CN117660231A

CN117660231A - 一株具有骨质疏松预防功效的可发酵生产骨肽的嗜酸乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN117660231A
Application number: CN202311584928.4A
Authority: CN
Inventors: 温宇旗; 李云芳; 周金龙; 王文清; 王小龙; 何晓婷; 杨海英
Original assignee: Inner Mongolia Mengtai Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia Mengtai Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2023-11-27
Filing date: 2023-11-27
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明提供一株具有骨质疏松预防功效的可发酵生产骨肽的嗜酸乳杆菌及其应用，属于生物技术领域，嗜酸乳杆菌命名为嗜酸乳杆菌LA01，16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，来源于内蒙古自治区鄂尔多斯市乌审旗牧民草场的风化牛羊骨样本；嗜酸乳杆菌LA01发酵降解产生骨肽应用于制备骨肽液体饮品：S1、骨泥的制备；S2、嗜酸乳杆菌LA01菌种活化；S3、嗜酸乳杆菌LA01菌液的制备；S4、嗜酸乳杆菌LA01菌液的制备；S5、嗜酸乳杆菌LA01冻干菌粉的制备；S6、骨肽液体饮品的制备；S7、保存；还可用于制备益生菌骨肽胶囊，嗜酸乳杆菌LA01发酵降解产生骨肽可应用于促进骨骼生成、预防骨质疏松。

Description

一株具有骨质疏松预防功效的可发酵生产骨肽的嗜酸乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有骨质疏松预防功效的可发酵生产骨肽的嗜酸乳杆菌及其应用。

背景技术

骨质疏松（Osteoporosis）是一种由于骨代谢异常导致的全身性慢性骨骼疾病，这种疾病常见于中老年人，但在少数情况下也可以影响到年轻人，其临床症状通常表现为腰背和四肢疼痛、椎体变形、身高减少、严重者易导致骨折及骨科手术预后康复效果较差等。

骨肽是一种蛋白质分子，它在骨骼组织中发挥了重要作用，具体来说，骨肽是一种由氨基酸组成的多肽，主要存在于骨骼中的胶原蛋白分子中,它有助于维持骨骼的结构和稳定性，并在骨骼的生长、修复和再生过程中发挥关键作用；骨肽也可以作为一种生物标志物，用于评估骨骼健康和疾病的风险，例如骨折风险和骨质疏松症。

牛羊骨经乳酸菌发酵制备的骨肽是一种富含甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和谷氨酸的动物性生物活性肽，能直接参与蛋白质的合成，提高机体对蛋白质的利用率，相比于临床上常用的类固醇类激素、雌激素替代疗法、特立帕肽等存在潜在药物依赖性、耐受性等不良反应的药物，使用天然来源于草场风化牛羊骨分离得到的乳酸菌及其发酵产物，同时可以补充氨基酸、蛋白质、益生菌和益生元，普适性强、适用范围广，且不存在药物依赖和耐受性。

基于此，亟待一种乳酸菌杆菌，用来发酵制备骨肽以促进骨骼生成、预防骨质疏松。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一株嗜酸乳杆菌LA01，嗜酸乳杆菌作为一种常用于乳制品和保健品的公认安全的食品资源，经过发酵能够产生种类丰富的酸性蛋白酶，用于骨粉中多肽的分解释放，提升骨粉的营养价值，具体如下：

一株嗜酸乳杆菌LA01，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 28354，保藏日期为2023年09月05日，分类命名为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。

而且，所述嗜酸乳杆菌LA01来源于内蒙古自治区鄂尔多斯市乌审旗牧民草场的风化牛羊骨样本。

而且，使用发酵培养基对嗜酸乳杆菌LA01进行上罐发酵，所述发酵菌株的生长稳定期的pH值为4.4-4.5，生物量为1.05±0.15×10¹⁰CFU/mL。

发酵培养基成分如下：乳清粉 20 g/L，牛肉浸膏18.7 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米浆粉27.9 g/L，白砂糖70 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰 0.25 g/L，乙酸钠 2.2 g/L，磷酸氢二钾 2.0 g/L，灭菌前校正pH至6.0。

而且，所述嗜酸乳杆菌LA01利用葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖产酸，其中葡萄糖经初级代谢的发酵产物为乳酸, 为同型乳酸发酵，所产生乳酸构型为DL型。

而且，所述嗜酸乳杆菌LA01为兼型好氧菌, 革兰氏阳性；所述嗜酸乳杆菌LA01的形态特征为：不形成芽孢、无鞭毛、不运动、两端钝圆，大小为 (0.5-1)×(2-8) μm。

另一方面，本发明提供了嗜酸乳杆菌LA01的应用，将嗜酸乳杆菌LA01发酵降解产生骨肽，应用于制备益生菌产品。

而且，用于制备骨肽液体饮品，包括如下步骤：

S1、骨泥的制备：将新鲜牛羊骨或骨骼的碎片清洁并消毒后煮沸，湿法粉碎至粒径为20-70 μm的骨泥；

S2、嗜酸乳杆菌LA01菌种活化：挑取嗜酸乳杆菌LA01单菌落划线于 MRS乳酸菌培养基上，35-38℃条件下恒温培养40-55 h，得到单菌落；于无菌环境下挑取单菌落接种于MRS乳酸菌培养基中，35-38℃条件下静置培养15-20 h；按照上述步骤连续活化两代，得到活化菌体；

S3、嗜酸乳杆菌LA01菌液的制备：把活化菌体按照体积比为1:20-50的接种量接种于 MRS乳酸菌培养基中，35-38℃条件下恒温培养15-20 h，得到嗜酸乳杆菌LA01菌液；

S4、嗜酸乳杆菌LA01菌悬液的制备：将菌液经离心8-12min压滤得到菌泥，菌泥经生理盐水清洗3次后，用终浓度为100 g/L的灭菌脱脂乳粉溶液作为保护剂重悬得到嗜酸乳杆菌LA01菌悬液，所述嗜酸乳杆菌LA01菌悬液的终浓度为不低于5×10⁹-5×10¹⁰g/L；

S5、嗜酸乳杆菌LA01冻干菌粉的制备：将制备的嗜酸乳杆菌LA01菌悬液在35-38℃条件下预培养0.5-1.5 h后使用真空冻干机冻干，得到嗜酸乳杆菌LA01冻干菌粉；

S6、骨肽液体饮品的制备：将步骤S1制备的骨泥经150-170℃干热灭菌50-70 min后冷却至4℃，得到灭菌骨泥原料，向灭菌骨泥原料中加入终浓度不低于1×10⁶CFU/mL活菌数的嗜酸乳杆菌LA01冻干菌粉，35-38℃条件下持续发酵15-21 h得到骨肽液体饮品；

S7、将骨肽液体饮品在4℃条件下冷链保存或使用超高温瞬时灭菌后经无菌灌装再于常温保存。

而且，所述液体饮料中的嗜酸乳杆菌LA01的活菌数超过1.4×10⁶CFU/mL。

而且，用于制备益生菌骨肽固态产品，所述固态产品为益生菌骨肽胶囊，制备方法如下：

将1公斤经嗜酸乳杆菌LA01发酵后的骨泥与0.4-0.6kg食品级碳酸钙、0.15-0.25mg维生素D以及8-12g脱脂乳粉保护剂复配混合，喷雾干燥后得到益生菌骨肽粉，灌装于胶囊中，得到益生菌骨肽胶囊；所述1公斤经嗜酸乳杆菌LA01发酵后的骨泥中含嗜酸乳杆菌约为1.5×10¹¹CFU。

而且，所述益生菌骨肽胶囊在4℃条件下储存3个月后活菌数为（2.02±0.32×10⁹CFU/100 g。

另一方面，本发明提供的嗜酸乳杆菌LA01发酵降解产生骨肽用于促进骨骼生成、预防骨质疏松。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种嗜酸乳杆菌LA01，利用该菌发酵降解产生的骨肽可促进骨骼生成、预防骨质疏松；

2、本发明提供了一种嗜酸乳杆菌LA01，并将其应用于骨肽液体饮品和益生菌骨肽胶囊，同时提供了骨肽液体饮品和益生菌骨肽胶囊的制备方法，所制备液体饮料中的嗜酸乳杆菌LA01的活菌数超过1.4×10⁶CFU/mL，高于食品国家安全标准GB7101-2022中对于乳酸菌饮料中益生菌活菌的添加量不低于106 CFU/mL的要求；所制备益生菌骨肽胶囊在4℃条件下储存3个月后活菌数为（2.02±0.32）×10⁹CFU/100g，高于食品国家安全标准的要求（106 CFU/g），具有工业发展前景。

附图说明

图1为实施例1中嗜酸乳杆菌LA01发酵过程中的生长曲线和pH变化曲线；

图2为实施例2中嗜酸乳杆菌LA01发酵上清液中总蛋白含量和生产骨肽的蛋白酶酶活柱状图；

图3为实施例3中为骨肽液体饮料发酵过程中生物量和骨肽含量变化曲线；

图4为实施例4中益生菌骨肽活菌胶囊3个月内的骨肽含量和活菌数变化曲线；

图5为实施例5中大鼠每周进食量变化曲线；

图6为实施例5中大鼠体重、骨转化率统计曲线；

图7为实施例5中大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化关键基因Runx2的mRNA差异转录表达水平柱状图。

具体实施方式

实施例1 嗜酸乳杆菌LA01分离培养和利用嗜酸乳杆菌LA01发酵产酸研究

将嗜酸乳杆菌LA01分离培养，乳酸菌分离样本来源于不同地区的风化牛羊骨，具体分离培养步骤如下：

一次分离10份样本，对每份样本做好编号和记录，每份样品称取约1g，分别加入20/250 mL MRS乳酸菌培养基中，37℃、150rpm条件下，摇床富集培养6h，每份样品取100μL富集培养后的MRS乳酸菌培养基，涂MRS乳酸菌培养基平板，每份样品重复涂三个平板。

除乳酸菌外的其它微生物在pH偏酸性的MRS乳酸菌培养基上不易生长，因而能够十分容易的筛选到环境样品中的乳酸菌，其中来源于内蒙古自治区鄂尔多斯市乌审旗牧民草场的风化牛羊骨样本的一株乳酸菌菌株因其菌落生长速率较快，且经生理生化鉴定能够发酵利用骨粉快速生长，对其命名为“嗜酸乳杆菌LA01”，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

将SEQ ID NO.1的序列在NCBI GeneBank序列比对所得结果显示该菌株为乳杆菌属（Lactobacillus）嗜酸乳杆菌种（acidophilus）。

经微生物生理生化鉴定，嗜酸乳杆菌LA01为兼型好氧菌, 革兰氏阳性, 不形成芽孢、无鞭毛、不运动、两端钝圆，菌体生长较粗壮，大小一般在(0.5- 1)×(2- 8)μm，琼脂平板上菌落较小、扁平、圆形和近似圆形，能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖产酸，其中葡萄糖经初级代谢后主要发酵产物为乳酸, 为同型乳酸发酵，所产生乳酸构型为DL型。

得到的嗜酸乳杆菌LA01菌株发酵过程中的生长曲线和pH变化曲线，具体如图1所示，从图1可以看出, 接种初期发酵液pH值下降很快，直到菌株达到生长稳定期（20至24小时之间）后发酵液pH值达到一个平衡（pH=4.4-4.5）；生物量的指数增长稍滞后于pH值，最终稳定在（1.05±0.15）×10¹⁰CFU/mL左右，说明该菌通过初级代谢后将糖发酵产酸的同时，获得能量用于生长繁殖，最终达到一个相对较高的生物量水平。

实施例2 嗜酸乳杆菌LA01发酵骨泥相关蛋白酶研究

使用发酵培养基培养至20小时稳定期后得到的发酵骨泥，离心6000rpm、15min去除菌体，将所得上清液在4℃条件下冷冻干燥后，脱盐去除蛋白酶酶活的潜在抑制成分，最终浓缩100倍后定容到10 ml的pH=4.5的100 mM Tris-Cl缓冲溶液中，对得到的分泌蛋白进行蛋白含量测定，并取终浓度为1mg/ml的总蛋白，利用福林酚法测定其中降解骨泥的蛋白酶酶活，将每分钟反应生成1 μM含有酚基的氨基酸，如酪氨酸所需要的酶量定义为1个酶活单位（U）。

测定降解骨泥的蛋白酶酶活的具体实验操作方法为：取50 μL 浓度为1 %（w/v）骨蛋白（货号：BES-13825PA），终浓度为1mg/ml酶液450 μL，与浓度为0.1 mol/L，pH 4.5的1.5mL乙酸钠缓冲液混合，在37 ℃下保温5 min，随后用0.5 mL、10 %的三氯乙酸终止反应，在280 nm 处测定吸光值。

三次生物学重复所得浓缩后的总蛋白浓度和对应的蛋白酶酶活如图2所示，可以看出，嗜酸乳杆菌LA01发酵液中蛋白含量约占上清液的2.0%-2.9%（w/v），其中蛋白酶酶活约3245.0±1010.7 U/mg；因此可以证明，相比其他乳杆菌例如植物乳杆菌等报道的蛋白酶活性更高，本发明提供的嗜酸乳杆菌LA01在发酵骨泥生成多肽类物质方面更具有潜力。

实施例3 嗜酸乳杆菌LA01发酵制备骨肽液体饮料的应用

1、嗜酸乳杆菌LA01发酵骨泥制备骨肽液体饮料

骨泥的制备：清洁并消毒新鲜牛羊骨或骨骼的碎片，以确保其卫生，将骨头或碎片煮沸，以杀灭任何潜在的有害微生物，使用锤式粉碎机将牛羊骨粉碎至颗粒状态，随后使用湿法粉碎装置将其进一步粉碎为粒径为50μm的骨泥，以便更好地发酵和提取骨肽。

嗜酸乳杆菌LA01菌种活化和冻干菌粉的制备：挑取嗜酸乳杆菌LA01单菌落划线于MRS乳酸菌培养基上，37℃条件下恒温培养48 h，得到单菌落；于无菌环境下使用接种环挑取单菌落接种于 MRS乳酸菌培养基中，37℃条件下静置培养18 h；按照上述步骤连续活化两代，得到活化菌体；把活化菌体按照1:20至1:50（v/v）的接种量范围接种于 MRS乳酸菌培养基中，37℃条件下恒温培养18 h，得到嗜酸乳杆菌LA01菌液；将菌液使用高速离心机6000g离心10 min或使用板框压滤机压滤得到菌泥；菌泥经生理盐水清洗3次后，用终浓度为100g/L的灭菌脱脂乳粉溶液作为保护剂重悬得到嗜酸乳杆菌LA01终浓度为不低于5×10⁹至1×10¹⁰的菌悬液；将制备的菌悬液在37℃条件下预培养1 h后使用真空冻干机冻干，得到用于下一步骨泥发酵的冻干菌粉。

利用嗜酸乳杆菌LA01发酵骨泥获得骨肽：将骨泥在160℃干热灭菌60 min后冷却至4℃，得到原料；在发酵罐中向灭菌骨泥原料里加入终浓度不低于1 × 10⁶CFU/mL活菌数的嗜酸乳杆菌LA01菌粉，37℃条件下持续发酵18小时得到骨肽液体饮料；将所得的饮品于4℃条件下冷链保存或使用超高温瞬时灭菌（UHT）后经无菌灌装再于常温保存。

2、骨肽液体饮料发酵活菌数及营养成分含量鉴定

（1）嗜酸乳杆菌活菌数检测

采样及样品稀释：使用灭菌的采样工具，以无菌操作取25 mL骨肽液体饮料，置于225 mL含灭菌生理盐水的灭菌广口瓶中，充分震荡混匀，得到1:10稀释液；按照国标GB4789.35-2016中乳酸菌数测定标准，用灭菌生理盐水作10倍递增梯度稀释；选取2到3个合适的稀释倍数（如1:1000000和1:10000000），吸取对应稀释度的稀释液1 mL于灭菌的9 cm直径平皿；随即注入15-20 mL冷却至50℃的嗜酸乳杆菌鉴别培养基-改良MC培养基，并混合均匀，待培养基充分凝固后倒置平板于36±1 ℃恒温培养72 h；以1 mL灭菌生理盐水作为空白对照，重复一组上述操作，用以保证灭菌器材的无菌性；选取菌落数在30-300之间的稀释倍数进行活菌数计数和菌落特征鉴别，嗜酸乳杆菌在改良MC培养基上应呈较小的圆形红色菌落（直径2±1 mm），边缘呈星状，菌落周围偶有较淡的晕；经检测，发酵结束18 h时，骨肽液体饮料中含1.4×10⁸CFU/mL的嗜酸乳杆菌活菌，满足食品国家安全标准GB7101-2022中对于乳酸菌饮料中益生菌活菌的添加量不低于10⁶CFU/mL的要求。

（2）骨肽蛋浓度检测

使用购自赛默飞世尔公司的Pierce 定量肽检测试剂盒（货号：23275），对骨肽发酵产物及骨肽液体饮料中的多肽浓度进行检测；将10 μL离心后的骨肽液体饮料中的上清成分样品和70 μL Fluorometric Peptide Assay Buffer及20 μL Fluorometric PeptideAssay Reagent充分混合，并于37℃条件下孵育5 min；之后在390 nm发射波长/475nm激发光波长、光程10 mm的条件下，用紫外可见荧光分光光度计测定样品吸光度数值；同时以终浓度为0，50，100，200，300，500，800 µg/mL的成骨生长肽（十四肽，货号O873897）作为标准品、以不添加菌液的骨泥底物离心后的上清液作为空白对照参比，重复上述测定步骤，扣除空白对照的荧光值，通过标准曲线换算发酵过程中骨肽产量变化，结果见图3，从图3可以看出，随着发酵过程的进行，发酵活菌数和骨肽含量都随时间而逐步升高，在发酵结束的18小时时间点取样分析，嗜酸乳杆菌LA01的活菌数超过1.4×10⁸CFU/mL，发酵过程中分解骨泥中的蛋白质得到的多肽终浓度约115±5.0 mg/L，18小时净生成骨肽量超过90 mg/L，骨肽合成平均速率约5.19 mg/L/h。

实施例4 嗜酸乳杆菌LA01发酵制备益生菌骨肽固态产品的应用

将每公斤嗜酸乳杆菌LA01发酵后的骨泥（含嗜酸乳杆菌约1.5×10¹¹CFU），与0.5kg食品级碳酸钙，0.2 mg维生素D以及10g脱脂乳粉保护剂复配混合后，使用QFN-VSD-2型喷雾干燥机在进风口温度150-180℃、出风口温度70-85℃、进料流速0.03 L/min的条件下将骨肽产品喷雾干燥，制备益生菌骨肽粉。

测定所得的益生菌骨肽粉的嗜酸乳杆菌活菌数和4℃条件下储存3个月内的存活率，同时测定其中总蛋白含量，图4显示了益生菌骨肽活菌胶囊3个月内的骨肽含量和活菌数，结果显示，3个月储存后，活菌胶囊中的嗜酸乳杆菌LA01从初始的活菌数（5.10±0.10）×10⁹CFU/100 g逐渐降低至4℃储存3个月后的（2.02±0.32）×10⁹CFU/100 g，存活率约为34%-45%，期间骨肽浓度基本上没有显著变化，浓度约为100 mg/g，证明采用上述喷雾干燥条件，储存三个月后的骨肽粉中的骨肽含量仍保持稳定，高于国家标准（10⁶CFU/g）。

实施例5 嗜酸乳杆菌LA01发酵降解产生骨肽预防骨质疏松生物活性验证

1、嗜酸乳杆菌发酵生物骨肽SD大鼠喂养实验

利用SPF级SD雌性大鼠（体重63±12 g）26只，随机分为实验组和对照组，两组每组各13只。

实验组：利用SPF级SD雌性大鼠（体重63±12 g）13只，每日饲喂含嗜酸乳杆菌LA01的混合鼠粮，所述混合鼠粮为未经碳酸钙、维生素D和脱脂乳粉复配的益生菌骨肽粉末（嗜酸乳杆菌LA01发酵后的骨泥直接喷雾干燥）和实验室清洁级鼠粮按照1：9比例配置成的混合鼠粮，并每周称量记录大鼠进食量和体重变化，并计算大鼠食物利用率，考察生物发酵骨肽对其食物利用率的影响，结果如图5、图6所示。

对照组:以SPF级SD雌性大鼠（体重63±12 g）13只，每日正常饲喂实验室清洁级鼠粮,每周称量记录大鼠进食量和体重变化，并计算大鼠食物利用率，考察生物发酵骨肽对其食物利用率的影响，结果如图5、图6所示。

图5为喂食益生菌骨肽大鼠每周进食量变化曲线，图5实验结果表明，乳酸菌的添加对饲养前期大鼠的食欲有一点程度的促进作用，随着大鼠鼠龄的增加，实验组和对照组大鼠每周进食量都呈现上涨趋势，后期随着大鼠日龄增加（4周培养至8周）进食量和生长速率趋于稳定，差异幅度减小。

在28天喂养实验结束后，同时向实验组及对照组的大鼠腹腔注射过量1%戊巴比妥（40 mg/kg），解剖测量骨骼重量增量并计算骨转化率，结果如图6所示，

图6为喂食益生菌骨肽大鼠体重、骨转化率统计曲线，从图6可以看出，虽然实验组大鼠和对照组相比，食物利用率没有显著区别，甚至实验组体重略有降低，但相比对照组大鼠，进食生物发酵骨肽的实验组的骨骼干重有提升，骨骼干重占大鼠总体重的比率提升更为显著，说明食用嗜酸乳杆菌LA01生产生物骨肽对幼龄大鼠的骨骼生长发育具有正面促进作用。

2、骨髓间充质干细胞骨相分化关键基因Runx2转录水平检测

为尝试从分子和细胞微观层面研究发酵生产提纯得到的骨肽对促进骨骼生成、预防骨质疏松的作用，故同时设计实验使用SD大鼠骨髓间充质干细胞（货号：STCC5011G）和进行干细胞骨向分化关键基因Runx2的mRNA转录表达水平检测：

设计培养基中添加终浓度5 μg/mL经反相色谱纯化并且过滤除菌后的提纯骨肽纯品作为实验组，并以不向骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基中添加骨肽作为对照组。

骨肽纯品由实施例1中使用发酵培养基培养发酵得到的骨肽混合物经RP-HPLC反相高效液相色谱分离提纯（流动相0-70%乙腈水溶液，C18反相色谱柱ACE 5 C18-300，流速1.0 ml/min，洗脱时间42±2min，检测波长210 nm），随后经脱盐柱脱盐、冷冻干燥步骤，得到骨肽纯品。

将SD大鼠骨髓间充质干细胞悬液按5×10⁴细胞/孔接种于6孔板，用骨髓间充质干细胞完全培养基培养12h后，培养基替换为SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基（SD大鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175 mL，成骨诱导分化专用血清20 mL，双抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，抗坏血酸400 μL，β-甘油磷酸钠2 mL，地塞米松20 μL，实验组额外添加5 mg/mL提纯后的骨肽纯品200 μL），并进行成骨诱导5 天。期间培养第3天换液，并于第5天终止培养，吸尽SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养液，并用PBS漂洗3次，提取细胞总RNA，逆转录得到cDNA。以GAPDH基因作为内参基因，通过qPCR法检测目标基因Runx2的相对表达量。目的基因表达量按2^−ΔΔCt法计算。

实验涉及的PCR引物为：

Runx2基因

Runx2-F:GAACCAAGAAGGCACAGAC

Runx2-R:AATGCGCCCTAAATCACTG

GAPDH基因

GAPDH-F:TCTTTGCTTGGGTGGGT

GAPDH-R:GGGTCTGGCATTGTTCT

以GAPDH基因作为内参基因，换算Runx2的相对表达量，得到实验组与对照组的干细胞骨向分化关键基因Runx2的mRNA转录水平如图7所示。

从图7可以看出，在额外添加终浓度5 μg/mL的发酵后分离提纯的骨肽纯品，对增加Runx2的表达刺激成骨细胞增殖而诱导骨形成有促进作用。相比不添加骨肽纯品的对照组，SD大鼠骨髓间充质干细胞骨相分化关键基因Runx2转录水平提升1.20倍。Runx2是转录因子RunxX家族成员之一，是干细胞骨向分化过程的产物，参与了骨代谢调控以及成骨细胞的分化，对骨组织的形成和重建十分重要。从本实验结果出发推测，实验组添加终浓度0.5μg/mL的骨肽与对照组相比Runx2的表达差异明显（t检验P值=0.0307<0.05），显著诱导了干细胞骨向分化基因表达，从而能够刺激成骨细胞增殖而诱导骨骼的形成。

综上所述，上述实验结果在个体层面和分子层面，证明了向大鼠饲喂嗜酸乳杆菌LA01生物发酵产物对幼龄大鼠的骨骼生长发育具有正向促进作用，同时用提纯后的骨肽能够在一定程度上促进大鼠脂肪间质干细胞向成骨细胞分化，对于促进成骨细胞形成并进一步预防骨质疏松，具有一定程度的积极作用。

Claims

1.一株嗜酸乳杆菌LA01，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA01的16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 28354，保藏日期为2023年09月05日。

2.如权利要求1所述的一株嗜酸乳杆菌LA01，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA01来源于内蒙古自治区鄂尔多斯市乌审旗牧民草场的风化牛羊骨样本。

3.如权利要求1所述的一株嗜酸乳杆菌LA01，其特征在于，对嗜酸乳杆菌LA01进行发酵，所述发酵菌株的生长稳定期的pH值为4.4-4.5，生物量为1.05±0.15×10¹⁰ CFU/mL。

4.如权利要求1所述的一株嗜酸乳杆菌LA01，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌LA01为兼型好氧菌, 革兰氏阳性；所述嗜酸乳杆菌LA01的形态特征为：不形成芽孢、无鞭毛、不运动、两端钝圆，大小为 (0.5-1)×(2-8) μm。

5.权利要求1-4任一项所述的嗜酸乳杆菌LA01的应用，其特征在于，将嗜酸乳杆菌LA01发酵降解产生骨肽，应用于制备益生菌产品。

6.如权利要求5所述的嗜酸乳杆菌LA01的应用，其特征在于，用于制备骨肽液体饮品，包括如下步骤：

S2、嗜酸乳杆菌LA01菌种活化：挑取嗜酸乳杆菌LA01单菌落划线于 MRS乳酸菌培养基上，35-38℃条件下恒温培养40-55 h，得到单菌落；于无菌环境下挑取单菌落接种于 MRS乳酸菌培养基中，35-38℃条件下静置培养15-20 h；按照上述步骤连续活化两代，得到活化菌体；

S3、嗜酸乳杆菌LA01菌液的制备：把活化菌体按照体积比为1:20-50的接种量接种于MRS乳酸菌培养基中，35-38℃条件下恒温培养15-20 h，得到嗜酸乳杆菌LA01菌液；

S4、嗜酸乳杆菌LA01菌悬液的制备：将菌液经离心8-12min压滤得到菌泥，菌泥经生理盐水清洗3次后，用灭菌脱脂乳粉溶液作为保护剂重悬得到嗜酸乳杆菌LA01菌悬液，所述嗜酸乳杆菌LA01菌悬液的终浓度为不低于5×10⁹-5×10¹⁰g/L；

S5、嗜酸乳杆菌LA01冻干菌粉的制备：将嗜酸乳杆菌LA01菌悬液在35-38℃条件下预培养0.5-1.5 h后冻干，得到嗜酸乳杆菌LA01冻干菌粉；

7.如权利要求6所述的嗜酸乳杆菌LA01的应用，其特征在于，所述液体饮料中的嗜酸乳杆菌LA01的活菌数超过1.4×10⁶ CFU/mL。

8.如权利要求5所述的嗜酸乳杆菌LA01的应用，其特征在于，用于制备益生菌骨肽固态产品，所述固态产品为益生菌骨肽胶囊，制备方法如下：

将1公斤经嗜酸乳杆菌LA01发酵后的骨泥与0.4-0.6kg食品级碳酸钙、0.15-0.25mg维生素D以及8-12g脱脂乳粉保护剂复配混合，喷雾干燥后得到益生菌骨肽粉，灌装于胶囊中，得到益生菌骨肽胶囊；所述1公斤经嗜酸乳杆菌LA01发酵后的骨泥中含嗜酸乳杆菌约为1.5×10¹¹ CFU。

9.如权利要求5所述的嗜酸乳杆菌LA01的应用，其特征在于，用于促进骨骼生成、预防骨质疏松。