CN117660308A - 一种用于培养cho细胞系细胞的培养方法及培养设备 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法及培养设备，涉及细胞培养技术领域，其中培养方法为将CHO细胞在含铁、胱氨酸、半胱氨酸、铜、锰、精氨酸、组氨酸、赖氨酸的培养基中流加培养；可以有效调控电荷异构体，降低酸性变体的通用性策略并应用在CHO细胞培养中同时提升了生长和产量；铁，胱氨酸，半胱氨酸，铜，锰，精氨酸，组氨酸，赖氨酸在对细胞的生长，产量和质量具有调控作用，并且重点发现通过DOE实验设计发现调整这几种物质的浓度可以有效降低抗体酸性变体的积累进而实现对抗体质量属性的调控回归到合适的范围内。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法及培养设备。
背景技术
在生物制药领域，CHO细胞作为宿主细胞已被应用于大规模的生产场景并拥有十分久远的发展历史；在其发展进程中衍生出许多不同类型的CHO细胞系，如CHOK1、CHOK1SV、CHOZN、DG44、CHOS等。伴随着技术设备的不断更新以及从事该行业的从业者对产量和质量不断提出更高的要求，培养基的性能显得至关重要因为培养基中营养物质会直接细胞生长，产物滴度和产物质量；因此对于培养基物质的探索和不断优化也是必不可少的一环。
抗体属于免疫球蛋白家族(Ig)。分子量在150kDa左右，在血液中存在5种类型免疫球蛋白，分别为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，其均由重链和轻链连接形成。在血清中，IgG含量最高，达75％，半衰期也是最长。抗体IgG根据γ-chain序列和二硫键结构分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种亚型。抗体是由2个Fab和1个Fc通过二硫键和铰链区连接形成。Fab区域结合抗原，Fc区域结合Fc受体和特定类型细胞表面蛋白受体。
如中国专利，公告号CN113088480B，一种用于CHO细胞的培养基及其用途，公告了一种CHO细胞无血清培养基及其应用，是化学成分明确，且不含血清、鸟氨酸、羟脯氨酸、对氨基苯甲酸、胸腺嘧啶、胸苷、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶的培养基，所述培养基包含基础培养基和终浓度为120-150g/L的流加培养基，用于CHO细胞的培养基能够支持不同亚型CHO细胞的长期传代生长；在细胞的批培养中能够维持高细胞密度的生长、后期细胞活率的维持和目的产品的高表达；有利于细胞代谢和产品质量的控制，便于培养工艺优化；该培养基成本低廉、配制方便、适于重组蛋白生物制品大规模生产。
但是在培养过程中易产生由于电荷异质性导致产生的酸性蜂，导致培养产物产生无法预测的效果，可能带来无法预测的危害。
发明内容
本申请实施例通过提供一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法及培养设备，解决了现有技术中由于电荷异质性导致产生的酸性蜂的问题，实现了降低酸峰的技术效果。
本申请实施例提供了一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，所述的培养方法为将CHO细胞在含铁、胱氨酸、半胱氨酸、铜、锰、精氨酸、组氨酸、赖氨酸的培养基中流加培养。
进一步的，培养方法具体为将CHO细胞在基础培养基中培养，并在第三天开始补料，补料频率为每隔一天一次。
进一步的，所述的基础培养基为Hi ghPro，补料采用DN feed 3+DN feed B3。
进一步的，所述的CHO细胞包括CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4。
进一步的，所述的培养环境为37℃，5％二氧化碳。
进一步的，所述的培养基包含铁，胱氨酸，半胱氨酸，铜，锰，精氨酸，组氨酸，赖氨酸时，用于调控电荷异构体，降低酸性变体。
进一步的，所述的培养基包含铁，胱氨酸，半胱氨酸，精氨酸，组氨酸，赖氨酸时，用于增加产量。
一种用于培养CHO细胞系细胞的培养设备，包括外壳体、培养架、雾化装置、报警装置、支撑装置；
其中，外壳体为长方体形，外壳体内安装有隔板；
隔板将外壳体内空间分为左腔、中腔、右腔，中腔空间大于左腔、右腔，外壳体的中腔空间中安装有培养架、报警装置、支撑装置，外壳体的左腔和右腔内皆装有雾化装置；
外壳体底部安装有支撑装置和报警装置；
支撑装置顶部安装有用于培养细胞的培养架；
培养架包括底板和横板；
底板上开设有进料孔，进料孔与雾化装置的输出端对应；
横板上开设有锥形的通孔，且若干通孔的直径自上而下逐渐增加；
雾化装置包括雾化器、分料室、输料管；
雾化器输出端与输料管的一端固定安装；
输料管的另一端还安装有分料室；
分料室安装在培养架的底部，分料室与进料孔对应；
报警装置包括旋钮、触钮；
旋钮调节触钮的伸出长度；
触钮与培养架触碰时触发报警；
支撑装置包括底座、伸缩套筒、伸缩杆、气泵、输气管；
底座固定在外壳体底部，底座顶部靠近四个角的位置上固定安装有伸缩套筒，伸缩套筒内部活动连接有伸缩杆；
底座与气泵通过输气管连接。
进一步的，底板上附有一层隔膜；隔膜上均匀间隔开设有若干细孔。
进一步的，底板安装有通孔针；通孔针与隔膜的细孔一一对应。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
其一、该八种物质通在多个克隆均有效降低酸峰的积累，因此可能作为电荷异构体调控的通用且有效的手段；其次在降低酸峰的同时，其中的五种物质可以提升细胞的产量，很好的做到产量和产量兼顾。为快速反应解决工艺问题提供了很好的解决策略和思路。
其二、由于细胞受重力影响在培养过程中更多的聚集在靠近底部的位置，在底部补料能更多满足不同浓度细胞的需求，且不会因为培养架的移动影响进料，提高了进料的稳定性与细胞培养的需要。
其三、通过隔膜上均匀间隔开的细孔，可以确保所加的雾化料在培养区域内均匀分布。这有助于避免某些区域过度补料而其他区域补料不足，从而保证了细胞生长的均匀性；当隔膜鼓起时，新料获得初速度，能够有效地将堆积的细胞冲散。这有助于维持细胞的单层生长，防止细胞堆积造成的生长不均和营养摄取不足。
其四、通孔针与隔膜的细孔一一对应，当补料停止、隔膜贴附在底板上时，通孔针能够穿过隔膜的细孔；有助于疏通可能堵塞的细胞或其分泌物，确保补料通道畅通无阻，为下一次补料做好准备；通过及时、均匀的补料以及有效的细胞冲散，可以维持细胞的良好生长状态，提高细胞活性；有助于减少补料过程中可能出现的污染风险；由于补料是通过细孔进行的，且通孔针能够疏通堵塞物，因此可以降低因操作不当或设备故障导致的污染可能性。
附图说明
图1为本发明的DOE筛选实验运行序列；
图2为本发明的标准化效应的Pareto图；
图3为本发明的标准化效应的正态图；
图4为本发明的Acidic主效应图；
图5为本发明实施例四培养箱的主视图；
图6为本发明的雾化装置结构示意图；
图7为本发明的培养箱的侧视图；
图8为本发明的实施例五结构示意图；
图9为本发明的实施例六鼓起状态示意图；
图10为本发明的实施例六贴附状态示意图。
图中：
100、外壳体；200、培养架；300、雾化装置；400、报警装置；500、支撑装置；
110、隔板；
210、底板；220、横板；
221、通孔；211、进料孔；
310、雾化器；320、分料室；330、输料管；340、隔膜；350、通孔针
410、旋钮；420、触钮；
510、底座；520、伸缩套筒；530、伸缩杆；540、气泵；550、输气管。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述；附图中给出了本发明的较佳实施方式，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式；相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。
需要说明的是，本文所使用的术语“垂直”、“水平”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学木语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例一
DOE筛选实验：
本次实验均采用多宁平台的商业化培养基，基础采用HighPro 200，补料采用DNfeed 3+DN feed B3，培养方式是流加培养。
基础培养基中还加入8种成分为铁，胱氨酸，半胱氨酸，铜，锰，精氨酸，组氨酸和赖氨酸，其具体浓度折算为铁元素2.5mg/L，胱氨酸150mg/L，半胱氨酸50mg/L，铜元素0.025mg/L，锰元素0.0015mg/L，精氨酸1500mg/L，组氨酸280mg/L和赖氨酸1000mg/L。
根据配方中的铁，胱氨酸，半胱氨酸，铜，锰，Comb(精氨酸，组氨酸，赖氨酸)的原浓度对应调整，每种物质选择三个水平浓度然后输入计算机进行pb实验设计出实验组合和实验数量，并按照组合配置出对应培养基；
本实施例中含铁元素的成分为硫酸亚铁，含铜元素的成分为五水硫酸铜，含锰元素的成分为硫酸锰；
实验方式：流加培养(加入补料培养基)；
试验程序：Day 3开始补料，Day 3/5/7/9/11隔天补料并对应取样检测细胞生长参数，Day 13收获检测产量并离心纯化检测IEC。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：采用CHO-1培养，按照实验设计的运行序分别对应摇瓶编号SF 2-16，SF1为原始HighPro 200对照。培养体积均为30mL，均在Day 4降温，补料量均为隔天4％+0.4％。并在Day 13收获检测产量，离心取上清纯化检测IEC(离子交换色谱)。
表一：质量结果
通过上述DOE筛选实验，证明8种物质的任意组合可以降低酸峰，提高产量。
实施例二
通过第一轮DOE筛选实验，已证明8种物质可以降低酸峰，为证明8种物质的通用性，选用其余三种CHO细胞系分别为CHO-2，CHO-3，CHO-4。采用多宁平台的商业化培养基，基础采用HighPro 200，补料采用DN feed 3+DN feed B3，培养方式是流加培养。
实验方式：流加培养(加入补料培养基)；
试验程序：Day 3开始补料，Day 3/5/7/9/11隔天补料并对应取样检测细胞生长参数，Day 13收获检测产量并离心纯化检测IEC。
培养环境：37℃，5％二氧化碳；
摇瓶培养过程：采用CHO-2，3，4培养，按照实验设计的运行序选择DOE-1，DOE-3，DOE-6进行测试验证，HighPro 200仍为原始对照。培养体积均为30mL，均在Day 4降温，补料量均为隔天4％+0.4％。并在Day 13收获检测产量，离心取上清纯化检测IEC。
表二：质量结果
通过不同CHO细胞，证明了8种物质的通用性，对于不同CHO细胞，都具有良好的效果。
实施例三
为了评估在酸峰降低的同时产量是否有所提高，选用四种CHO细胞系分别为CHO-1，CHO-2，CHO-3，CHO-4。采用多宁平台的商业化培养基，基础采用Hi ghPro 200，补料采用DN feed 3+DN feed B3，培养方式是流加培养。
实验方式：流加培养(加入补料培养基)；
试验程序：Day 3开始补料，Day 3/5/7/9/11隔天补料并对应取样检测细胞生长参数，Day 13收获检测产量并离心纯化检测IEC；
培养环境：37℃，5％二氧化碳；
摇瓶培养过程：采用CHO-1，2，3，4培养，按照实验设计的运行序选择DOE-1，DOE-3，DOE-6进行测试验证，HighPro 200仍为原始对照。培养体积均为30mL，均在Day 4降温，补料量均为隔天4％+0.4％。并在Day 13收获检测产量。
表三：产量结果
| SF | Titer(g/L) |
| (Control)CHO-1 | 3.4 |
| DOE-1 CHO-1 | 4.1 |
| DOE-3 CHO-1 | 4.2 |
| DOE-6 CHO-1 | 4.5 |
| (Control)CHO-2 | 2.2 |
| DOE-1 CHO-2 | 2.0 |
| DOE-3 CHO-2 | 2.3 |
| DOE-6 CHO-2 | 2.5 |
| (Control)CHO-3 | 7 |
| DOE-1 CHO-3 | 7.2 |
| DOE-3 CHO-3 | 6.8 |
| DOE-6 CHO-3 | 7.8 |
| (Control)CHO-4 | 5.6 |
| DOE-1 CHO-4 | 5.2 |
| DOE-3 CHO-4 | 6.1 |
| DOE-6 CHO-4 | 6.6 |
通过产量检测，发现在不同CHO细胞下，不同的成分组合具有不同的效果，通过优化调整以上6种物质(无铜，锰)的浓度来实现产量的提高。
实施例四
本实施例提供一种细胞培养设备，包括外壳体100、培养架200、雾化装置300、报警装置400、支撑装置500；
其中，外壳体100为长方体形，外壳体100内安装有隔板110；
隔板110将外壳体100内空间分为左腔、中腔、右腔，中腔空间大于左腔、右腔，外壳体100的中腔空间中安装有培养架200、报警装置400、支撑装置500，外壳体100的左腔和右腔内皆装有雾化装置300；
外壳体100底部安装有支撑装置500和报警装置400；
支撑装置500顶部安装有用于培养细胞的培养架200；
培养架200包括底板210和横板220；
底板210上开设有进料孔211，进料孔211与雾化装置300的输出端对应；
横板220上开设有锥形的通孔221，若干通孔221的直径自上而下逐渐增加；
雾化装置300包括雾化器310、分料室320、输料管330；
雾化器310输出端与输料管330的一端固定安装；
输料管330的另一端还安装有分料室320；
分料室320安装在培养架200的底部，分料室320与进料孔211对应；
报警装置400包括旋钮410、触钮420；
旋钮410调节触钮420的伸出长度；
触钮420与培养架200触碰时触发报警；
支撑装置500包括底座510、伸缩套筒520、伸缩杆530、气泵540、输气管550；
底座510固定在外壳体100底部，底座510顶部靠近四个角的位置上固定安装有伸缩套筒520，伸缩套筒520内部活动连接有伸缩杆530；
底座510与气泵540通过输气管550连接。
工作时，将细胞及培养基倒入培养架200中，打开气泵540，使支撑装置500将培养架200撑起，调节旋钮410，使其可收获量时提醒结束培养，在培养的第3日开始，每隔一天打开雾化装置300，采用雾化的方式补料，待细胞及其分泌物增多，培养架200在垂直方向上向下位移，待培养到可收获量触发报警，培养结束。
以上技术方案具有以下效果：
由于细胞受重力影响在培养过程中更多的聚集在靠近底部的位置，在底部补料能更多满足不同浓度细胞的需求，且不会因为培养架200的移动影响进料，提高了进料的稳定性与细胞培养的需要。
实施例五
上述实施例通过分料室320提高培养的稳定性，但在培养时，时间越久细胞堆积越多，为进一步优化，提高培养加料以及细胞在培养过程中的均匀，进行进一步改进。
底板210上附有一层隔膜340；
隔膜340上均匀间隔开设有若干细孔；
当需要补料时，所加雾化料从隔膜340的细孔中喷出，隔膜340鼓起，给予了新料初速度，将堆积的细胞冲散。
通过隔膜340上均匀间隔开的细孔，可以确保所加的雾化料在培养区域内均匀分布。这有助于避免某些区域过度补料而其他区域补料不足，从而保证了细胞生长的均匀性；当隔膜340鼓起时，新料获得初速度，能够有效地将堆积的细胞冲散。这有助于维持细胞的单层生长，防止细胞堆积造成的生长不均和营养摄取不足。
实施例六
实施例五通过隔膜340的细孔提高培养的均匀度，为防止细胞堵塞隔膜340的细孔，进行进一步改进。
底板210安装有通孔针350；通孔针350与隔膜340的细孔一一对应；
当补料停止时，隔膜340不再鼓起，附着在底板210上，此时通孔针350从隔膜340的细孔中穿过，将堵塞的细胞或其分泌物疏通，便于下次使用。
通孔针350与隔膜340的细孔一一对应，当补料停止、隔膜340贴附在底板210上时，通孔针350能够穿过隔膜340的细孔；有助于疏通可能堵塞的细胞或其分泌物，确保补料通道畅通无阻，为下一次补料做好准备；通过及时、均匀的补料以及有效的细胞冲散，可以维持细胞的良好生长状态，提高细胞活性；有助于减少补料过程中可能出现的污染风险；由于补料是通过细孔进行的，且通孔针350能够疏通堵塞物，因此可以降低因操作不当或设备故障导致的污染可能性。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明精神和原则内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养方法为将CHO细胞在含铁、胱氨酸、半胱氨酸、铜、锰、精氨酸、组氨酸、赖氨酸的培养基中，提供过流加培养的方法，初始只使用基础培养基，后再补料加入其他成分；
其具体浓度折算为铁元素2.5mg/L，胱氨酸150mg/L，半胱氨酸50mg/L，铜元素O.025mg/L，锰元素0.0015mg/L，精氨酸1500mg/L，组氨酸280mg/L和赖氨酸1000mg/L。
2.如权利要求1所述的一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，其特征在于，培养方法具体为将CHO细胞在基础培养基中培养，并在第三天开始补料，补料频率为每隔一天一次，在第13天收获。
3.如权利要求2所述的一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，其特征在于，所述的基础培养基为HighPro 200，补料采用DN feed 3+DN feed B3。
4.如权利要求1所述的一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，其特征在于，所述的CHO细胞包括CHO-1、CHO-2、CHO-3、CHO-4。
5.如权利要求1所述的一种用于培养CH0细胞系细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养环境为37℃，5％二氧化碳，培养至第四天降温，温度为室温。
6.如权利要求1所述的一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养基包含铁，胱氨酸，半胱氨酸，铜，锰，精氨酸，组氨酸，赖氨酸，能够调控电荷异构体，降低酸性变体。
7.如权利要求1所述的一种用于培养CHO细胞系细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养基包含铁，胱氨酸，半胱氨酸，精氨酸，组氨酸，赖氨酸时，用于增加产量。
8.一种用于培养CHO细胞系细胞的培养设备，其特征在于，包括外壳体(100)、培养架(200)、雾化装置(300)、报警装置(400)、支撑装置(500)；
其中，外壳体(100)为长方体形，外壳体(100)内安装有隔板(110)；
隔板(110)将外壳体(100)内空间分为左腔、中腔、右腔，中腔空间大于左腔、右腔，外壳体(100)的中腔空间中安装有培养架(200)、报警装置(400)、支撑装置(500)，外壳体(100)的左腔和右腔内均装有雾化装置(300)；
外壳体(100)底部安装有支撑装置(500)和报警装置(400)；
支撑装置(500)顶部安装有用于培养细胞的培养架(200)；
培养架(200)包括底板(210)和横板(220)；
底板(210)上开设有进料孔(211)，进料孔(211)与雾化装置(300)的输出端对应；
横板(220)上开设有锥形的通孔(221)，且若干通孔(221)的直径自上而下逐渐增加；雾化装置(300)包括雾化器(310)、分料室(320)、输料管(330)；
雾化器(310)输出端与输料管(330)的一端固定连接；
输料管(330)的另一端还安装有分料室(320)；
分料室(320)安装在培养架(200)的底部，分料室(320)与进料孔(211)对应；
报警装置(400)包括旋钮(410)、触钮(420)；
旋钮(410)调节触钮(420)的伸出长度；
触钮(420)与培养架(200)触碰时触发报警；
支撑装置(500)包括底座(510)、伸缩套筒(520)、伸缩杆(530)、气泵(540)、输气管(550)；
底座(510)固定在外壳体(100)底部，底座(510)顶部靠近四个角的位置上固定安装有伸缩套筒(520)，伸缩套筒(520)内部活动连接有伸缩杆(530)；
底座(510)与气泵(540)通过输气管(550)连接。
9.如权利要求8所述的一种用于培养CH0细胞系细胞的培养设备，其特征在于，底板(210)上附有一层隔膜(340)；隔膜(340)上均匀间隔开设有若干细孔。
10.如权利要求9所述的一种用于培养CHO细胞系细胞的培养设备，其特征在于，底板(210)安装有通孔针(350)；通孔针(350)与隔膜(340)的细孔一一对应。
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