最佳孔径，且这种致密多孔结构保证了小分子药物和蛋白类药物的装载和控释特性。该水凝胶贮能模量G′大于相应的损耗模量G″，表现出凝胶的性质。
空载水凝胶与生物水凝胶的生物相容性和对BMSCs增殖的分析：
(1)将BMSC在含10％胎牛血清DMEM/F12培养基中，置于37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中进行培养。将培养至第三代的BMSCs用于所有体外细胞实验的评估。
(2)实验过程为以1×104个/孔的密度将BMSCs细胞悬液分别接种在空白孔(control，Ctrl组)、含有空载水凝胶(pure hydrogel，H组)和生物水凝胶(pure hydrogelincorporated SDF-1and BMP-2,H/SDF-1/BMP-2组)的培养孔中。
(3)在培养箱孵育1天和3天后，根据活死细胞染色试剂盒的说明制备钙黄绿素-AM/PI染色剂的工作溶液用于浸泡样品。在4℃避光条件下浸泡每组样品15分钟后，去除工作液，PBS清洗两遍，洗去多余染料，在荧光显微镜下观察细胞活死情况。如图7所示，每组BMSCs活细胞的染色数量从第1天到第3天呈现明显增加的趋势。在每个时间点，三个组之间的死细胞数量没有显着差异。表明该空载水凝胶和生物水凝胶都具有良好的生物相容性。
(4)采用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)来检测复合体系对BMSCs细胞增殖的具体影响。将1×104个BMSCs分别接种到H组和H/SDF-1/BMP-2组。
(5)在与各组水凝胶共培养1、3和7天后，在每个时间点分别进行实验。更换每组培养孔内的完全培养基，将培养基体积10％的CCK-8工作液加入培养孔中，并在37℃和5％CO2条件下孵育2小时。应用酶标仪在450nm处检测每组反应液吸光度。结果如图8所示，每组的BMSCs细胞在7天的实验期限内均展现了显著的细胞增殖趋势，细胞活性良好。其中，第3、7天，空白孔组和空载水凝胶组的增殖率没有差异，生物水凝胶组的细胞增殖更为明显，远超其余组；表明空载水凝胶对BMSCs的增殖活性并没有影响，而搭载SDF-1和BMP-2的生物水凝胶具有促进BMSCs增殖的作用。既证明了空载水凝胶具有良好的生物相容性，又证明了搭载SDF-1和BMP-2的生物水凝胶具有促进BMSCs增殖的作用。
(6)在实施例步骤三中，分别采用SDF-1和BMP-2混合溶液的浓度为：0μg/L，20μg/L，50μg/L，100μg/L，250μg/L，500μg/L，1000μg/L，2000μg/L，配制成含有不同浓度SDF-1和BMP-2的细胞培养基用于后续实验。SDF-1对BMSCs的作用主要是趋化，所以此处采用Transwell实验探索SDF-1的最佳浓度。将BMSCs用无血清培养基培养24小时，使其饥饿。将1000个饥饿BMSCs种植Transwell小室中，每个小室置于含不同浓度SDF-1浓度的培养基中。小室底部为一层聚碳酸酯膜，这层膜具有通透性，将小室培养液和孔板培养液隔开，孔板中的培养液可以影响小室中的细胞。12小时后，在SDF-1趋化作用下，细胞会穿过孔隙到达聚碳酸酯膜的背面。取出小室，擦除正面残余细胞，用甲醛固定背面细胞，2％龙胆紫染色半小时，显微镜下观察细胞数目。结果如图5所示，浓度为500μg/L、1000μg/L、2000μg/L时，趋化作用明显。用CCK-8法检测BMP-2对BMSCs增殖的影响，结果如图6所示，BMP-2的浓度为500μg/L和1000μg/L时，对BMSCs的增殖作用最为明显。考虑到成本和安全性，优选地，SDF-1和BMP-2的浓度分别为500μg/L。
实施例3
生物水凝胶在骨缺损修复中的应用，包括：
按照实施例2的步骤制备空载水凝胶和生物水凝胶；
空载水凝胶的体内降解分析：
(1)SD大鼠异氟烷麻醉后，背部两侧剃毛，将水凝胶注射至皮下，每侧注射0.4mL；
(2)分别在第0、3、7、14、21、28、35天处死大鼠，取下注射周围皮肤，剔除筋膜，将取出的残余水凝胶称重，观察降解情况。结果如图9所示，该水凝胶在前期吸水溶胀，之后平稳地被降解，整个过程持续35天左右，实现较长时间降解，符合成骨需求。因此当生物水凝胶用药在身体内时，是可以被降解的，符合用药标准。
生物水凝胶的药物释放性分析：
(1)采用Elisa法检测生物水凝胶在体外的药物释放情况。将检测体外药物释放时载入凝胶的药物浓度提高到了100μg/L。生物水凝胶制备完成后，将其置于37℃去离子水中，分别在第1,2,3,5,7,14,21,28天时收集浸泡液。收取后，加入等量的去离子水继续浸泡。
(2)根据Elisa试剂盒说明书制备工作液，将(1)中收取的浸泡液与工作液混合，加入到试剂盒中所带的底部涂有抗体的孔板中，孵育30分钟，通过显色反应后在450nm波长处测定各样本吸光度，根据标准曲线计算浸泡液中药物浓度，评价药物释放情况。结果如图10所示，35天期间H/SDF-1和BMP-2生物水凝胶药物的释放动力学，其显示了较为良好的持续性药物缓释性。在初期药物的释放速度较快，在第一天SDF-1和BMP-2的总释放百分比分别为12.8％±1.2％和15.7％±1.6％，在接下来的28天中，药物的释放速率明减慢,展现了良好的缓释效果。而到第28天和第35天，从生物水凝胶释放的药物总量几乎无增加，因此停止了药物浸提液的收取。在药物缓释体系结构中，药物的释放过程主要由材料的降解以及药物本身的扩散而介导。在释放的初期阶段由于水凝胶尚未降解，所以药物主要以自由扩散的形式进行释放。同时，药物在进行扩散时的速率与水凝胶的孔径大小密切相关，孔径越大，药物越容易通过水凝胶的网络结构进行扩散，从而加速药物释放。该水凝胶的孔径约为50-100μm，虽然其孔径较小，但其吸水溶胀能力较强，使得SDF-1和BMP-2更容易扩散到外界。但这个爆发释放阶段并不长，随着该水凝胶溶胀到极限和水凝胶逐渐降解，药物的释放变为主要由材料的缓慢降解为主导，因而药物释放速度减慢，展现了良好的药物缓释曲线。总体而言，本申请所构建的生物水凝胶体系能够实现很好的药物释放结果。
空载水凝胶和生物水凝胶对BMSC成骨分化的影响：
(1)生物水凝胶对BMSCs成骨分化的作用在成骨诱导培养基的诱导下进行评估与检测。将BMSCs以1x105个/孔的密度分别接种在Ctrl、H和H/SDF-1/BMP-2孔板中，并用成骨诱导培养基培养。
(2)在诱导第21天后，分别进行茜素红染色,用PBS洗涤细胞两次，在37℃下用4％多聚甲醛固定30分钟。然后将茜素红溶液加入到已固定的细胞上，并在室温下孵育30分钟。
(3)将各组的钙化结节用10％的十六烷基氯化吡啶溶液溶解，并检测反应液在562nm处吸光度进行半定量分析。结果如图9所示，在第21天,H/SDF-1/BMP-2组在所有组中显示出最深的钙节结染色和最大的染色面积。而茜素红染色的半定量分析也进一步证实了上述实验结果，表明H/SDF-1/BMP-2组的钙化结节数量明显高于其他组。成骨细胞的分化是一个连续的过程，已分化的细胞可以分泌矿化细胞外基质基质，从而促进矿物质(例如钙)的沉积。因此，钙沉积是成熟成骨细胞的标志物。茜素红染色的实验结果表明，生物水凝胶促进了BMSCs的体外成骨分化。
空载水凝胶和生物水凝胶对骨缺损修复分析：
(1)将30只新西兰大白兔随机分为3组，每组10只。以50mg/kg的剂量使用3％(w/v)戊巴比妥进对实验动物进行麻醉后进行手术。麻醉后备皮，术区消毒，铺洞巾，在左前肢远端桡侧行纵向切口，逐层分离筋膜、肌肉，暴露桡骨。
(2)使用小型电锯切除2cm长桡骨，造成2cm缺损，并将缺损处上下0.5cm的骨膜清理干净。Ctrl组直接逐层缝合伤口，H组在缺损处注射空白水凝胶后逐层缝合伤口，H/SDF-1/BMP-2组在缺损处注射生物水凝胶后逐层缝合伤口。在手术后3天内每只实验动物均进行肌肉注射青霉素(1.5mg/kg)，以防止感染。
(3)术后12周，在麻醉状态下对兔子进行安乐死，收集桡骨标本后行micro-CT检测。结果如图12所示，H/SDF-1和BMP-2组缺损处几乎被新生骨填满，BV/TV达到了90.2％±1.3％，而Ctrl组和H组新生骨填充情况不佳，缺损处只见少量新生骨，断端呈鼠尾状，形成萎缩性骨不连。因此，生物水凝胶能够很好地促进骨缺损修复，可将生物水凝胶应用到骨缺损修复中。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将SDF-1和BMP-2溶于PBS中；
将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2混合溶液中；
将4-arm-PEG-NH2溶液和ODEX溶液混合，并旋转；
静置，得生物水凝胶。
2.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，其特征在于，所述将SDF-1和BMP-2溶于PBS的步骤中，所述SDF-1的溶度为50μg/L-2000μg/L，所述BMP-2的浓度为50μg/L-2000μg/L。
3.根据权利要求2所述的促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，其特征在于，所述将4-arm-PEG-NH2溶液和ODEX溶液混合，并旋转的步骤中，所述4-arm-PEG-NH2溶液与所述ODEX溶液的重量比为2:1。
4.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，其特征在于，所述将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2混合溶液中的步骤包括：
取4-arm-PEG-OH溶于二氯甲烷中；
将甲基磺酰氯和三乙胺加入到4-arm-PEG-OH溶液，继续搅拌反应；
用冰无水乙醚沉淀甲基磺酰氯和三乙胺溶液，在45℃下真空干燥，得到干粉；
将干粉和氨水反应7天，降至室温后，用二氯甲烷萃取水相，减压浓缩，滴入冷乙醚中，得4-arm-PEG-NH2。
5.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法，其特征在于，所述将4-arm-PEG-NH2和ODEX分别溶于SDF-1和BMP-2混合溶液中的步骤还包括：
取右旋糖酐溶于蒸馏水中；
将高碘酸钠加入右旋糖酐溶液，继续搅拌反应24h；
用去离子水对反应后的溶液进行透析；
将透析后的溶液冷冻冻干得ODEX。
6.根据权利要求1至权利要求5中任一项所述的用于骨缺损修复的生物水凝胶制备方法制得的生物水凝胶在骨缺损修复中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310655262.0A CN116637068A (zh) | 2023-06-05 | 2023-06-05 | 一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310655262.0A CN116637068A (zh) | 2023-06-05 | 2023-06-05 | 一种促进骨缺损修复的生物水凝胶制备方法及其应用 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN116637068A true CN116637068A (zh) | 2023-08-25 |
Family
ID=87619712
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116637068A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117138058A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 吉林农业科技学院 | 用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用 |
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2023
- 2023-06-05 CN CN202310655262.0A patent/CN116637068A/zh active Pending
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN117138058A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 吉林农业科技学院 | 用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用 |
| CN117138058B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-06 | 吉林农业科技学院 | 用于修复骨缺损的脂质体、水凝胶及制备方法与应用 |
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