CN117653589A - 玉米醇溶蛋白原纤维粉末、玉米醇溶蛋白新凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末、玉米醇溶蛋白新凝胶及其制备方法和应用。玉米醇溶蛋白原纤维粉末的制备方法包括以下步骤：将水加入含有溶剂的玉米醇溶蛋白凝胶中使其固化；然后冷冻干燥固化物，得到富含原纤维的玉米醇溶蛋白原纤维粉末。玉米醇溶蛋白新凝胶的制备方法为：将玉米醇溶蛋白原料粉末、玉米醇溶蛋白原纤维粉末溶解在溶剂中，形成浓度为10‑60％(w/v)玉米醇溶蛋白溶液，静置后形成玉米醇溶蛋白新凝胶。与现有技术相比，本发明具有显著有别于玉米醇溶蛋白球形微观形貌、不同溶剂体系的、高度可重复、性能可控等优点。
Description
技术领域
本发明涉及食品科学、材料科学、生物医学工程、制药和生物科学领域，具体涉及玉米醇溶蛋白原纤维粉末、玉米醇溶蛋白新凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
在扫描电镜下观察玉米醇溶蛋白粉末是不规则的球状，其尺寸从数微米至数百微米；而用玉米醇溶蛋白溶液涂敷制备的二维薄膜的表面结构也是由尺寸数十纳米至数微米的微球构成。因此，玉米醇溶蛋白的微观基本结构是球状这一观念已被广为接受。另一方面，玉米醇溶蛋白溶液的凝胶化一直被认为是食品加工领域的一个缺点。
多年来有若干研究小组试图通过跟踪凝胶形成过程来解明凝胶化机理，找到再现程度高的凝胶生成方法，但给出了相互矛盾的结果。例如，P.Nonthanum等人报道γ-玉米醇溶蛋白对于玉米醇溶蛋白溶液的凝胶化至关重要。在他们的第一份报告中，27％(w/v)玉米醇溶蛋白在70％(v/v)乙醇中(采用三种不同的方法提取玉米醇溶蛋白)，胶凝时间约为3h。他们认为γ-玉米醇溶蛋白的共存可能是玉米醇溶蛋白溶液凝胶化的原因，其根据是添加β-巯基乙醇(BME)会缩短凝胶时间。在第二篇报道中，他们在不同的pH条件下，在65-90％乙醇中制备了20％玉米醇溶蛋白溶液。γ-玉米醇溶蛋白含量高的溶液凝胶时间比γ-玉米醇溶蛋白含量低的短；无γ-玉米醇溶蛋白的溶液在240min内未发生凝胶化。因为γ-玉米醇溶蛋白含有较高的-SH基团，可以形成二硫键，他们因此提出二硫键对于凝胶的形成很重要。然而，在S.Uzun等人报道的另一项研究中，在90％乙醇中，60％和40％的玉米醇溶蛋白在放置4个月后才会发生凝胶化，他们认为玉米醇溶蛋白自组装是凝胶形成的原因。而Shi等人报道了在80％(v/v)乙醇中使用25％玉米醇溶蛋白溶液在1.54小时开始形成凝胶。
这些研究结果表明玉米醇溶蛋白溶液的凝胶化过程是难以重复和控制的，现阶段尚不具备玉米醇溶蛋白凝胶作为有用物质的应用条件，必须找到凝胶化的关键因子，使其制备过程可重复、性能可调控。
增材制造的一个新兴领域是4D打印，这里时间作为第四维度与3D打印相结合。智能材料的设计目标就是能够响应外部环境刺激，在多种刺激因子中，只有有限的因子有助于实现4D打印特性。在生物医学领域，组织工程和药物输送是可以4D打印应用的主要领域。D.Han等利用4D打印微针增强组织粘附，这些微针有向后弯曲的倒刺，当插入皮肤时，可以变形并与组织锁合。在另一个研究中，基于聚乙烯醇PVA体系的水诱导形状恢复特性可实现胃潴留时间的延长。然而，这些第四维度的变化都需要复杂的打印后处理过程才能实现。研发低成本、打印方法简单(打印后处理步骤少)的打印墨水材料具有挑战性。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种显著有别于玉米醇溶蛋白球形微观形貌、不同溶剂体系的、高度可重复、性能可控的玉米醇溶蛋白原纤维粉末、玉米醇溶蛋白新凝胶及其制备方法和应用。本发明还以玉米醇溶蛋白原纤维粉末作为种子，提供了不同溶剂体系的、高度可重复、性能可控的玉米醇溶蛋白凝胶快速制备技术。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明发现在剪切力帮助下可以较快的形成凝胶，但需要连续搅拌4小时以上，仍然很耗时。基于玉米醇溶蛋白的疏水特性，发现在水的作用下凝胶固化发生相分离，凝胶体系中的其他溶剂随之溶出到水中，将固化的凝胶冷冻干燥后获得富含原纤维的玉米蛋白粉末。该粉末作为种子纤维添加到新鲜制备的玉米醇溶蛋白溶液后可大大加快凝胶的形成，且此操作具有高度重复性，解决了长期困扰的凝胶形成不可控问题。
本发明披露了一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末及其制备方法，并使用该原纤维作为凝胶网络的核结构，诱导玉米醇溶蛋白溶液快速凝胶化，解决了凝胶形成条件不可控的关键问题，作为具有高度重复性的凝胶制备方法用于性能可控的生物医用凝胶材料制备，实施3D及4D打印，具体方案如下：
一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末的制备方法，该方法包括以下步骤：
将水加入含有溶剂的玉米醇溶蛋白凝胶中，使凝胶固化；
然后冷冻干燥固化物，得到富含原纤维的玉米醇溶蛋白原纤维粉末。
进一步地，所述的玉米醇溶蛋白凝胶采用以下方法制备：将玉米醇溶蛋白原料粉末溶解在混合溶剂中，形成浓度为10-60％(w/v)的玉米醇溶蛋白溶液，再施加剪切应力直至形成玉米醇溶蛋白凝胶。即用于制备玉米醇溶蛋白原纤维粉末的玉米醇溶蛋白凝胶中含有10-60％(w/v)的玉米醇溶蛋白。
进一步地，所述的水的添加量为玉米醇溶蛋白凝胶的4-6倍。
进一步地，所述的溶剂为60-95％(v/v)的乙醇/水、二甲基亚砜(DMSO)、60-95％(v/v)的N-甲基吡咯烷酮(NMP)/水、60-95％(v/v)的甘油缩甲醛(GF)/水或60-95％(v/v)的乙酸/水。
进一步地，剪切应力的搅拌转速为1500-2500rpm，时间为5-10h。
一种玉米醇溶蛋白新凝胶的制备方法，该方法为：将如上所述的玉米醇溶蛋白原纤维粉末和玉米醇溶蛋白原料粉末溶解在如上所述的溶剂中，形成浓度为10-60％(w/v)玉米醇溶蛋白溶液，静置后形成玉米醇溶蛋白新凝胶。
进一步地，所述玉米醇溶蛋白原纤维粉末的添加量与玉米醇溶蛋白原料粉末的质量比为(10-100):(0-90)。
进一步地，制备时，在玉米醇溶蛋白溶液中加入活性物质和/或致孔剂，形成负载活性物质的玉米醇溶蛋白新凝胶；所述的活性物质包括盐酸环丙沙星、地塞米松、甘油磷酸酯、维生素C；所述的致孔剂包括薄荷醇。
一种如上所述方法制备的玉米醇溶蛋白新凝胶。
一种如上所述的玉米醇溶蛋白新凝胶的应用，该玉米醇溶蛋白新凝胶用于在具有梯度变化的支持浴中，实施4D打印。在由不同溶剂梯度形成的支持浴中打印3D结构，可实现第四维度的形变，以及由此引申的载药量、药物释放速率、降解速率等的变化，即为4D打印。
进一步地，4D打印的具体过程为：将支持浴材料溶解在溶剂-水溶液体系中，逐层叠加形成具有梯度变化的支持浴；将玉米醇溶蛋白新凝胶在支持浴中进行4D打印，打印完成后，干燥后，得到3D打印结构。
进一步地，所述的支持浴材料包括卡波、硅藻土、硅酸盐、氢氧化钠或硅油；所述的溶剂-水溶液体系由10-80％(v/v)的水和20-90％(v/v)的乙醇、DMSO、NMP、GF或乙酸组成。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明不仅显著缩短了凝胶制备时间，而且具有高度重复性，为玉米蛋白凝胶作为生物医用材料的用途提供了质量保证；
(2)本发明中，利用第一个用途诱导生成的新凝胶在梯度变化的支持介质中可实现4D打印，打印物具有环境响应性智能化特征，包括但不限于可调控的载药量、释放速率和降解速率等生物医用功能；
(3)本发明以原纤维粉末作为种子，提供了不同溶剂体系的、高度可重复、性能可控的玉米醇溶蛋白凝胶快速制备技术。
附图说明
图1为本发明的实施方案流程图；
图2为原纤维生成的证明实验图；图(a)、(b)、(c)、(d)和(e)分别表示玉米醇溶蛋白凝胶和溶液在80％(v/v)乙醇水溶液、80％(v/v)NMP水溶液、80％(v/v)乙酸水溶液、DMSO和甘油缩甲醛中的荧光光谱；
图3为玉米醇溶蛋白原料粉末(左)和原纤维粉末(右)的扫描电镜图片；
图4为荧光显微镜观察玉米醇溶蛋白原料粉溶液(左)和原纤维诱导生成的新玉米醇溶蛋白凝胶(右)；
图5为添加原纤维的玉米醇溶蛋白凝胶化(左)及所需时间(右)；30％(w/v)玉米醇溶蛋白在80％(w/v)的乙醇-水体系；
图6为本发明在专用支持浴中玉米醇溶蛋白凝胶的4D打印方案；
图7为本发明在40％和75％乙醇支持浴中打印的结构特征(a)环丙沙星载药量(b)环丙沙星释放速率及(c)打印支架的降解速率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
除另有规定外，本发明所使用的所有技术和科学术语与本领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末、玉米醇溶蛋白新凝胶及其制备方法和应用，包括以下步骤：
(1)将玉米醇溶蛋白原料粉溶解于60-95％(v/v)的乙醇/水中，玉米醇溶蛋白蛋白含量为10-60％(w/v)，优选20-50％。
(2)在室温(20-30℃)下，用磁力搅拌等方法对溶液施加剪切应力，直至胶凝。
(3)将过量的水，优选凝胶体积的5倍量，加入到玉米醇溶蛋白凝胶中进行溶剂交换，重复此操作使溶剂完全除去，凝胶中富含原纤维的玉米醇溶蛋白固化后析出；将该固化的玉米醇溶蛋白冷冻干燥获得微观形貌为纤维状的玉米醇溶蛋白原纤维粉末，产率90％以上。
(4)将该原纤维粉末与玉米醇溶蛋白原料粉按质量比10：90至100：0混合，分别用60-95％(v/v)的乙醇/水、二甲基亚砜DMSO、60-95％(v/v)的N-甲基吡咯烷酮NMP/水、60-100％(v/v)的甘油缩甲醛GF/水或60-95％(v/v)的乙酸/水制备成含有10-60％(w/v)玉米醇溶蛋白的溶液，优选20-50％，静置即可获得新凝胶。凝胶化时间随原纤维含量增加而缩短，3分钟至3小时不等。
可通过向玉米醇溶蛋白的溶液中添加药物，添加量不大于玉米蛋白质量的30％(w/w)，来制备载药玉米醇溶蛋白凝胶。
可通过向玉米醇溶蛋白的溶液中添加致孔剂，添加量为新凝胶质量的10-50％不等，获得孔隙结构和孔隙率可调的3D打印结构。
(5)通过将溶解在0.01N氢氧化钠中的Carbopol 980(0.25％w/v)分别溶于40％和75％的上述溶剂水溶液中，来制备支持浴。
(6)使用基于气动挤压的3D打印技术，将含有或不含有药物的玉米醇溶蛋白凝胶打印到支持介质中构建3D支架，打印结构在支持浴中发生第四维度变化，可实现智能化生物功能。
(7)在氯化钠溶液(0.9％(w/v)水溶液)中洗涤30分钟，去除Carbopol。
(8)洗涤后的打印结构干燥后进行灭菌、包装。
实施例1(F1)
通过将2g玉米醇溶蛋白溶解在10ml 80％(v/v)乙醇水溶液中来制备凝胶。将所得溶液在超声浴中超声处理1小时以去除气泡。然后使用磁力搅拌在25℃下，以2000rpm的转速搅拌。6小时后，观察到凝胶固化。
通过ThT(硫黄素)结合实验来评估原纤维的形成。将100mg的玉米醇溶蛋白溶液分散在4mL的80％(v/v)乙醇水溶液中。将分散液在超声浴中超声处理1小时。25μL的25mM ThT(溶于80％(v/v)乙醇水溶液)。450nm激发，在460-560nm范围内测量荧光光谱。原纤维由于与ThT的结合而具有更高的荧光强度(图2a)。
加入5倍于凝胶体积的水以固化玉米醇溶蛋白凝胶。在室温下放置24-36小时后完全固化。将固化的凝胶冷冻干燥并使用研磨机粉碎成粉末，获得富含原纤维的玉米醇溶蛋白粉(图3右)，作为种子诱导玉米醇溶蛋白溶液快速凝胶化。
为了制备载活性物质的玉米醇溶蛋白凝胶，在玉米醇溶蛋白溶液中加入0.08g盐酸环丙沙星作为活性物质模型后在上述条件下凝胶化。将溶解在0.01N氢氧化钠中的卡波(0.25％w/v)分别溶于40％和75％(v/v)的乙醇水溶液中，制备两层不同水含量的支持浴。用载有环丙沙星的玉米醇溶蛋白凝胶为打印墨水在卡波支持浴中打印。打印的结构在支持浴中停留12小时后，用氯化钠水溶液(0.9％(w/v)洗涤30分钟以除去卡波，再将打印的结构在37℃的干热烘箱中干燥12小时即为成品(图6)。与在75％水溶液的支持浴中打印的结构相比，在40％水溶液的支持浴中打印的结构具有较低的载药量、较慢的药物释放速率和较慢的降解速率(图7)。
实施例2(F2)
将0.6g玉米醇溶蛋白原纤维粉末和0.4g玉米醇溶蛋白原料粉末溶解在10ml 80％(v/v)N-甲基吡咯烷酮(NMP)水溶液中获得玉米醇溶蛋白溶液。在原纤维诱导下，凝胶化时间由4天缩短为40分钟。如实施例1和图2b，通过ThT结合实验来跟踪凝胶的形成过程。
将卡波(1％w/v)分别溶于含10％、50％和90％(v/v)NMP的水溶液中，制备三层不同水含量的支持浴。载有地塞米松、甘油磷酸酯(β-glycerolphosphate)和维生素C三种活性物质(诱导骨髓干细胞分化为成骨细胞)的玉米醇溶蛋白凝胶在该支持浴中打印。打印结构在支持浴中允许停留6小时。用磷酸缓冲液洗涤除去卡波后，冷冻干燥所打印的3D结构。
实施例3(F3)
将0.4g玉米醇溶蛋白原纤维粉末和3.6g玉米醇溶蛋白原料粉末溶解在10mL二甲基亚砜(DMSO)中获得玉米醇溶蛋白溶液,再加入50％的薄荷醇(w/w)为致孔剂。在原纤维诱导下，凝胶化时间由4天缩短为4小时。如实施例1和图2d，通过ThT结合实验来跟踪凝胶的形成过程。
将分别溶解在20％和60％(v/v)水-乙醇体系的层状硅酸盐Laponite(1-4％w/v)静置成胶，制备两层支持浴。将上述含有致孔剂的凝胶作为打印墨水在层状硅酸盐Laponite支持浴中打印。打印的3D结构在水环境下固化后取出，在90℃的干热烘箱中使薄荷醇升华，依据薄荷醇添加量，可获得孔隙结构可控的3D支架。与在含60％水溶液的支持浴中所打印的结构相比，在含20％水溶液的支持浴中所打印的结构具有较高的孔隙率，植入体内后会具有较短的降解周期(图7c)。
实施例4(F4)
通过将2g玉米醇溶蛋白溶解在10mL甘油缩甲醛中来制备凝胶。将所得混合物搅拌6小时以溶解玉米醇溶蛋白，然后在超声浴中超声处理2小时以去除气泡。然后使用磁力搅拌在25℃下，以2000rpm的转速搅拌。36-48小时后，观察到凝胶作用。凝胶在0.1％应变下的粘度约为1500Pa.s。该凝胶可进行相应的应用。
如实施例1和图2e，通过ThT结合实验来评估原纤维的形成。为了制备载有环丙沙星(药物)的玉米醇溶蛋白凝胶，在玉米醇溶蛋白凝胶的制备过程中加入0.08g盐酸环丙沙星。将溶解在0.01N氢氧化钠中的卡波980(0.25％w/v)分别溶于40％和75％(v/v)甘油缩甲醛水溶液中，制备两层支持浴。载有环丙沙星的玉米醇溶蛋白凝胶在支持浴中打印。打印结构在支持浴中允许停留12小时。用氯化钠溶液(0.9％(w/v)水溶液)洗涤30分钟，除去卡波。洗涤后的打印结构在37℃的干热烘箱中干燥12小时。与在75％水溶液的支持浴中打印的结构相比，在40％水溶液的支持浴中打印的结构具有较低的载药量、较慢的药物释放速率和较慢的降解速率。
实施例5(F5)
将1.0g玉米醇溶蛋白原纤维粉末溶解在10mL的80％(v/v)乙酸水溶液中来制备新凝胶。凝胶化时间由4天缩短为3分钟。如实施例1和图2c，通过ThT结合实验来评估原纤维的形成。
为了制备载有环丙沙星(药物)的玉米醇溶蛋白凝胶，在玉米醇溶蛋白新凝胶的制备过程中加入0.08g盐酸环丙沙星。将溶解在0.01N氢氧化钠中的Carbopol 980(0.25％w/v)分别溶于40％和75％(v/v)乙酸水溶液中，制备两层支持浴。载有环丙沙星的玉米醇溶蛋白凝胶在Carbopol支持浴中打印。打印结构在支持浴中允许停留12小时。用氯化钠溶液(0.9％(w/v)水溶液)洗涤30分钟，除去Carbopol。洗涤后的打印结构在37℃的干热烘箱中干燥12小时。与在75％水溶液的支持浴中打印的结构相比，在40％水溶液的支持浴中打印的结构具有较低的载药量、较慢的药物释放速率和较慢的降解速率。
综上所述，本发明涉及一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末及其制备方法、该原纤维作为种子纤维诱导凝胶生成的用途、以及作为3D/4D打印墨水的生物医学用途。先用常规方法制备玉米醇溶蛋白凝胶，经水介质固化释放溶剂后，将固化物冷冻干燥即可获得富含原纤维的粉末。将该粉末与玉米醇溶蛋白原料粉末一起溶于各种溶剂体系中，即可诱导凝胶快速形成。该方法不仅显著缩短了凝胶制备时间，而且具有高度重复性，为玉米蛋白凝胶作为生物医用材料的用途提供了质量保证。利用本发明第一个用途诱导生成的新凝胶在梯度变化的支持介质中可实现4D打印，打印物具有环境响应性智能化特征，包括但不限于可调控的载药量、释放速率和降解速率等生物医用功能。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
将水加入含有溶剂的玉米醇溶蛋白凝胶中，使凝胶固化；
然后冷冻干燥固化物，得到富含原纤维的玉米醇溶蛋白原纤维粉末。
2.根据权利要求1所述的一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末的制备方法，其特征在于，所述的玉米醇溶蛋白凝胶采用以下方法制备：将玉米醇溶蛋白原料粉末溶解在溶剂中，形成浓度为10-60％(w/v)的玉米醇溶蛋白溶液，再施加剪切应力直至形成玉米醇溶蛋白凝胶。
3.根据权利要求1或2所述的一种玉米醇溶蛋白原纤维粉末的制备方法，其特征在于，所述的溶剂为60-95％(v/v)的乙醇/水、DMSO、60-95％(v/v)的NMP/水、60-95％(v/v)的甘油缩甲醛/水或60-95％(v/v)的乙酸/水。
4.一种玉米醇溶蛋白新凝胶的制备方法，其特征在于，该方法为：将如权利要求1所述的玉米醇溶蛋白原纤维粉末和玉米醇溶蛋白原料粉末溶解在溶剂中，形成浓度为10-60％(w/v)玉米醇溶蛋白溶液，静置后形成玉米醇溶蛋白新凝胶。
5.根据权利要求4所述的一种玉米醇溶蛋白新凝胶的制备方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白原纤维粉末的添加量与玉米醇溶蛋白原料粉末的质量比为(10-100):(0-90)。
6.根据权利要求4所述的一种玉米醇溶蛋白新凝胶的制备方法，其特征在于，制备时，在玉米醇溶蛋白溶液中加入活性物质和/或致孔剂，形成负载活性物质的玉米醇溶蛋白新凝胶；所述的活性物质包括盐酸环丙沙星、地塞米松、甘油磷酸酯或维生素C；所述的致孔剂包括薄荷醇。
7.一种如权利要求4-6任一项所述方法制备的玉米醇溶蛋白新凝胶。
8.一种如权利要求7所述的玉米醇溶蛋白新凝胶的应用，其特征在于，该玉米醇溶蛋白新凝胶用于在具有梯度变化的支持浴中，实施4D打印。
9.根据权利要求8所述的一种玉米醇溶蛋白新凝胶的应用，其特征在于，4D打印的具体过程为：将支持浴材料溶解在溶剂-水溶液体系中，逐层叠加形成具有梯度变化的支持浴；将玉米醇溶蛋白新凝胶在支持浴中进行4D打印，打印完成后，干燥后，得到3D打印结构。
10.根据权利要求8所述的一种玉米醇溶蛋白新凝胶的应用，其特征在于，所述的支持浴材料包括卡波、硅藻土、硅酸盐、氢氧化钠或硅油；所述的溶剂-水溶液体系由10-80％(v/v)的水和20-90％(v/v)的乙醇、DMSO、NMP、GF或乙酸组成。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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