CN117660497A - 调控高粱直链和支链淀粉含量的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控高粱直链和支链淀粉含量与结构的基因及其应用，所述的淀粉分支酶为GBSSⅠ。将GBSSⅠ基因过表达和敲除，应用于淀粉合成和/或淀粉改性，探明GBSSⅠ基因的重组载体，应用于不同直链和支链淀粉比例淀粉的合成。同时也公开了GBSSⅠ基因的重组载体在淀粉凝胶特性、淀粉抗老化特性或消化特性等优化中的应用，以及在调控高粱淀粉中直链淀粉和支链淀粉链长分布上的应用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控高粱直链和支链淀粉含量与结构的基因及其应用。
背景技术
高粱是一种重要的谷物，具有抗旱性和相对较低的投入成本。就数量和重要性而言，高粱在全球谷物中排名第五。淀粉是谷物高粱的主要成分，占谷物干重的70％。淀粉的许多重要物理化学、热力学和流变学性质都受到淀粉颗粒中两种主要聚合物直链淀粉和支链淀粉的比例以及支链淀粉结构的影响。直链淀粉含量对淀粉的糊化和凝沉、糊粘度、凝胶化和淀粉酶消化率的影响有决定性作用。支链淀粉的精细结构(链长分布)也影响淀粉的糊化和凝沉特性。
高粱籽粒直链淀粉含量取决于隐性基因waxy(wx)的剂量。糯性高粱的胚乳含有三个隐性糯性基因(wxwxwx)，其直链淀粉含量为0％，异糯性高粱胚乳含有至少一个隐性基因(WxWxwx或Wxwxwx)，其直链淀粉含量为14％，正常高粱的胚乳不含隐性基因(WxWxWx)，其直链淀粉含量为23.7％。蜡质高粱在挤压过程中表现出优异的膨胀性。与异糯性和普通高粱杂交种相比，糯性高粱杂交种可能具有较差的农艺特性，如产量低、幼苗活力差、籽粒密度略低等。与糯性和正常高粱淀粉相比，异糯性高粱淀粉具有中等的直链淀粉含量，并且具有与糯性淀粉相似的支链淀粉链长分布。和蜡质淀粉一样，异蜡质淀粉的糊化温度降低，峰值粘度增加。冷却后，10％的异蜡淀粉糊是软凝胶，而普通淀粉混合物产生硬凝胶。应力松弛结果表明，煮熟和冷却的异糯高粱淀粉(10％固体)具有与煮熟的正常高粱淀粉相当的粘弹性凝胶类型的特性，而煮熟的糯性高粱淀粉表现为粘弹性液体，没有广泛的分子间纠缠或分子间交联。异蜡质淀粉的快消化淀粉含量显著低于蜡质淀粉，抗性淀粉含量显著高于蜡质淀粉。当包含在低血糖反应或低血糖反应降低的食物中时，异蜡淀粉的低消化率可能是可取的。高粱异蜡淀粉可以进行化学改性，以获得独特的流变特性。需要进一步的育种工作来开发具有低直链淀粉含量(5-10％)和不同链长分布支链淀粉的高粱淀粉，这可以提供独特的流变特性、提高冷藏稳定性或增加抗性淀粉和慢消化淀粉的含量。本研究通过调控waxy基因定向生成了一系列直链与支链淀粉含量比例的高粱淀粉，为高粱淀粉在各行业中的精准应用提供了理论基础。
发明内容
针对现阶段对不同直链淀粉含量的淀粉类型的需求，本发明提供了一种调控高粱直链淀粉含量和支链淀粉侧链结构的基因及其应用，然后根据淀粉的理化特性，将其应用于各行业，获得很好的效果。
本发明的技术方案如下：
本发明公开了一种高粱来源的淀粉合酶，所述的淀粉分支酶为GBSSⅠ，GBSSⅠ基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述的GBSSⅠ基因全长为4314bp，编码区为1827bp，编码609个氨基酸。
本发明同时公开了包含原始载体和上述所述的高粱来源的淀粉合酶的基因。
进一步地，所述原始载体为pCAMBIA1301载体质粒；GBSSⅠ-Sobic.010G022600编码区所示核苷酸序列位于pCAMBIA1301载体质粒的BsaI和Eco31I两限制性内切酶位点之间；rDNAT1编码区所示核苷酸序列位于pCAMBIA1301载体质粒的BsaI和Eco31I两限制性内切酶位点之间。
本发明还公开了GBSSⅠ基因的重组载体，以大肠杆菌pET28a为宿主菌，转入上述所述的GBSSⅠ过表达和敲除重组载体。
本发明进一步公开了GBSSⅠ基因的重组载体在淀粉合成和/或淀粉改性方面的应用。
进一步地，探明GBSSⅠ基因的重组载体，应用于不同直链和支链淀粉比例淀粉的合成。
进一步地，GBSSⅠ基因的重组载体在淀粉凝胶特性、淀粉抗老化特性或消化特性等优化中的应用。
本发明也公开了GBSSⅠ基因的重组载体在调控高粱淀粉中直链淀粉和支链淀粉链长分布上的应用。
本发明的有益效果
对照组高粱淀粉直链淀粉含量为25.0％，与对照组相比，GBSSⅠ敲除高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量显著下降，且高粱植株之间波动较大，1.1％-3.5％，属于蜡质高粱淀粉。然而，GBSSⅠ过表达高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量显著提高，为33.3％-45.1％，属于高直链淀粉。与对照组高粱支链淀粉链长分布相比，GBSSⅠ敲除高粱植株淀粉的A链含量显著增加，B链含量和平均链长显著降低；GBSSⅠ过表达高粱植株淀粉的A链含量显著降低，且B链含量显著提高。此外，与对照组相比，GBSSⅠ敲除高粱植株淀粉的糊化黏度显著提高，GBSSⅠ过表达高粱植株淀粉的糊化黏度显著降低。敲除处理获取的蜡质高粱淀粉的水解率显著高于对照组，说明直链淀粉含量的减少或支链淀粉含量的增加降低了淀粉对水解酶的抗性；然而，过表达处理获取的高直链淀粉含量高粱淀粉的水解率显著低于对照组。
附图说明
图1为敲除和过表达颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ载体的构建；a：敲除载体；b：过表达载体；
图2为敲除和过表达颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ基因高粱植株T0和T1代；a：T0；b：T1；
图3为转基因与对照组高粱中颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ基因表达量及对应酶活性分析；(a)：酶活性；(b)基因表达量；
图4为转基因高粱淀粉的直链淀粉含量；
图5为敲除和过表达颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ基因高粱植株淀粉的微观结构；(a)对照；(b)GBSSⅠ过表达；(c)GBSSⅠ敲除；
图6为敲除和过表达颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ基因高粱植株淀粉的黏度变化曲线；
图7为敲除和过表达颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ基因高粱植株淀粉水解曲线。
具体实施方式
实验方法
1.1植株受体、质粒和菌体
同时含有Kana(卡那霉素)和Bar(抗除草剂)特性的过表达与敲除质粒和遗传转化载体(大肠杆菌感受态：pCAMBIA1301)均是由武汉伯远生物科技有限公司完成。
1.2高粱农杆菌介导遗传转化
选择质粒稳定遗传的农杆菌菌株用于后续高粱遗传转化实验。以野生型Wheatland高粱作为受体材料制备转基因植株。严格挑选植株长势旺盛的高粱开花12dth的高粱幼胚，先后用70％的乙醇溶液和0.1％的氯化汞溶液灭菌，之后用无菌水清洗5遍以去除胚乳表面残留的溶液。通过组织培养诱导分化出愈伤组织，黄化胚芽长至3-4cm时(避光生长)取出，用解剖刀在距黄化苗节结的上方2-3mm处环切芽銷和其内的幼叶，剥露出芽尖。再用解剖刀纵切芽尖，劈开生长点。处理过后的芽尖按相同方向至于培养皿中用于后续步骤。将摇好的农杆菌液导入预备好的培养皿中，浸泡上述被劈开的幼苗芽20min。洗净残余菌液，室温下暗培养至幼苗长出幼叶，PCR筛选出阳性植株，将存活的幼苗转移至土壤中培养获取T1代种子。
种植T1代高粱，生长至3叶期用PCR检测。将PCR阳性的高粱幼苗移栽到土壤，套袋自交，获得T2代高粱种子，转基因性状将会在T2代高粱淀粉中被体现。
1.3转基因高粱淀粉的理化特性
湿磨法提取T2代高粱种子中的淀粉，通过分析直链淀粉含量、颗粒微观结构、链长分布、热特性分析、糊化特性和体外模拟消化等明确GBSSⅠ基因敲除和过表达对高粱淀粉结构及理化特性的影响。
(1)直链淀粉含量的测定
UDMSO溶液的配制：10％(v/v)6M尿素与90％DMSO混合均匀；碘-碘化钾溶液：精准称取0.20g碘和2.00g碘化钾，将其混合并用去离子水定容至100mL(避光保存)。20.00mg淀粉样品溶解于8mL UDMSO溶液，漩涡搅拌2min。水浴加热，85℃30min，冷却后，用去离子水定容至25mL。取3mL定容后的混合溶液，加1mL碘-碘化钾溶液并用去离子水定容至50mL，室温水浴15min后，测定530nm波束下的吸光度，根据吸光度的变化计算出直链淀粉含量。
(2)淀粉颗粒微观结构分析
高粱淀粉颗粒的尺寸、形态和表面形貌均可以通过SEM观察。样品用双面粘性碳带固定，涂有Au/Pd，并用5kV的加速电压测量，放大倍数为1000，2000，2500，5000和8000x。
(3)链长分布分析
①溶液配制：A液为150mM NaOH：50％12.00g色谱纯NaOH溶于1L纯净水；B液：12.00g，50％NaOH溶液与41.00g乙酸钠混合并用纯净水定容至1L；配制90％DMSO溶液100mL；50mM乙酸钠缓冲溶液：0.30g/100mL冰乙酸与0.41g/100mL乙酸钠混合调至pH4.0。②样品前处理：10.00mg淀粉样品和4mL，90％DMSO溶液混合，沸水浴搅拌20min，加入6mL无水乙醇，3000r，离心15min。弃去上清液，加入2mL，50mM乙酸钠缓冲溶液(pH4.0)，沸水浴20min，之后在40℃平衡10min，加入10μL异淀粉酶，40℃，150r，放置24h，之后煮沸10min灭酶。取样1mL溶液，并用150mM NaOH稀释至5mL，过滤膜后注入机器。
(4)热特性分析
使用差示扫描量热法测定样品的热特性。准确称取3.00mg淀粉样品于坩埚底部，加入9μL去离子水，盖上坩埚盖，压合密封，常温下放置平衡24h。测定程序温度设置为：20-150℃，10℃/min。
(5)糊化特性分析
将2.50g高粱淀粉分散于25.50g去离子水中。程序设置：50℃保持1min，7.5min内加热至95℃，并在95℃下保持2min。然后在7min内冷却至50℃，并在50℃条件下保持2min。在整个过程中，离心机转速保持在160rpm。
(6)体外模拟消化特性分析
80.00mg淀粉样品与10mL 250U/mL唾液α-淀粉酶(碳酸盐缓冲溶液(pH7.0))混合5min。然后加入pH2.0的盐酸溶液，将溶液pH降至3.8，并加入65mL1mg/mL胃蛋白酶溶液反应30min。用0.02M氢氧化钠中和后，加入0.2M，pH6.0的乙酸钠缓冲溶液和α-淀粉酶混合，反应特定时间，记录溶液中的葡萄糖含量。
实施例1质粒的合成与载体的构建
通过Phytozome 13获取GBSSⅠ基因的编码区(CDS sequence)和肽序列，委托武汉伯远生物科技有限公司合成质粒。
具体结果见序列1，从序列1可以得出：所述的GBSSⅠ基因全长为4314bp，编码区为1827bp(加粗及下划线)，编码609个氨基酸，编码区共40个独一6+酶切位点。
基因序列：
实施例2PCR测定
获取的50株敲除GBSSⅠ基因高粱T0代籽粒全为阳性植株，阳性率为100％；同样过表达转基因植株的阳性率也为100％。实验证明，通过幼胚遗传转化法，经除草剂筛选和PCR检测，成功获取了敲除和过表达GBSSⅠT0代高粱植株。种植T0获取T1代高粱种子，敲除和过表达的T1代各种植50株。同样通过PCR检测，选取T1代的阳性植株，如图2所示。
实施例3转基因高粱籽粒胚乳中GBSSⅠ基因表达量及其酶活性分析
发育19天敲除、过表达GBSSⅠ基因和对照组高粱籽粒胚乳中GBSSⅠ基因的表达量及对应酶的活性如图3所示。由图3a可知，GBSSⅠ基因敲除高粱籽粒中该酶活性为98U/g，显著低于对照组样本的600U/g。相反，GBSSⅠ基因过表达高粱籽粒中该酶活性为950U/g，显著高于对照组样本。高粱籽粒中GBSSⅠ基因的表达量顺序依次为：过表达样本>对照组>敲除样本，其中，过表达样本中该基因的表达量是对照组的4倍，而敲除样本中该基因无表达量。这一结果表明通过遗传转化的手段成功调控了GBSSⅠ基因在高粱籽粒中的表达。
实施例4转基因高粱淀粉的直链淀粉含量变化
取成熟对照组和实验组各10株，将每一株籽粒清洗干净后用于淀粉提取，获取转基因高粱淀粉。通过比较各类对照组和实验组的每一株高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量发现：对照组高粱植株所产的淀粉无显著差异，25.1％-25.7％；与对照组相比，GBSSⅠ敲除高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量显著下降，且高粱植株之间波动较大，1.1％-3.5％，属于蜡质高粱淀粉。然而，GBSSⅠ过表达高粱籽粒淀粉中直链淀粉含量显著提高，为33.3％-45.1％，属于高直链淀粉。该结果证明GBSSⅠ的表达量对直链淀粉的合成起决定性作用。挑选直链淀粉含量为2％和40％的转基因高粱淀粉作为研究对象分析其理化特性的差异。
实施例5转基因高粱淀粉的链长分布分析
表1颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ敲除和过表达转基因高粱淀粉的链长分布
*每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)。
与对照组Wheatland高粱支链淀粉链长分布相比，GBSSⅠ敲除高粱植株淀粉的A链含量显著增加，B链含量和平均链长显著降低，提高了淀粉的分支度；GBSSⅠ过表达高粱植株淀粉的A链含量显著降低，且B链含量显著提高，平均链长值也被提高。GBSSⅠ敲除高粱淀粉中不同聚合度B链含量减少的原因可能是GBSSⅠ基因的敲除直接减少了B1链的合成，同时减少了B2和B3链的底物含量，该类淀粉糊化后不易老化；而GBSSⅠ基因过表达高粱淀粉中B链含量增加的原因归因于GBSSⅠ酶加速了A链延长成为B1链的速度，间接增加了B2和B3链的底物含量。该结论与转录组判断的GBSSⅠ基因的功能相一致。
实施例6转基因高粱淀粉的热特性分析
表2颗粒结合型淀粉合酶Ⅰ敲除和过表达转基因高粱淀粉的热力学特性
*每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)。
与对照组相比，GBSSⅠ敲除高粱植株淀粉的To值降低；不同地是，GBSSⅠ过表达高粱植株淀粉的To值和焓值均显著降低。经分析发现：淀粉的Tp值与直链淀粉含量成显著正相关，GBSSⅠ-knockout<Wheatland<GBSSⅠ-Overexpression。虽然GBSSⅠ敲除降低了高粱植株淀粉的直链淀粉含量，但是其支链淀粉中A+B1链含量增加，特别是A链含量，意味着淀粉颗粒内部双螺旋结构含量增加，即增强了淀粉颗粒的热力学抗性。此外，GBSSⅠ过表达高粱植株淀粉糊化焓值低于敲除高粱植株来源淀粉的原因是40％直链淀粉含量属于高直链类型淀粉，其糊化温度高、范围宽且并不能被完全糊化，因此，6.12J/g并不是高直链淀粉被完全糊化时的吸收焓，仅代表部分糊化。
实施例7转基因高粱淀粉的微观结构分析
通过分析图5可知，与对照组样本相比，GBSSⅠ过表达高粱籽粒中的淀粉颗粒表面更光滑，形态饱满。部分转基因株系表现出百粒重明显提高。GBSSⅠ基因敲除高粱籽粒中淀粉颗粒形状变化显著：颗粒形状不规则，大小不均一，多为畸形，小尺寸淀粉颗粒数量增加。
实施例8转基因高粱淀粉糊化过程的黏度分析
通过分析图6可知，淀粉糊化过程峰值黏度与直链淀粉含量密切相关，普通高粱淀粉的峰值黏度为2318cP，直链淀粉含量2％左右的GBSSⅠ敲除高粱植株淀粉的峰值黏度最高为3245cP，而直链淀粉含量最高的GBSSⅠ过表达高粱植株淀粉的峰值黏度最低且为895cP，经快速黏度分析仪加热处理之后的转基因高直链高粱淀粉仍为悬浊液，说明高直链高粱淀粉未被完全糊化。
实施例9转基因高粱淀粉的消化性分析
由图7可知，转基因获取的蜡质高粱淀粉的水解率显著高于对照组，说明直链淀粉含量的减少或支链淀粉含量的增加降低了淀粉对水解酶的抗性；然而，高直链淀粉含量高粱淀粉的水解率显著低于对照组，归因于直链淀粉的分子结构较为稳定，分子间结合力较强，直链淀粉含量越高对支链淀粉的保护作用就越强，即越不易被外界破坏。
Claims (9)
1.一种高粱来源的淀粉合酶，其特征在于，所述的淀粉合酶为GBSSⅠ，GBSSⅠ基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种高粱来源的淀粉合酶，其特征在于，所述的GBSSⅠ基因全长为4314bp，编码区为1827bp，编码609个氨基酸。
3.一种包含原始载体和权利要求1所述的高粱来源的淀粉合酶的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA1301载体质粒；GBSSⅠ-Sobic.010G022600编码区所示核苷酸序列位于pCAMBIA1301载体质粒的BsaI和Eco31I两限制性内切酶位点之间；rDNAT1编码区所示核苷酸序列位于pCAMBIA1301载体质粒的BsaI和Eco31I两限制性内切酶位点之间。
5.一种GBSSⅠ基因的重组载体，其特征在于，以大肠杆菌pET28a为宿主菌，转入权利要求1-2任一项所述的GBSSⅠ过表达和敲除重组载体。
6.一种权利要求5所述的GBSSⅠ基因的重组载体在淀粉合成和/或淀粉改性方面的应用。
7.一种权利要求5所述的GBSSⅠ基因的重组载体，应用于不同直链和支链淀粉比例淀粉的合成。
8.一种权利要求5所述的GBSSⅠ基因的重组载体，在淀粉凝胶特性、淀粉抗老化特性或消化特性优化中的应用。
9.一种权利要求5所述的GBSSⅠ基因的重组载体，在调控高粱淀粉中直链淀粉和支链淀粉链长分布上的应用。
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