CN117660571A - 增强降血糖活性的贝类糖胺聚糖及其结构改性方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及增强降血糖活性的贝类糖胺聚糖及其结构改性方法和应用，该方法包括以下步骤：对贝类糖胺聚糖，采用酶解解聚的方法得到低聚贝类糖胺聚糖；所述酶解解聚中，使用的酶为硫酸软骨素酶ABC，所述的贝类，包括牡蛎、贻贝、缢蛏、花蛤。本发明选用具有特异性的硫酸软骨素酶ABC对贝类糖胺聚糖进行酶解解聚，降低了糖胺聚糖的分子量；并进一步通过酶解解聚工艺条件的优化，和特异性的硫酸软骨素酶ABC科学配合，获得了具有更强的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，从而增强降血糖活性的低聚贝类糖胺聚糖。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及增强降血糖活性的贝类糖胺聚糖及其结构改性方法和应用。
背景技术
糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)：又称为酸性粘多糖，是一类由己糖醛酸和己糖胺重复单元构成的长线性杂多糖阴离子聚合物(角质素除外)，结构复杂，具有极性和带负电荷的分子。按现今确定的结构分类，GAGs主要分为肝素(Heparin)、硫酸乙酰肝素(Heparan Sulphate)、透明质酸(Hyaluronic Acid)、硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate)、硫酸皮肤素(Dermatan Sulfate)和硫酸角质素(Keratan Sulphate)等。
海洋动物糖胺聚糖具有的特殊结构和活性引起了广泛重视，研究者从扇贝、翡翠贻贝、牡蛎、四角蛤蜊等海洋动物中提取并分离出各种糖胺聚糖，研究了这些糖胺聚糖的理化性质、生理活性、药用价值。天然提取的贝类糖胺聚糖分子量较大，生理活性较低，限制了其在功能食品、保健食品、药品等中的应用。开展贝类糖胺聚糖结构改性方法的研究，可为贝类糖胺聚糖的高价值开发利用提供技术支撑。
糖胺聚糖具有α-葡萄糖苷酶抑制、抗凝血等多种生物活性，其中α-葡萄糖苷酶抑制的研究近年来倍受关注。
α-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖基转移酶，是机体中糖吸收过程中一类重要的酶。现有研究表明，人小肠中的α-葡萄糖苷酶通过水解多糖与低聚糖生成葡萄糖，通过肠道吸收进入体内。抑制小肠中的α-葡萄糖苷酶的活性，能够减少葡萄糖的生成，从而减少葡萄糖的吸收，有效降低餐后高血糖，稳定血糖水平，在调节糖代谢的同时也抑制了脂肪的生成。
天然提取的糖胺聚糖显示出一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但较大的分子量(25-140kDa)阻碍了其与α-葡萄糖苷酶活性位点的结合，不利于生物活性的发挥。具有较低分子量的糖胺聚糖可以较好地与α-葡萄糖苷酶的活性作用位点相结合，充分发挥其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。因此，有必要对糖胺聚糖的结构改性方法进行研究，建立一种高效的糖胺聚糖解聚方法，获得具有较好α-葡萄糖苷酶抑制作用的低聚糖胺聚糖。糖胺聚糖的解聚方法主要包括化学降解法、物理降解法和生物降解法。但物理降解法反应过于剧烈，条件不易控制，会破坏糖胺聚糖的生物活性；化学法添加了外源性化学试剂、产物分离纯化难，不利于后续产品的开发。因此，高安全性、反应条件温和、工艺可控的生物降解法成为制备低聚糖胺聚糖的最佳方法。
中国发明专利CN116675784A公开了一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的牡蛎糖胺聚糖，通过复合酶酶解得到牡蛎糖胺聚糖酶解液，再对酶解液采用阳离子交换层析柱去除杂蛋白和杂多糖，之后采用阴离子交换层析柱精细纯化，得到牡蛎糖胺聚糖。
中国发明专利CN103788222B公开了Fuc3S4S取代的低聚糖胺聚糖及其制备方法，报道了3种解聚至重均分子量4.5kD-9kD的低聚同系糖胺聚糖混合物；所述解聚方法选自β-消除解聚法、脱酰脱氨基解聚法和过氧化解聚法。中国发明专利CN101735336A公开了一种制备低聚岩藻糖化糖胺聚糖的方法，在水相介质中催化剂存在下，催化过氧化物解聚岩藻糖化糖胺聚糖获得低聚岩藻糖化糖胺聚糖。过氧化解聚法所需反应条件要求较高，引入其他杂质，造成环境污染。
中国海洋大学王雪迎在其硕士学位论文《一种海洋硫酸多糖降解酶降解岩藻聚糖硫酸酯和糖胺聚糖的研究》中报道了利用岩藻聚糖硫酸酯酶研究其对糖胺聚糖的降解特性，发现该酶能够降解硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和透明质酸，而对硫酸软骨素B和肝素无降解效果；探究了该酶对硫酸软骨素类多糖的最适降解条件：温度30℃、pH值为8、缓冲液选用浓度为25mM的磷酸盐缓冲溶液。
但是现有技术中缺少一种能够对贝类糖胺聚糖高效解聚，提高其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，从而增强其降血糖活性的糖胺聚糖结构改性方法。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本发明的目的是提供增强降血糖活性的贝类糖胺聚糖及其结构改性方法和应用。该制备方法选用特异性的硫酸软骨素酶ABC，降低糖胺聚糖的分子量；并进一步通过酶解解聚工艺条件的优化，和特异性的硫酸软骨素酶ABC科学配合，获得了具有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，从而增强降血糖活性的低聚贝类糖胺聚糖。
为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明提供了增强降血糖活性的贝类糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：贝类糖胺聚糖采用酶解解聚的方法得到具有一定分子片段的低聚贝类糖胺聚糖；
进一步地，所述酶解解聚中，使用的酶为硫酸软骨素酶ABC。
进一步地，所述的贝类，为牡蛎、贻贝、缢蛏、花蛤中的至少一种。
进一步地，所述低聚贝类糖胺聚糖保留了糖胺聚糖的基本单元结构，所述低聚贝类糖胺聚糖的糖单元数量为5-11个。
进一步地，所述硫酸软骨素酶ABC的活力为0.2-1.5mU。
进一步地，所述硫酸软骨素酶ABC的活力为0.5mU。
进一步地，所述酶解解聚温度为25-30℃。
进一步地，所述酶解解聚温度为30℃。
进一步地，所述酶解解聚时间为3-5h。
进一步地，所述酶解解聚时间为4h。
进一步地，所述酶解液包含磷酸盐缓冲溶液。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.5-8.5。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为80-120mmol/L。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的添加量为贝类糖胺聚糖的24-36wt％。
在一些具体的实施方式中，贝类糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将贝类糖胺聚糖配制成样品溶液；
S2、将磷酸盐缓冲溶液和硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向步骤S1所述样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液进行酶解解聚，得到低聚贝类糖胺聚糖。
进一步地，步骤S3所述样品溶液和酶解液的质量比是1：0.0025-0.0075。
本发明还提供由上述贝类糖胺聚糖结构改性方法制备得到的低聚贝类糖胺聚糖。
进一步地，所述低聚贝类糖胺聚糖能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
本发明还提供所述的低聚贝类糖胺聚糖在制备降血糖功能食品、保健品或药品中的应用。
本发明还提供一种具有降血糖功能的产品，包含所述的低聚贝类糖胺聚糖。
糖胺聚糖是一种杂多糖，具有重复的二糖单位。而硫酸软骨素酶ABC是一类能够将糖胺聚糖降解为寡糖的裂解酶。此酶特异性地作用于二糖重复单元之间的α-1,4糖苷上并将其切断。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明选用具有特异性的硫酸软骨素酶ABC对贝类糖胺聚糖进行酶解解聚，提高了贝类糖胺聚糖的特异性酶解解聚效率，降低糖胺聚糖的分子量；
本发明进一步通过酶解解聚工艺条件的优化，和特异性的硫酸软骨素酶ABC科学配合，获得具有一定分子片段的低聚贝类糖胺聚糖，提高了贝类糖胺聚糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，从而增强其降血糖活性。
附图说明
图1为实施例1-6及对比例1-2的酶解解聚产物低聚贝类糖胺聚糖对应的分子量；
图2为口服淀粉后不同负荷时间对斑马鱼血糖水平的影响；
图3为阿卡波糖、贻贝糖胺聚糖、牡蛎糖胺聚糖、实施例1、实施例2及对比例2对斑马鱼血糖水平的影响，ns，表示无统计学差异(即p＞0.05)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
值得说明的是，如无特殊说明，本发明中使用的材料和试剂均为普通市售品，对其来源不做具体限定。本发明贝类糖胺聚糖的纯度为50％以上。
以下结合说明书附图和具体实施例来详细说明本发明。
基础实施例
实施例1
增强降血糖活性的贻贝糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将贻贝糖胺聚糖配制成2mg/mL的样品溶液；
S2、取200μL的100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)和50μL0.01U/mL的硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向100μL的样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液，水浴加热到30℃，酶解解聚反应4h，酶解解聚反应结束后，升温至80℃，并保持10min，使硫酸软骨素酶ABC灭活，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到低聚贻贝糖胺聚糖产物。
步骤S2所述的硫酸软骨素酶ABC的酶活力为0.5mU。
由上述方法制备得到的低聚贻贝糖胺聚糖。
实施例2
增强降血糖活性的牡蛎糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将牡蛎糖胺聚糖配制成2mg/mL的样品溶液；
S2、取200μL的100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)和50μL0.01U/mL的硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向100μL的样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液，水浴加热到30℃，解聚解聚反应4h，解聚解聚反应结束后，升温至80℃，并保持10min，使硫酸软骨素酶ABC灭活，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到低聚牡蛎糖胺聚糖产物。
步骤S2所述的硫酸软骨素酶ABC的酶活力为0.5mU。
实施例3
增强降血糖活性的贻贝糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将贻贝糖胺聚糖配制成2mg/mL的样品溶液；
S2、取200μL的100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.5)和150μL0.01U/mL的硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向100μL的样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液，水浴加热到25℃，酶解解聚反应3h，酶解解聚反应结束后，升温至80℃，并保持10min，使硫酸软骨素酶ABC灭活，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到低聚贻贝糖胺聚糖产物。
步骤S2所述的硫酸软骨素酶ABC的酶活力为1.5mU。
由上述方法制备得到的低聚贻贝糖胺聚糖。
实施例4
增强降血糖活性的牡蛎糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将牡蛎糖胺聚糖配制成2mg/mL的样品溶液；
S2、取200μL的80mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.5)和20μL0.01U/mL的硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向100μL的样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液，水浴加热到30℃，酶解解聚反应5h，酶解解聚反应结束后，升温至80℃，并保持10min，使硫酸软骨素酶ABC灭活，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到低聚牡蛎糖胺聚糖产物。
步骤S2所述的硫酸软骨素酶ABC的酶活力为0.2mU。
由上述方法制备得到的低聚牡蛎糖胺聚糖。
实施例5
增强降血糖活性的牡蛎糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将牡蛎糖胺聚糖配制成2mg/mL的样品溶液；
S2、取200μL的120mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.5)和50μL0.01U/mL的硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向100μL的样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液，水浴加热到30℃，酶解解聚反应4h，酶解解聚反应结束后，升温至80℃，并保持10min，使硫酸软骨素酶ABC灭活，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到低聚牡蛎糖胺聚糖产物。
步骤S2所述的硫酸软骨素酶ABC的酶活力为0.5mU。
由上述方法制备得到的低聚牡蛎糖胺聚糖。
实施例6
增强降血糖活性的牡蛎糖胺聚糖结构改性方法，包括以下步骤：
S1、将牡蛎糖胺聚糖配制成2mg/mL的样品溶液；
S2、取200μL的100mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)和100μL0.01U/mL的硫酸软骨素酶ABC混合，得到酶解液；
S3、向100μL的样品溶液中加入步骤S2所述的酶解液，水浴加热到30℃，酶解解聚反应4h，酶解解聚反应结束后，升温至80℃，并保持10min，使硫酸软骨素酶ABC灭活，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到低聚牡蛎糖胺聚糖产物。
步骤S2所述的硫酸软骨素酶ABC的酶活力为1mU。
由上述方法制备得到的低聚牡蛎糖胺聚糖。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于，酶解解聚反应中使用的酶种类不同，具体地，使用的酶为岩藻聚糖硫酸酯酶。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，酶解解聚反应中使用的酶种类不同，具体地，使用的酶为CS-E抗性的糖胺聚糖裂解酶(HCLase Er)，来源山东大学博士学位论文，彭春娥，一种硫酸软骨素E降解抗性的糖胺聚糖裂解酶的鉴定与应用。
效果性能试验
1.试验方法
1.1酶解解聚程度
糖胺聚糖产生的寡糖在紫外232nm处有特征吸收，将实施例1-6及对比例1-2的低聚贝类糖胺聚糖用232nm的紫外吸收定量分析酶解解聚程度，结果见表2。
1.2低聚贝类糖胺聚糖的分子量测定
利用Akta蛋白纯化仪进行样品测定。
检测条件：色谱柱：TSK gel G4000PWXL；检测器：RID示差检测器；柱温：30℃；流动相：纯水；进样量：10μL、检测时间30min、流速0.5mL/min。
相对分子质量标准曲线绘制：准确称取葡聚糖系列标准品5mg，纯水溶解配制为5mg/mL的标准品溶液，经0.45μm滤膜后按照相对分子质量小到大依次进样。根据各标准品检测保留时间和标准品对数相对分子质量，绘制相对分子质量标准曲线y＝-0.713x+11.708(R2＝0.9927)。
分别准确称取实施例1-6和对比例1-2的低聚贝类糖胺聚糖5mg，纯水溶解配制为5mg/mL的样品溶液，取5mg/mL的样品溶液代替标准品测出峰时间，根据标准曲线计算样品的相对分子质量；并根据样品色谱图出峰数目及峰形判断糖胺聚糖的纯度。
1.3低聚贝类糖胺聚糖α-葡萄糖苷酶活性抑制研究
分别取对照品阿卡波糖、贻贝糖胺聚糖、牡蛎糖胺聚糖、实施例1-6、对比例1-2一定量的贝类糖胺聚糖，用0.1mol/L PBS缓冲溶液(pH6.8)配制成不同浓度的溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)，分别取上述不同浓度的样品溶液50μL于96孔中，加入50μL 5.0mmol/L4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(PNPG)均匀后37℃下孵育10min，再加入100μL 0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，于酶标板恒温37℃孵育20min。以PBS缓冲溶液(pH6.8)代替糖胺聚糖溶液作为空白组，PBS缓冲溶液代替α-葡萄糖苷酶为样品对照组，于405nm波长处测定吸光度值，分别为A样品、A空白和A样品对照。以阿卡波糖作为阳性对照，用同样方法测定阿卡波糖为样品的吸光度值。通过以下公式计算样品与阿卡波糖的抑制率。
1.4低聚贝类糖胺聚糖对斑马鱼降血糖活性研究
1.4.1口服淀粉耐量试验(OSTT)
对斑马鱼进行淀粉负荷实验，考察碳水化合物负荷情况下斑马鱼血糖水平。将成年斑马鱼随机分组，设置为不同时间的诱导处理组(0、15、30、60min)，考察碳水化合物负荷后不同时间点斑马鱼血糖水平变化情况；每组5尾。观察斑马鱼体征，测定葡萄糖(Glc)含量。
1.4.2贝类糖胺聚糖降糖作用评价
将雌雄对半的成年斑马鱼随机分组，设置为不同的药物处理组：阿卡波糖阳性对照组、贻贝糖胺聚糖药物处理组、牡蛎糖胺聚糖药物处理组、实施例1药物处理组、实施例2药物处理组、对比例2处理组；其中药物处理组设置为不同浓度的样品溶液(低浓度、中浓度、高浓度)，每组与碳水化合物共同喂养30min，测定Glc含量、计算降糖率。药物处理组浓度设置具体表1所示。
血糖检测：采用葡萄糖含量检测试剂盒测定各实验组斑马鱼的葡萄糖含量。每个实验组取5尾成年斑马鱼，断尾取血5μL，经生理盐水稀释至20μL按照试剂盒测定Glc浓度，计算降糖率。公式如下：
式中：C模型组，口服淀粉耐量30min的血糖浓度；C药物处理组，给药30min的血糖浓度。
表1药物处理组的浓度设置
注：上述总喂食重量是一条鱼的进食量。样品配置成溶液后与淀粉及饲料混匀并烘干喂养。
2.试验结果
2.1酶解解聚程度
糖胺聚糖产生的寡糖在紫外232nm处有特征吸收，将实施例1-6及对比例1-2的低聚贝类糖胺聚糖用232nm的紫外吸收定量分析酶解解聚程度，结果见表2。由表2数据可知，实施例1-6的OD值在0.180-0.223之间，高于对比例1-2的OD值0.158-0.171，可见实施例1-6的酶解解聚程度比对比例1-2更大。
表2低聚贝类糖胺聚糖酶解解聚程度。
2.2低聚贝类糖胺聚糖的分子量
酶解解聚产物低聚贝类糖胺聚糖对应的分子量如图1所示。根据各标准品检测保留时间和标准品对数相对分子质量，绘制相对分子质量标准曲线y＝-0.713x+11.708(R2＝0.9927)，并根据标准曲线，求得降解产物的相对分子质量。实施例1-6酶解解聚产物低聚贝类糖胺聚糖呈现的吸收峰的保留时间分别为11.70、11.45、11.37、11.42、11.46和11.38，相对分子质量在2500-3500Da范围内，且酶解解聚产物的峰型均一、对称，说明降解反应完全，效果好，可用于小分子产物的活性研究。而对比例1-2酶解解聚产物低聚贝类糖胺聚糖的相对分子质量在6000-9000Da范围内，峰型不均一，缺乏对称性，酶解解聚效率不高，产物分子量大。
2.3低聚贝类糖胺聚糖体外α-葡萄糖苷酶活性抑制效果
通过对不同贝类糖胺聚糖在不同酶解解聚条件进行酶解解聚，获得实施例1-6和对比例1-2的酶解解聚产物，并考察其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，进一步确定具有良好降血糖活性的贝类糖胺聚糖。
不同样品对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究，如表3所示。样品浓度在0.1-1.0mg/mL范围内，不同样品浓度抑制率趋势变化不同，如贻贝糖胺聚糖，在0.6mg/mL抑制率达到最大值后，随着浓度的增加，抑制率逐渐降低，而酶解解聚后的样品实施例1、实施例3，对α-葡萄糖苷酶的抑制率呈现量效关系，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力随低聚贝类糖胺聚糖浓度的增加而增强；且酶解解聚前后糖胺聚糖对α-葡萄糖苷酶的抑制效果差异显著。
不同样品对应的IC50值如表3所示，贻贝糖胺聚糖和牡蛎糖胺聚糖对α-葡萄糖苷酶的IC50值分别为0.42、0.28mg/mL，实施例1-6对α-葡萄糖苷酶的抑制效果更加明显，其IC50值分别为0.34、0.14、0.26、0.28、0.22和0.24mg/mL。对比例1和对比例2对α-葡萄糖苷酶的抑制效果弱于牡蛎糖胺聚糖和贻贝糖胺聚糖，其IC50值分别为0.51、0.46mg/mL。实施例贝类糖胺聚糖酶解解聚产物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力强于贝类糖胺聚糖组分。对比例对α-葡萄糖苷酶的抑制能力明显不如实施例。本专利优化建立的贝类糖胺聚糖改性工艺稳定可行，相比于贝类糖胺聚糖，低聚糖胺聚糖物质能够更有效地抑制α-葡萄糖苷酶，从而增强降血糖功效；可应用于贝类生物活性物质的综合提取中。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究结果表明，糖胺聚糖是天然杂多糖，其生物活性与其溶解性、空间构型、取代基、纯度等因素密切相关，经改性后的实施例对α-葡萄糖苷酶的抑制效果有明显提高，这得益于硫酸软骨素酶ABC的特异性酶解解聚。因此，将贝类糖胺聚糖组分经降解可作为具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性、良好降血糖活性的改性贝类糖胺聚糖。
表3贝类糖胺聚糖对α-葡萄糖苷酶抑制效果
注：不同小写字母表示差异显著，p＜0.05。
2.4贝类糖胺聚糖对斑马鱼体内降血糖研究
2.4.1口服淀粉耐量试验(OSTT)
口服淀粉耐量试验和口服葡萄糖耐量试验是临床实践中广泛应用于糖尿病的确诊试验。OSTT是一种淀粉负荷试验，用以评估机体调节血糖的能力。图2显示了不同负荷时间对斑马鱼血糖水平的结果。在给药进行口服淀粉耐量试验前，斑马鱼经过禁食12h处理(不禁水)，可以得到：斑马鱼在口服淀粉30min后，血糖快速上升至0.320mmol/L，随着时间延长逐渐下降，计算得出淀粉负荷30min时升糖率为154.34％。因此，选择负荷时间为30min时，斑马鱼血糖达到峰值。
2.4.2贝类糖胺聚糖对斑马鱼血糖水平的影响
贝类糖胺聚糖对斑马鱼血糖水平的影响如图3所示，高剂量组中，各样品均能显著降低斑马鱼淀粉负荷30min的血糖值，对比例2对斑马鱼血糖水平的影响与酶解解聚前样品降糖率相当，而实施例1和实施例2对斑马鱼血糖水平的影响与阳性对照阿卡波糖组效果相当(无显著性差异)。表明贝类糖胺聚糖、酶解解聚产物低聚贝类糖胺聚糖和对比例2均能够提高口服淀粉负荷时斑马鱼耐受能力，其中实施例1和实施例2的低聚贝类糖胺聚糖提高口服淀粉负荷时斑马鱼耐受能力更显著。
低聚贝类糖胺聚糖，降低斑马鱼血糖水平的效果更加显著，揭示了其在制备降血糖功能食品、保健食品或药品中的应用前景，为制备治疗降血糖功能食品、保健食品或药品提供了一种新的参考。
以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.增强降血糖活性的贝类糖胺聚糖结构改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
贝类糖胺聚糖采用酶解解聚的方法得到低聚贝类糖胺聚糖；
所述酶解解聚中，使用的酶为硫酸软骨素酶ABC；
所述的贝类，为牡蛎、贻贝、缢蛏、花蛤中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法，其特征在于，所述低聚贝类糖胺聚糖保留了糖胺聚糖的基本单元结构，所述低聚贝类糖胺聚糖的糖单元数量为5-11个。
3.根据权利要求1所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法，其特征在于，所述硫酸软骨素酶ABC的活力为0.2mU-1.5mU。
4.根据权利要求1所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法，其特征在于，所述酶解解聚的温度为25-30℃；所述酶解解聚的时间为3-5h。
5.根据权利要求1所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法，其特征在于，
所述酶解解聚中，酶解液还包含磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.5-8.5；所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为80-120mmol/L。
6.根据权利要求1所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的添加量为贝类糖胺聚糖的24-36wt％。
7.权利要求1-6任一项所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法制备得到的低聚贝类糖胺聚糖。
8.根据权利要求7所述的低聚贝类糖胺聚糖，其特征在于，所述的低聚贝类糖胺聚糖能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性。
9.权利要求1-6任一项所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法制备得到的低聚贝类糖胺聚糖或权利要求7所述的低聚贝类糖胺聚糖在制备降血糖功能食品、保健食品或药品中的应用。
10.一种具有降血糖功能的产品，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的贝类糖胺聚糖结构改性方法制备得到的低聚贝类糖胺聚糖或权利要求7所述的低聚贝类糖胺聚糖。
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2023
- 2023-12-04 CN CN202311657745.0A patent/CN117660571A/zh active Pending
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