CN117660386A - 一种合成(S)-autumnaline及其衍生物的方法及全细胞催化体系的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成(S)‑autumnaline及其衍生物的方法及全细胞催化体系的构建,本发明利用人工设计的多酶级联反应高效合成了(S)‑autumnaline及其衍生物。同时,以敲除了yqhD,yahK、yjgB、dkgB,yeaE、dkgA和yqhC的大肠杆菌BL21(DE3)为底盘细胞,得到工程菌株IAA。将合成路线的酶分别构建到IAA中,得到IAA1,IAA2和IAA3,利用上述菌株合成(S)‑autumnaline及其衍生物。(S)‑autumnaline的合成放大结果产量为709.06mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成(S)-autumnaline及其衍生物的方法及全细胞催化体系的构建,属于生物工程技术领域。
背景技术
秋水仙碱是从秋水仙属植物中提取的一种天然生物碱,已经被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗急性痛风和家族性地中海热。此外,秋水仙碱还被用来治疗心包炎等疾病。
(S)-autumnaline是一种重要的苯乙基异喹啉生物碱,是秋水仙碱合成路径的关键中间体。当前,(S)-autumnaline及秋水仙碱的获取主要通过从百合科植物中提取。但是,(S)-autumnaline的产量受到植物生长周期长,生长条件苛刻,含量低等条件的影响。同时,(S)-autumnaline的提取工艺复杂,需要消耗大量的有机溶剂,且无法得到高纯度的产品。
目前,主要利用化学合成法生产(S)-autumnaline及其衍生物。以4-(2-氨基乙基)-2-甲氧基苯酚和肉桂醛衍生物为底物,经过Pictet-Spengler反应、氮甲基化、氢气还原反应得到外消旋产物,然后再通过晶体学方法实现了手性拆分。但是这种方法收率较低,能耗大,同时会污染环境,且底物昂贵,不易获得,不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物酶法制备(S)-autumnaline及其衍生物具有产品质量稳定安全,工艺条件温和、高效、环保等特点,可以减轻环境和资源压力。但是,在现有的(S)-autumnaline的生物合成研究中,仅有文献(Discovery and engineering of colchicine alkaloidbiosynthesis)解析了(S)-autumnaline在嘉兰百合体内的合成路径。在嘉兰百合体内,苯丙氨酸通过氧化脱氨、还原、羟化反应生成一个前体4-羟基氢化肉桂醛。酪氨酸经过羟化、脱羧反应生成另外一个前体多巴胺。随后,4-羟基氢化肉桂醛和多巴胺在去甲乌药碱合酶的作用下形成苯乙基异喹啉骨架,再通过两步羟化和多步甲基化反应合成(S)-autumnaline。(S)-autumnaline原始合成路径步骤大于7步,且包括了一个P450酶催化的两步羟化反应。由于植物来源的P450酶在微生物中的表达极为困难,这严重阻碍了(S)-autumnaline在微生物中的异源合成,目前,未有研究报道(S)-autumnaline在微生物体内的合成。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明设计了一条以简单易得的苯丙酸衍生物和多巴胺为原料,利用多酶级联反应合成(S)-autumnaline及其衍生物的新路线(图1)。
大肠杆菌醇脱氢酶(yqhD、yahK、yjgB),醛酮还原酶(dkgB、yeaE、dkgA)和转录因子(yqhC)基因敲除及构建方法参考文献Kunjapur A M,Tarasova Y,Prather K LJ.Synthesis and Accumulation of Aromatic Aldehydes in an Engineered Strain ofEscherichia coli[J].Journal of the American Chemical Society,2014,136(33):11644-54。
本发明提供了一种重组细胞IAA1,所述重组细胞IAA1是在出发菌株的基础上表达了如下蛋白:羧酸还原酶、磷酸泛酸巯基乙胺转移酶和去甲乌药碱合酶;所述出发菌株为敲除了包括yqhD、yahK、yjgB、dkgB、yeaE、dkgA、和yqhC基因的大肠杆菌。
在一种实施方式中,所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中,所述羧酸还原酶(TpCAR)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述磷酸泛酸巯基乙胺转移酶(BsSfp)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述去甲乌药碱合酶(TfNCS)的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在一种实施方式中,用于所述过表达的载体包括但不限于pET系列质粒,或pRSFDuet-1质粒,优选为pRSFDuet-1。
本发明还提供了上述重组细胞IAA1在合成(S)-autumnaline或其衍生物中的应用。
在一种实施方式中,所述应用包括以下步骤:
(1)将重组细胞IAA1接种至培养基中,培养菌株至对数生长期,诱导,收集菌体;
(2)将步骤(1)所得重组细胞IAA1与底物混合反应;
所述底物包括苯丙酸衍生物和多巴胺。
在一种实施方式中,所述步骤(2)中反应含有1-10mM抗坏血酸盐,优选为抗坏血酸钠。
在一种实施方式中,所述步骤(1)包括:将重组细胞IAA1接种至LB培养基,20-40℃培养10-12h,转接至2YT培养基,20-40℃培养至OD600值达到0.6-0.8左右,降温至15-25℃,加入终浓度为0.05-0.5mM的IPTG诱导10-20h,收集菌体。
在一种实施方式中,所述反应的温度为20-40℃,所述反应的pH为7.5-8.5。
在一种实施方式中,所述反应的时间为4-8h,或所述反应的时间为不低于6h。
在一种实施方式中,所述苯丙酸衍生物的添加量为7.5-15mM;所述多巴胺添加量为5-10mM。
在一种实施方式中,所述重组细胞IAA1的添加量为20-30g/L。
本发明还提供了一种氧甲基转移酶突变体(GsOMT1),所述氧甲基转移酶突变体以氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氧甲基转移酶为亲本,进行了以下所述(a)-(d)一个或多个突变:
(a)将亲本第122位异亮氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或天冬氨酸;
(b)将亲本第125位缬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或天冬氨酸或组氨酸;
(c)将亲本第181位天冬酰胺突变为丙氨酸或谷氨酰胺;
(d)将亲本第310谷氨酸突变为缬氨酸或亮氨酸。
本发明还提供了编码上述氧甲基转移酶突变体的基因。
本发明还提供了携带所述氧甲基转移酶突变体基因,或氨基酸序列为SEQ IDNO.12所示氧甲基转移酶(RnCOMT)的基因的表达载体。
在一种实施方式中,所述表达载体以pRSFDuet质粒、pET系列质粒为载体;所述pET系列质粒包括但不限于pETDuet、pET-21b(+),优选为pETDuet-1。
本发明还提供了表达所述突变体,或所述基因,或携带上述表达载体的重组细胞。
在一种实施方式中,所述重组细胞为重组细胞IAA2,所述重组细胞IAA2以敲除了包括yqhD、yahK、yjgB、dkgB、yeaE、dkgA和yqhC基因的大肠杆菌为底盘细胞;所述大肠杆菌优选为Escherichia coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中,所述重组细胞IAA2过表达了氧甲基转移酶(RnCOMT或GsOMT1)、甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)和高半胱氨酸水解酶(SAHH)。
在一种实施方式中,所述氧甲基转移酶(RnCOMT)氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示,或所述氧甲基转移酶(GsOMT1)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示,或所述氧甲基转移酶(GsOMT1)为上述氧甲基转移酶突变体,或所述氧甲基转移酶(GsOMT1)的氨基酸序列如SEQID No.18所示;所述甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示;所述高半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了所述氧甲基转移酶(RnCOMT),或所述编码上述氧甲基转移酶突变体(GsOMT1)的基因,或所述重组细胞IAA2在合成(S)-autumnaline或其衍生物中的应用。
在一种实施方式中,所述应用包括以下步骤:
(1)细胞培养:将重组细胞IAA1、IAA2分别接种至培养基中,培养菌株至对数生长期,诱导,收集菌体;
(2)将步骤(1)所得重组细胞IAA1与底物混合反应,收集反应上清液;所述底物包括苯丙酸衍生物和多巴胺;
(3)将步骤(1)所得重组细胞IAA2与步骤(2)所得上清液混合,进行反应;
在一种实施方式中,所述步骤(2)中反应含有1-10mM抗坏血酸盐,优选为抗坏血酸钠。
在一种实施方式中,所述步骤(3)的反应体系中含有1-10mM多聚磷酸盐或ATP,和10-50mM L-甲硫氨酸,所述多聚磷酸盐优选为ATP的金属盐。
在一种实施方式中,所述步骤(1)包括:将重组细胞IAA1或IAA2接种至LB培养基,20-40℃培养10-12h,转接至2YT培养基,20-40℃培养至OD600值达到0.6-0.8左右,降温至15-25℃,加入终浓度为0.05-0.5mM的IPTG诱导10-20h,收集菌体。
在一种实施方式中,所述反应的温度为20-40℃,所述反应的pH为7.5-8.5。
在一种实施方式中,所述反应的时间为4-8h,或所述反应的时间为不低于6h。
在一种实施方式中,所述重组细胞IAA1的添加量为20-30g/L;所述重组细胞IAA2的添加量为30-120g/L,优选为30-40g/L,或优选为100-120g/L。
本发明还提供了一种氮甲基转移酶突变体,所述氮甲基转移酶突变体以氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氮甲基转移酶为亲本,进行了以下(a)-(c)所述一个或多个突变:
(a)将亲本第88位亮氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸或丝氨酸或缬氨酸;
(b)将亲本第92位天冬酰胺突变为丙氨酸或缬氨酸;
(c)将亲本第332位苯丙氨酸突变为丙氨酸或丝氨酸或缬氨酸。
在一种实施方式中,所述氮甲基转移酶突变体以氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氮甲基转移酶为亲本,将亲本第88位亮氨酸突变为缬氨酸,并将亲本第92位天冬酰胺突变为丙氨酸。
在一种实施方式中,所述氮甲基转移酶突变体以氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氮甲基转移酶为亲本,将亲本第88位亮氨酸突变为缬氨酸,并将亲本第332位苯丙氨酸突变为丙氨酸。
在一种实施方式中,所述氮甲基转移酶突变体以氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氮甲基转移酶为亲本,将亲本第92位天冬酰胺,第332位苯丙氨酸突变为丙氨酸。
在一种实施方式中,所述氮甲基转移酶突变体以氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氮甲基转移酶为亲本,将亲本第88位亮氨酸突变为缬氨酸,并将亲本第92位天冬酰胺,第332位苯丙氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供了编码上述氮甲基转移酶突变体的基因。
本发明还提供了携带所述氮甲基转移酶突变体的基因的表达载体。
在一种实施方式中,所述表达载体以pET系列质粒,或以pRSFDuet质粒为载体,所述pET系列质粒优选为pETDuet或pET-21b(+)。
本发明还提供了表达所述突变体,或所述基因,或携带上述表达载体的重组细胞。
在一种实施方式中,所述重组细胞为重组细胞IAA3,所述重组细胞IAA3为,以敲除了包括醇脱氢酶(yqhD、yahK、yjgB)、醛酮还原酶(dkgB、yeaE、dkgA)和转录因子(yqhC)的大肠杆菌为底盘细胞;所述大肠杆菌优选为Escherichia coli BL21(DE3)。
在一种实施方式中,所述重组细胞IAA3过表达了氮甲基转移酶(CNMT)、甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)和高半胱氨酸水解酶(SAHH)。
在一种实施方式中,所述过表达的载体优选为pETDuet-1载体。
在一种实施方式中,所述氮甲基转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,或所述氮甲基转移酶为上述氮甲基转移酶突变体;所述甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示;所述高半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了所述氮甲基转移酶突变体,或所述编码上述氮甲基转移酶突变体的基因,或所述重组细胞IAA3在合成(S)-autumnaline或其衍生物中的应用。
在一种实施方式中,所述应用包括以下步骤:
(1)细胞培养:将重组细胞IAA1、IAA2、IAA3分别接种至培养基中,培养菌株至对数生长期,诱导,收集菌体;
(2)将步骤(1)所得重组细胞IAA1与底物混合反应,收集反应上清液;所述底物包括苯丙酸衍生物和多巴胺;
(3)将步骤(1)所得重组细胞IAA2与步骤(2)所得上清液混合,进行反应,收集反应上清液;
(4)将步骤(1)所得重组细胞IAA3与步骤(3)所得上清液混合,进行反应,得到(S)-autumnaline或其衍生物。
在一种实施方式中,所述步骤(1)包括:将重组细胞IAA1或IAA2或IAA3接种至LB培养基,20-40℃培养10-12h,转接至2YT培养基,20-40℃培养至OD600值达到0.6-0.8左右,降温至15-25℃,加入终浓度为0.05-0.5mM的IPTG诱导10-20h,收集菌体。
在一种实施方式中,所述步骤(2)中反应含有1-10mM抗坏血酸盐,优选为抗坏血酸钠。
在一种实施方式中,所述步骤(3)的反应体系中含有1-10mM多聚磷酸盐或ATP,和10-50mM L-甲硫氨酸,所述多聚磷酸盐优选为ATP的金属盐。
在一种实施方式中,所述步骤(4)的反应体系中含有1-10mM多聚磷酸盐或ATP,所述多聚磷酸盐优选为ATP的金属盐。
在一种实施方式中,所述反应的温度为20-40℃,所述反应的pH为7.5-8.5。
在一种实施方式中,所述反应的时间为4-8h,或所述反应的时间为不低于6h。
在一种实施方式中,所述苯丙酸衍生物的添加量为7.5-15mM;所述多巴胺添加量为5-10mM。
在一种实施方式中,所述重组细胞IAA1的添加量为20-30g/L;所述重组细胞IAA2的添加量为30-120g/L,优选为30-40g/L,或优选为100-120g/L;所述重组细胞IAA3的30-40g/L。
本发明还提供了一种以一锅两步法实现酶级联反应合成(S)-autumnaline或其衍生物的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)第一步反应:反应体系包括:羧酸还原酶、去甲乌药碱合酶、葡萄糖脱氢酶、多巴胺和苯丙酸或其衍生物,反应温度为20-40℃,反应体系pH为6-8,反应时间为2-8h;
(2)加热,使步骤(1)中的酶失活,收集上清;
(3)向步骤(2)所得上清中加入氧甲基转移酶、氮甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸,反应温度为20-40℃,反应时间为2-8h,得到(S)-autumnaline或其衍生物。
在一种实施方式中,所述步骤(1)还加入了5-10mM镁离子、5-10mM多聚磷酸盐或ATP、1-3mMNADP+、1-20mM葡萄糖、1-5mM抗坏血酸或抗坏血酸盐。
在一种实施方式中,所述步骤(1)体系中的物质的浓度分别为:5-10μM羧酸还原酶,5-10μM去甲乌药碱合酶,5-10μM葡萄糖脱氢酶,1-10mM底物多巴胺,1-10mM苯丙酸衍生物。
在一种实施方式中,所述步骤(3)中加入了5-10μM氧甲基转移酶,20-30μM氮甲基转移酶和5-10mMS-腺苷甲硫氨酸。
本发明还提供了一种以上述重组菌株合成(S)-autumnaline或其衍生物的方法,所述方法包括:
(1)细胞培养:将重组细胞IAA1、IAA2、IAA3分别接种至培养基中,培养菌株至对数生长期,诱导,收集菌体;
(2)将步骤(1)所得重组细胞IAA1与底物混合反应,收集反应上清液;所述底物包括苯丙酸衍生物和多巴胺;
(3)将步骤(1)所得重组细胞IAA2与步骤(2)所得上清液混合,进行反应,收集反应上清液;
(4)将步骤(1)所得重组细胞IAA3与步骤(3)所得上清液混合,进行反应,得到(S)-autumnaline或其衍生物。
在一种实施方式中,所述细胞培养包括:将重组细胞IAA1或IAA2或IAA3接种至LB培养基,20-40℃培养10-12h,转接至2YT培养基,20-40℃培养至OD600值达到0.6-0.8左右,降温至15-25℃,加入终浓度为0.05-0.5mM的IPTG诱导10-20h,收集菌体。
在一种实施方式中,所述方案的步骤(2)中反应含有1-10mM抗坏血酸,优选为抗坏血酸钠。
在一种实施方式中,所述方案的步骤(3)的反应体系中含有1-10mM多聚磷酸盐或ATP,和10-50mM L-甲硫氨酸,所述多聚磷酸盐优选为ATP的金属盐。
在一种实施方式中,所述方案的步骤(4)的反应体系中含有1-10mM多聚磷酸盐或ATP,所述多聚磷酸盐优选为ATP的金属盐。
在一种实施方式中,所述反应的温度为20-40℃,所述反应的pH为7.5-8.5。
在一种实施方式中,所述反应的时间为4-8h,或所述反应的时间为不低于6h。
在一种实施方式中,所述苯丙酸衍生物的添加量为7.5-15mM;所述多巴胺添加量为5-10mM。
在一种实施方式中,所述重组细胞IAA1的添加量为20-30g/L;所述重组细胞IAA2的添加量为30-120g/L,优选为30-40g/L,或优选为100-120g/L;所述重组细胞IAA3的30-40g/L。
在一种实施方式中,所述苯丙酸衍生物的结构式如下所示:
在一种实施方式中,所述苯丙酸或其衍生物的结构式包括1-12中的至少一种:
在一种实施方式中,所述(S)-autumnaline的结构式如下所示:
在一种实施方式中,所述(S)-autumnaline衍生物的结构式如下(s)-1d至(s)-11d任一所示:
本发明还提供了所述突变体,或所述重组细胞,或所述方法在制备(S)-autumnalin或其衍生物中的应用。
有益效果:
(1)本发明提供了一株重组菌株IAA1,该菌株可以将底物多巴胺和苯丙酸衍生物高效转化为苯乙基异喹啉骨架((S)-1b-(S)-12b,见图1),转化率为90%,ee值>98%;
(2)本发明提供了一株重组菌株IAA2,该菌株能够利用L-甲硫氨酸和ATP合成S-腺苷甲硫氨酸,同时能够在底物(S)-1b-(S)-12b(见图1)的6号位羟基上实现甲基化;
(3)本发明提供了一株重组菌株IAA3,该菌株能够利用L-甲硫氨酸和ATP合成S-腺苷甲硫氨酸,同时能够在底物(S)-1c-(S)-12c(见图1)的亚氨基上实现甲基化;
(4)本发明提供了一种氮甲基转移酶突变体,突变体N92A/F332A相较于野生型酶,酶活力提高了17.26倍;突变体F332A相较于野生型酶,酶活力提高了7倍;N92A相较于野生型酶,酶活力提高了5倍;
(5)本发明提供了一种氧甲基转移酶突变体,突变体V125Q相较于野生型酶,酶活力提升了2.6倍;
(6)本发明还提供了一种以苯丙酸衍生物和多巴胺为原料合成(S)-autumnaline或其衍生物的方法,(S)-1d-(S)-11d的产量分别为1.20g/L,1.09g/L,1.21g/L,1.23g/L,1.22g/L,1.23g/L,1.33g/L,1.11g/L,1.17g/L,1.19g/L,1.11g/L;产率分别为61.80%,73.37%,73.22%,74.51%,73.50%,77.95%,70.95%,71.41%,71.83%,72.53,%,62.42%;
(7)本发明的方法,在1L的摇瓶中,30℃反应条件下,6mM底物3-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯基)丙酸和4mM多巴胺在18h内生成了709.06mg/L(S)-autumnaline((S)-12d),产率为53.50%。
附图说明
图1为(S)-autumnaline及其衍生物的合成路线。
图2为改造CNMT高效合成(S)-autumnaline衍生物。(a)CNMT突变体对底物(S)-1c的相对活力,亲本对底物(S)-1c的催化活力设为1;(b)通过体外多酶级联反应实现底物1和多巴胺转化为产物(S)-1d的液相分析图。
图3为产物(S)-1d的标准曲线图。
图4为产物(S)-12c的标准曲线图。
图5为体外合成(S)-1b手性鉴定。(a)体外多酶级联反应合成(S)-1b的手性色谱图;(b)外消旋体1b的手性色谱图。
图6为重组菌株TpCAR-BsSfp-TfNCS-IAA(菌株IAA1)合成(S)-1b的HPLC(a)和MS(b)鉴定。
图7为重组菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA(菌株IAA2(RnCOMT))合成(S)-1c的HPLC。
图8为重组菌株CNMT-MmSAHH-EcMAT-IAA(菌株IAA3)合成(S)-1d的HPLC(a)和MS(b)鉴定。
图9为利用三个重组菌株IAA1,IAA2(RnCOMT),IAA3进行底物谱扩展。
图10为RnCOMT亲本和GsOMT1突变体对底物(S)-12b的相对活力,亲本GsOMT1对底物(S)-12b的催化活力设为1。
图11为利用三个重组菌株IAA1,IAA2(GsOMT1V125Q),IAA3合成(S)-autumnaline的MS鉴定。
图12为(S)-autumnaline在氘代甲醇中H谱和C谱。
图13为利用菌株IAA1,IAA2(GsOMT1),IAA3合成(S)-autumnaline的时间曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
试剂材料购买来源:本发明所用氨苄青霉素钠,硫酸卡那霉素,硫酸链霉素等抗生素均来自于上海生工;本发明所使用的辅因子ATP钠盐,NADPH,SAM等均来自于萨恩化学技术(上海)有限公司;本发明中分子实验所涉及到的PCR酶和同源重组酶均采购于宝生物工程(大连)有限公司;本发明中所使用的化学试剂均采购于国药集团化学试剂有限公司和上海泰坦科技股份有限公司。
氮甲基转移酶(CNMT)酶活检测:200μL反应体系包括100mMHEPES-NaOH缓冲液(pH7.5),5μMRnCOMT,25μMCNMT突变体,10mMMgCl2,2mM(S)-1b和8mMSAM(pH 7.5),整个体系在反应振荡器中进行,反应温度30℃,反应时间为4h。反应结束后,加入4倍体积的乙腈淬灭反应,振荡,低温高速离心,20000g离心5min,取200μL样品上样色谱柱,根据产物(S)-1d的标准曲线(见图3)分析各个突变体的产量。
氧甲基转移酶(GsOMT1)酶活检测:200μL反应体系包括100mMHEPES-NaOH缓冲液(pH7.5),5μMGsOMT1,1.6mM(S)-12b和4mMSAM(pH 7.5),整个体系在反应振荡器中进行,反应温度30℃,反应时间为4h。反应结束后,加入4倍体积的乙腈淬灭反应,振荡,低温高速离心,20000g离心5min,取200μL样品上样色谱柱,根据产物(S)-12c的标准曲线(见图4)分析各个突变体的产量。
高效液相色谱(HPLC)检测条件:ZORBAXEclipse XDB-C18色谱柱,色谱柱柱温为30℃,检测波长为280nm。检测方法采用乙腈(含0.1%(v/v)三氟乙酸)和双蒸水(含0.1%(v/v)三氟乙酸)的双相溶剂体系进行梯度分离,流动相流速为1mL min-1。线性梯度如下,先以5%的乙腈等度洗脱1min,再以5%-60%的乙腈梯度洗脱20min。
蛋白纯化方法:利用裂解缓冲液(50mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,20mM咪唑,pH=8)对收集的菌体进行重悬,然后通过高压匀浆机破碎重悬液。将破碎后的重悬液进行低温高速离心,4℃、10000rpm离心30min,得到粗酶液。通过镍柱亲和层析,脱盐柱(HistrapTM 5mLDesalting)脱盐,最终得到纯化后的蛋白。
实施例1:模式产物的人工级联反应途径构建与验证
如图1所示,第一步首先以3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙酸(1)为模式底物,通过在磷酸泛酸巯基乙胺转移酶(BsSfp)活化后的羧酸还原酶(TpCAR),金属离子镁离子(Mg2+),辅因子ATP,NADPH作用下还原为相应的醛(1a),随后在去甲乌药碱合酶(TfNCS)的作用下将另一个底物多巴胺与生成的醛缩合,生成苯乙基异喹啉的骨架(S)-1-(3,4,5-三甲氧基苯乙基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6,7-二醇((S)-1b)。第二步,中间体(S)-1b在氧甲基转移酶(RnCOMT),辅因子SAM的作用下生成(S)-1c。第三步,中间体(S)-1c在氮甲基转移酶(CNMT),辅因子SAM的作用下生成最终的产物(S)-1d。辅因子SAM由甲硫氨酸腺苷转移酶(EcMAT)催化合成,SAM脱甲基后的产物SAH由高半胱氨酸水解酶(MmSAHH)水解。具体步骤如下:
第一步反应:向1.5ml的EP管中分别加入5-10μM羧酸还原酶,5-10μM去甲乌药碱合酶,5-10μM葡萄糖脱氢酶,5-10mM氯化镁,5-10mMATP,1-3mMNADP+,10mM葡萄糖,2mM抗坏血酸钠,2mM底物多巴胺和2mM苯丙酸衍生物,反应体系在0.1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液中进行,pH为7.5,反应终体积为200μL。
(2)将步骤(1)中的反应管置于30℃,800rpm的振荡反应器中反应4h。反应结束后,95℃加热5min使得步骤(1)中的酶失活,并进行高速离心获得上清。
(3)第二步反应:向上述步骤(2)的上清中加入5-10μM氧甲基转移酶,20-30μM氮甲基转移酶和5-10mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM,pH7.5)。反应体系置于30℃,800rpm的振荡反应器中反应4h。
(4)反应结束后,向上述反应液中添加4倍体积的乙腈淬灭反应,振荡,低温高速离心,20000g离心5min,取200μL样品上样色谱柱,通过液相检测产物。
反应结果如图2b所示,在实验组(N92A/F332A)中,出现和标品同样位置的新峰,初步确定为产物(S)-1d。
实施例2:人工级联反应途径中关键限速酶(氮甲基转移酶CNMT)的改造
为了提高产物(S)-1d的产量,我们对级联反应路径中的限速酶CNMT进行了改造。首先通过分子对接软件(Discovery Studio)将底物(S)-1c对接到CNMT蛋白的底物口袋中,接下来,挑选了底物(S)-1c范围内的6个氨基酸进行丙氨酸突变。以产物(S)-1d的相对产量,表示不同突变体的相对活性。如图2a所示,得到活力较高的三个单突变体CNMTL88A,CNMTN92A,CNMTF332A。其次,采用半理性设计和组合突变策略得到最优突变体CNMTN92A/F332A。相比于野生型CNMT,突变体CNMTN92A/F332A活性提高了17.26倍。
表1氮甲基转移酶CNMT突变体相对酶活力
突变体 | 相对活力(以WT的活力约为1) |
野生型WT | 1 |
CNMTN92A | 5 |
CNMTF332A | 7 |
CNMTN92A/F332A | 17.26 |
最终通过实施例1所述的多酶级联反应(区别在于,将氮甲基转移酶CNMT替换为了突变体CNMTN92A/F332A),体外验证了多酶合成苯乙基异喹啉生物碱的可行性,如图2b所示。同时,利用手性柱验证了的产物的ee值大于98%,如图5a所示。CNMT突变体设计所用引物如表2所示。
表2CNMT突变体的引物序列
实施例3:工程菌株TpCAR-BsSfp-TfNCS-IAA(IAA1)、EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA(IAA2)、CNMT-MmSAHH-EcMAT-IAA(IAA3)的构建,蛋白表达与产物鉴定
1、工程菌株TpCAR-BsSfp-TfNCS-IAA(IAA1)的构建,蛋白表达与产物鉴定
将微变冢村氏菌Tsukamurellapaurometabola来源的目的基因CAR进行密码子优化,得到SEQ ID No.5所示基因序列,将其基因合成并连接在pRSFDuet载体的第一个多克隆位点(MCS),获得质粒pRSFDuet-TpCAR。
从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的基因组上扩增得到Sfp基因片段,并将其连接到pET-21b(+)载体上,获得质粒pET-21b-BsSfp。
将黄唐松草Thalictrum flavum来源的目的基因NCS进行密码子优化,得到SEQ IDNo.9所示基因序列,将其基因合成并连接在pET-21b(+)载体的NdeI和XhoI位点,获得质粒pET-21b-TfNCS。
获得上述3个质粒后,利用同源重组技术将基因片段Sfp和NCS分别整合到pRSFDuet-TpCAR的MCS1和MCS2,获得质粒pRSFDuet-T7-rbs-TpCAR-rbs-BsSfp-T7-rbs-TfNCS。将重组质粒转化到工程菌株IAA中获得重组菌株TpCAR-BsSfp-TfNCS-IAA。质粒构建所用到的引物如表2所示。
将挑取单克隆菌株TpCAR-BsSfp-TfNCS-IAA,转移到5ml LB培养基(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L),以250rpm,37℃培养10-12h。随后,转接于500ml的2YT培养基中(胰蛋白胨16g/L,酵母提取物10g/L,氯化钠5g/L),以120rpm,37℃下培养,当菌体OD600值达到0.6-0.8左右,降温至18℃,培养30min后加入终浓度为0.2mM的IPTG,于18℃下诱导培养16h,离心后收集菌体。用含有50mMHPEPS(pH 7.5),200mMKCl的buffer清洗菌体3遍,离心获得菌体。
随后,通过5ml反应体系验证产物(S)-1b的合成,反应体系为:50mM HPEPS缓冲液(pH7.5),菌体终浓度OD600为6,20mM MgCl2,20mM葡萄糖,5% DMSO,7.5mM底物1,5mM底物多巴胺以及5mM抗坏血酸钠。反应在30℃振荡器中进行,8h后,取样200μL并加入800μL乙腈淬灭反应。样品20000g离心5min,并用0.22μm滤膜进行过滤。
利用HPLC系统检测产物(S)-1b的合成。如图6a所示,全细胞催化获得的化合物与标准品出峰时间一致,并进一步通过高分辨质谱确定了产物的生成,(S)-1b的产量为1.61g/L,产率为89.60%。如图6b所示。
2、工程菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA(IAA2)构建,蛋白表达与产物鉴定
将褐家鼠Rattus norvegicus来源的目的基因COMT进行密码子优化,得到SEQ IDNo.11所示基因序列,将其基因合成并连接在pET-21b(+)载体的NdeI和XhoI位点,获得质粒pET-21b-RnCOMT。
从大肠杆菌基因组上扩增获得MAT基因片段,并将其连接到pET-21b(+)载体上,获得质粒pET-21b(+)-EcMAT。
将家鼠Mus musculus来源的目的基因SAHH进行密码子优化,得到SEQ ID No.15所示基因序列,将其基因合成并连接在pET-21b(+)载体的NdeI和XhoI位点,获得质粒pET-21b-MmSAHH。获得上述3个质粒后,利用同源重组技术将基因片段EcMAT,RnCOMT和MmSAHH整合到pETDuet质粒的2个MCS后,获得质粒pETDuet-T7-rbs-EcMAT-rbs-RnCOMT-T7-rbs-MmSAHH。将重组质粒转化到工程菌株IAA中获得重组菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA。质粒构建所用到的引物如表2所示。
利用步骤1中相同的方法培养重组菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA,离心获得菌体。随后,利用步骤1中的重组菌株TpCAR-BsSfp-TfNCS-IAA全细胞反应后上清,重悬重组菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA,使其菌体终浓度OD600为9,并向上述重悬液中加入30mM L-Met和5mM ATP(pH 7.5),30℃,250rpm下反应6h。利用步骤1中相同的样品后处理方法和液相检测条件检测产物(S)-1c。结果如图7所示。
3、CNMT-MmSAHH-EcMAT-IAA(IAA3)工程菌株的构建,蛋白表达与产物鉴定
将日本黄连Coptis japonica来源的目的基因CNMT进行密码子优化,得到SEQ IDNo.1所示基因序列,将其基因合成并连接到pET-21b(+)载体的NdeI和XhoI位点,获得质粒pET-21b(+)-CNMT。
利用同源重组技术将基因片段EcMAT,CNMT和MmSAHH整合到pETDuet质粒的2个MCS后,获得质粒pETDuet-T7-rbs-CNMT-rbs-MmSAHH-T7-rbs-EcMAT。将重组质粒转化到工程菌株IAA中获得重组菌株CNMT-MmSAHH-EcMAT-IAA。质粒构建所用到的引物如表3所示。
表3构建重组菌株的引物序列
利用步骤1中相同的方法培养重组菌株CNMT-MmSAHH-EcMAT-IAA,离心获得菌体。随后,将步骤2中重组菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA全细胞反应后上清调节pH至7.5,然后用pH 7.5的反应液上清重悬重组菌株CNMT-MmSAHH-EcMAT-IAA,使其菌体终浓度OD600为9,并向上述重悬液中加入5mMATP(pH7.5),30℃,250rpm下反应6h。利用步骤1中相同的样品后处理方法和液相检测条件检测产物(S)-1d,并进一步通过高分辨质谱确定了产物的生成,如图6a和图6b所示,产量为1.20g/L,产率为61.80%。本发明中构建的所有菌株如表4所示。
表4本发明中构建的菌株
实施例4:底物谱扩展
菌株培养、诱导方法同实施例3,以一锅三步法的反应方式,以含有不同取代基的苯丙酸及其衍生物(图9中1-12)和多巴胺作为底物,添加到全细胞催化体系中,对底物谱进行扩展。含有不同取代基的苯丙酸衍生物,以及相应产物的结构式如图9所示。
一锅三步法的反应条件如下:
(a)利用步骤1中相同的方法培养重组菌株IAA1、IAA2(RnCOMT)和IAA3,离心获得菌体。
(b)随后,通过5ml反应体系进行底物转化,反应体系为:50mM HPEPS缓冲液(pH7.5),菌体IAA1终浓度OD600为6,20mM MgCl2,20mM葡萄糖,5% DMSO,7.5mM底物1,5mM底物多巴胺以及5mM抗坏血酸钠。反应在30℃振荡器中进行8h,8h后,7000rpm离心10min收集上清并用于下一步反应;
(c)以步骤(b)中离心获得的上清重悬菌体IAA2(RnCOMT),使其菌体终浓度为9,并向上述重悬液中加入30mM L-Met和5mM ATP(pH 7.5),30℃,250rpm下反应6h。8h后,7000rpm离心10min收集上清,并用5M NaOH将上清的pH调节至7.5,用于下一步反应;
(d)以步骤(c)中获得的上清重悬菌体IAA3,使其菌体终浓度为9,并向上述重悬液中加入5mM ATP(pH 7.5),30℃,250rpm下反应6h。6h后,进行HPLC检测,并通过产物标曲对(S)-2d-(S)-12d进行定量。
结果显示,所有底物(图9中1-12)都能转化为相应的产物(S)-1d至(S)-12d,具体产率如下表所示。
表5不同不同取代基的苯丙酸衍生物的转化率以及相应(S)-autumnaline衍生物的产率
底物 | 产物 | 产率(%) | 产量(g/L) |
1 | (S)-1d | 61.80 | 1.20 |
2 | (S)-2d | 73.37 | 1.09 |
3 | (S)-3d | 73.22 | 1.21 |
4 | (S)-4d | 74.51 | 1.23 |
5 | (S)-5d | 73.50 | 1.22 |
6 | (S)-6d | 77.95 | 1.23 |
7 | (S)-7d | 70.95 | 1.33 |
8 | (S)-8d | 71.41 | 1.11 |
9 | (S)-9d | 71.83 | 1.17 |
10 | (S)-10d | 72.53 | 1.19 |
11 | (S)-11d | 62.42 | 1.11 |
12 | (S)-12d | 19.08 | 0.36 |
实施例5:(S)-autumnaline的高效合成及放大制备
在进行(S)-autumnaline的合成时,由于重组菌株EcMAT-RnCOMT-MmSAHH-IAA(IAA2(RnCOMT))产率较低,因此将活性更高的氧甲基转移酶GsOMT1代替RnCOMT。
密码子优化并合成嘉兰百合Gloriosa superba来源的目的基因OMT1(SEQ IDNo.3所示),并将其连接到pET-21b(+)载体的NdeI和XhoI位点,获得质粒pET-21b(+)-GsOMT1。为了进一步提高(S)-autumnaline的产量,对限速酶GsOMT1进行了改造,所用引物见表6,得到如图10所示的突变体,其中单突变体GsOMT1V125Q活力最高。相比于野生型,其活性提高了2.58倍。
质粒构建所用到的引物如表4所示。同时,为了提高GsOMT1V125Q在大肠杆菌中的可溶性表达,在GsOMT1V125Q的N端添加sumo序列来提高蛋白的可溶性表达,进而提高(S)-autumnaline的产量,N端添加了sumo序列的GsOMT1V125Q基因序列和氨基酸序列分别如SEQID NO.17、SEQ ID NO.18所示。利用同源重组技术将基因片段EcMAT,GsOMT1V125Q和MmSAHH整合到pETDuet质粒的2个MCS后,获得质粒pETDuet-T7-rbs-EcMAT-rbs-GsOMT1-T7-rbs-MmSAHH。将重组质粒转化到工程菌株IAA中获得重组菌株EcMAT-GsOMT1-MmSAHH-IAA。利用实施例3中的方法,并将菌株IAA2(RnCOMT)替换为IAA2(GsOMT1),最终实现了(S)-autumnaline的合成,并通过高分辨质谱和NMR进行了验证,如图11和图12所示。
为了规模化制备(S)-autumnaline,在1L的摇瓶中进行了300ml体系的放大反应。在30℃反应条件下,6mM底物3-(3-羟基-4,5-二甲氧基苯基)丙酸和4mM多巴胺在18h内生成了709.06mg/L(S)-autumnaline,产率为53.50%,如图13所示。
表6 GsOMT1突变体的引物序列
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明的基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权力要求书为准。
Claims (10)
1.一种氮甲基转移酶突变体,所述氮甲基转移酶突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氮甲基转移酶为亲本,进行了以下(a)-(c)所述一个或多个突变:
(a)将亲本第88位亮氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸或丝氨酸或缬氨酸;
(b)将亲本第92位天冬酰胺突变为丙氨酸或缬氨酸;
(c)将亲本第332位苯丙氨酸突变为丙氨酸或丝氨酸或缬氨酸。
2.一种氧甲基转移酶突变体,所述氧甲基转移酶突变体以氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的氧甲基转移酶为亲本,进行了以下所述(a)-(d)一个或多个突变:
(a)将亲本第122位异亮氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或天冬氨酸;
(b)将亲本第125位缬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或天冬氨酸或组氨酸;
(c)将亲本第181位天冬酰胺突变为丙氨酸或谷氨酰胺;
(d)将亲本第310谷氨酸突变为缬氨酸或亮氨酸。
3.编码权利要求1所述氮甲基转移酶突变体,和/或权利要求2所述氧甲基转移酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的载体。
5.表达权利要求1或2所述突变体,或权利要求3所述基因,或携带权利要求4所述载体的重组细胞。
6.一种合成(S)-autumnaline或其衍生物的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)细胞培养:将重组细胞IAA1、重组细胞IAA2和重组细胞IAA3分别接种至培养基中,培养菌株至对数生长期,诱导,收集菌体;
(2)将步骤(1)所得重组细胞IAA1与底物混合反应,收集反应上清液;所述底物包括苯丙酸或苯丙酸衍生物,和多巴胺;
(3)将步骤(1)所得重组细胞IAA2与步骤(2)所得上清液混合,进行反应,收集反应上清液;
(4)将步骤(1)所得重组细胞IAA3与步骤(3)所得上清液混合,进行反应,得到(S)-autumnaline或其衍生物;
所述重组细胞IAA1是在出发菌株的基础上表达了:羧酸还原酶、磷酸泛酸巯基乙胺转移酶和去甲乌药碱合酶;
所述重组细胞IAA2是在出发菌株的基础上表达了:氧甲基转移酶、甲硫氨酸腺苷转移酶和高半胱氨酸水解酶;
所述重组细胞IAA3是在出发菌株的基础上表达了:氮甲基转移酶、甲硫氨酸腺苷转移酶和高半胱氨酸水解酶;
所述出发菌株为敲除了醇脱氢酶,醛酮还原酶和转录因子yqhC基因的大肠杆菌;所述醇脱氢酶包括基因yqhD、yahK、yjgB,所述醛酮还原酶包括基因dkgB、yeaE、dkgA。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述羧酸还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示,所述磷酸泛酸巯基乙胺转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示,所述去甲乌药碱合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示,
所述氧甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.18所示,或所述氧甲基转移酶为权利要求2所述的氧甲基转移酶突变体,所述甲硫氨酸腺苷转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示,所述高半胱氨酸水解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示,
所述氮甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,或所述的氮甲基转移酶为权利要求1所述的氮甲基转移酶突变体。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述苯丙酸或苯丙酸衍生物包括以下1-12至少一种:
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述反应的温度为20-40℃。
10.权利要求1所述氮甲基转移酶突变体,或权利要求2所述氧甲基转移酶突变体,或权利要求3所述基因,或权利要求4所述载体,或权利要求5所述重组细胞,或权利要求6-9任一所述方法在合成(S)-autumnaline或其衍生物中的应用。
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