CN117658940A - 一种基于碱性染料的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于碱性染料的近红外荧光探针及其制备方法和应用，所述探针的中文名称：4‑(2‑氨基‑4‑甲基戊酰胺基)苄基3,7‑双(二乙基氨基)‑10H‑吩恶嗪‑10‑甲酸酯。所述探针用于检测亮氨酸氨基肽酶(LAP)，碱性蓝3作为荧光团，L‑亮氨酸作为LAP的识别位点。探针与LAP作用时，亮氨酸被水解，通过自焚基团释放出碱性蓝3荧光团，发出红色荧光，该探针可用于亮氨酸氨基肽酶的检测，且检测信号明显，反应溶液颜色变化肉眼可见，为生物检测提供了一种有效的亮氨酸氨基肽酶视觉荧光追踪工具。
Description
技术领域
本发明涉及碱性染料和荧光检测，具体属于一种基于碱性染料的荧光探针及其制备方法，以及探针在检测亮氨酸氨基肽酶中的应用。
背景技术
亮氨酸氨基肽酶(LAP)是一种重要的金属肽酶，它选择性地催化蛋白质和多肽N末端的亮氨酸残基的水解性去除。重要的是，研究人员报道了病变肝细胞比正常肝细胞具有更高的LAP活性。因此，LAP可以作为区分病变肝细胞和正常肝细胞的特异性标志物。亮氨酸氨基肽酶作为生命系统中重要的水解酶，进一步研究其生物分布和生理作用有利于对其进行有效的干预，以预防相关主要疾病的发生和发展。随着有机合成技术的改进，制备了基于碱性染料的高性能荧光探针，可作为生命系统中有效的亮氨酸氨基肽酶视觉荧光追踪工具。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于碱性染料的近红外荧光探针及其制备方法，以及将该荧光探针用于特异性检测亮氨酸氨基肽酶。
本发明提供的一种基于碱性染料用于检测亮氨酸氨基肽酶的荧光探针，其化合物中文名称：4-(2-氨基-4-甲基戊酰胺基)苄基3,7-双(二乙基氨基)-10H-吩恶嗪-10-甲酸酯；其英文名称：4-(2-amino-4-methylpentanamido)benzyl3,7-bis(diethylamino)-10H-phenoxazine-10-carboxylate
结构式如下：
本发明提供的一种基于碱性染料用于检测亮氨酸氨基肽酶的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将碱性蓝3和碳酸钠溶于二氯甲烷与水混合物中在氮气保护下搅拌并加热至45℃，并在此温度下缓慢加入用水溶解的连二亚硫酸钠，将混合物在45℃下反应至溶液由蓝色变为紫红色，反应完毕后停止加热并保持搅拌10min，静置至体系分层；等体系冷却至室温，在冰浴条件下缓慢加入用二氯甲烷溶解的三光气，反应1小时后停止反应，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相，旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色固体目标产物，即为产物1；投料摩尔比为碱性蓝3：碳酸钠：连二亚硫酸钠：三光气＝1:4:4:2；
(2)将对氨基苯甲醇,2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)和Fmoc-L-亮氨酸溶于二氯甲烷中，室温下搅拌，反应24小时后结束反应；旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色固体目标产物，即为产物2；投料摩尔比为对氨基苯甲醇：2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉：Fmoc-L-亮氨酸＝1.1:1.1:1；
(3)将产物1，产物2，4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)和无水碳酸钠溶于二氯甲烷中，室温下氮气保护反应8小时后结束反应。旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色固体目标产物，即为产物3；投料摩尔比为产物1：产物2：4-(二甲氨基)吡啶：无水碳酸钠＝1：1.2：1：3；
(4)将产物3溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，常温下滴加哌啶，1小时后结束反应，给体系加入大量的水，用乙酸乙酯萃取三次；旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色色固体目标产物，即为权利要求1所述的荧光探针。
本发明提供的一种检测亮氨酸氨基肽酶的方法，步骤为：
(1)配制pH 7.4的10mM的磷酸缓冲盐溶液；将如上所述的荧光探针溶于二甲基亚砜配制成2mM的储备液；将亮氨酸氨基肽酶冻干粉溶于水配制30U/mL的亮氨酸氨基肽酶储备液；
(2)荧光光谱：取478.3μL的磷酸缓冲盐溶液、5μL荧光探针储备液、16.7μL的亮氨酸氨基肽酶储备液加入到比色皿中，37℃下反应4h后以620nm激发光进行荧光光谱扫描，时间为0min，15min，30min，45min，60min，120min，180min，240min；
(3)动力学曲线：取478.3μL的磷酸缓冲盐溶液、5μL荧光探针储备液、16.7μL的亮氨酸氨基肽酶储备液加入到比色皿中，37℃下反应4h后以620nm激发波长进行动力学扫描，时长为4800s；
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明荧光探针可灵敏、快速地检测亮氨酸氨基肽酶；
2、本发明技术操作较为简单，检测简便，仅需荧光检测器；
3、本发明检测信号明显，反应溶液颜色变化肉眼可见。
附图说明
图1实施例1制备的荧光探针的核磁共振氢谱图
图2实施例1制备的荧光探针的核磁共振氢碳图
图3实施例1制备的荧光探针的高分辨率质谱图
图4实施例2荧光探针与亮氨酸氨基肽酶响应的荧光光谱图
图5实施例3荧光探针与亮氨酸氨基肽酶响应后，676nm处的荧光强度值随时间变化图
图6实施例4荧光探针孵育细胞的细胞成像图
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
荧光探针的合成和表征：
(1)将1795mg碱性蓝3(5mmol)、2120mg碳酸钠(20mmol)溶于二氯甲烷(15mL)和水(10mL)混合物中在氮气保护下搅拌并加热至45℃，并在此温度下缓慢加入用水溶解的3282mg连二亚硫酸钠(20mmol)，将混合物在45℃下反应至溶液由蓝色变为紫红色，反应完毕后停止加热并在保持搅拌10min，静置至体系分层；等体系冷却至室温，在冰浴条件下缓慢加入用二氯甲烷溶解的2960mg三光气(10mmol)。反应1小时后停止反应；用二氯甲烷萃取三次，收集有机相，旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色固体目标产物，即为产物1；
(2)将1550mg对氨基苯甲醇(2.59mmol),3150mg 2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)(2.59mmol)和4150mg Fmoc-L-亮氨酸(2.35mmol)溶于二氯甲烷中，室温下搅拌，反应24小时后结束反应，旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色固体目标产物，即为产物2；
(3)将387mg产物1(1mmol)，458mg产物2(1.2mmol)，122mg 4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)(1mmol)和318mg无水碳酸钠(3mmol)溶于二氯甲烷中，室温下氮气保护反应8小时后结束反应；旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色固体目标产物，即为产物3；
(4)将16mg产物3(0.02mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，常温下滴加0.25mL哌啶。1小时后结束反应；给体系加入大量的水，用乙酸乙酯萃取三次，旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色色固体目标产物，即为权利要求1所述的荧光探针。
图1表示了荧光探针的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
荧光探针：1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.65(d,J＝8.5Hz,2H),7.34(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(d,J＝9.0Hz,2H),6.39(dd,J＝9.1,2.8Hz,2H),6.32(d,J＝2.8Hz,2H),5.14(s,2H),3.38(dd,J＝8.7,5.6Hz,1H),3.30(q,J＝6.9Hz,8H),1.74(tt,J＝13.2,6.6Hz,1H),1.49(ddd,J＝13.6,8.2,5.7Hz,1H),1.39–1.32(m,1H),1.06(t,J＝7.0Hz,12H),0.90(dd,J＝12.4,6.6Hz,6H).
图2表示了荧光探针的核磁共振氢谱(1C NMR)图。
荧光探针：13C NMR(126MHz,DMSO)δ174.75,153.51,151.21,146.44,139.25,131.24,129.21,125.64,119.46,116.86,106.65,99.10,67.59,54.16,44.26,24.64,23.60,22.35,12.78.
图3表示了荧光探针的高分辨率质谱图。
荧光探针：.Calc.for C34H46N5O4 +[M+H]+588.3550,found 588.3560
实施例2
(1)配制pH 7.4的10mM的磷酸缓冲盐溶液；将实施例1制备的荧光探针溶于二甲基亚砜配制成2mM的储备液；将亮氨酸氨基肽酶冻干粉溶于水配制30U/mL的亮氨酸氨基肽酶储备液；
(4)荧光光谱：取478.3μL的磷酸缓冲盐溶液、5μL荧光探针储备液、16.7μL的亮氨酸氨基肽酶储备液加入到比色皿中，37℃下反应4h后以620nm激发光进行荧光光谱扫描，时间为0min，15min，30min，45min，60min，120min，180min，240min；结果如图4所示。光谱显示：以620nm为激发，亮氨酸氨基肽酶的额外加入使荧光探针在676nm处的荧光强度随着时间的增加而增强。
实施例3
(1)配制pH 7.4的10mM的磷酸缓冲盐溶液；将实施例1制备的荧光探针溶于二甲基亚砜配制成2mM的储备液；将亮氨酸氨基肽酶冻干粉溶于水配制30U/mL的亮氨酸氨基肽酶储备液；
(2)取830μL的磷酸缓冲盐溶液、2.5μL荧光探针储备液、167μL的亮氨酸氨基肽酶储备液加入到比色皿中，37℃下反应4h后以620nm激发波长进行动力学扫描，扫描时长为4800s。结果如图5所示，光谱显示：以620nm为激发，亮氨酸氨基肽酶的额外加入使荧光探针在676nm处的荧光强度随着时间的增加而增强。
实施例4
(1)配制pH 7.4的10mM的磷酸缓冲盐溶液；将实施例1制备的荧光探针溶于二甲基亚砜配制成2mM的储备液；将LAP抑制乌苯美司溶于水配制成2mM的储备液。
(2)细胞测试：取10μL荧光探针储备液加入到2mL的磷酸缓冲盐溶液中，使其浓度为10μM；在37℃下用上述溶液孵育人肝癌细胞Hepa1-6 4h，孵育完毕后用2mL磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，在激光扫描共聚焦显微镜下成像；第二组取20μL乌苯美司储备液加入到2mL的磷酸缓冲盐溶液中，使其浓度为20μM；在37℃下用上述溶液孵育人肝癌细胞Hepa1-60.5h，孵育完毕后再加入10μL荧光探针储备液，使其浓度为10μM；在37℃下用上述溶液孵育Hepa1-6 4h，孵育完毕后用2mL磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，在激光扫描共聚焦显微镜下成像；结果如图6所示。
Claims (5)
1.一种基于碱性染料的近红外荧光探针，其特征在于，结构式如下：
2.如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将碱性蓝3和碳酸钠溶于二氯甲烷与水混合物中在氮气保护下搅拌并加热至45℃，并在此温度下缓慢加入用水溶解的连二亚硫酸钠，将混合物在45℃下反应至溶液由蓝色变为紫红色，反应完毕后停止加热并保持搅拌10min，静置至体系分层；等体系冷却至室温，在冰浴条件下缓慢加入用二氯甲烷溶解的三光气，反应1小时后停止反应，用二氯甲烷萃取三次，收集有机相，旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色固体目标产物，即为产物1；投料摩尔比为碱性蓝3：碳酸钠：连二亚硫酸钠：三光气＝1:4:4:2；
(2)将对氨基苯甲醇,2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)和Fmoc-L-亮氨酸溶于二氯甲烷中，室温下搅拌，反应24小时后结束反应；旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色固体目标产物，即为产物2；投料摩尔比为对氨基苯甲醇：2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉：Fmoc-L-亮氨酸＝1.1:1.1:1；
(3)将产物1，产物2，4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)和无水碳酸钠溶于二氯甲烷中，室温下氮气保护反应8小时后结束反应。旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色固体目标产物，即为产物3；投料摩尔比为产物1：产物2：4-(二甲氨基)吡啶：无水碳酸钠＝1：1.2：1：3；
(4)将产物3溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，常温下滴加哌啶，1小时后结束反应，给体系加入大量的水，用乙酸乙酯萃取三次；旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡蓝色色固体目标产物，即为权利要求1所述的荧光探针。
3.如权利要求1所述的荧光探针在制备亮氨酸氨基肽酶检测试剂中的应用。
4.一种检测亮氨酸氨基肽酶的方法，其特征在于，步骤为：
(1)配制pH 7.4的10mM的磷酸缓冲盐溶液；将权利要求1所述的荧光探针溶于二甲基亚砜配制成2mM的储备液；将亮氨酸氨基肽酶冻干粉溶于水配制30U/mL的亮氨酸氨基肽酶储备液；
(2)荧光光谱：取478.3μL的磷酸缓冲盐溶液、5μL荧光探针储备液、16.7μL的亮氨酸氨基肽酶储备液加入到比色皿中，37℃下反应4h后以620nm激发光进行荧光光谱扫描，时间为0min，15min，30min，45min，60min，120min，180min，240min；
(3)动力学曲线：取478.3μL的磷酸缓冲盐溶液、5μL荧光探针储备液、16.7μL的亮氨酸氨基肽酶储备液加入到比色皿中，37℃下反应4h后以620nm激发波长进行动力学扫描，时长为4800s。
5.如权利要求1所述的荧光探针在制备细胞成像试剂中的应用。
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