CN117651569A - 抗微生物肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)和式(II)的化合物。本发明的化合物可用于治疗真菌感染、细菌感染或阿米巴感染的方法。环(Arg‑Lys‑Lys‑Xaa‑Trp‑Phe‑Trp‑Yaa) 式I R1‑Arg‑Lys‑Lys‑Xaa‑Trp‑Phe‑Trp‑Yaa‑R2 式II。

Description

抗微生物肽及其用途
发明领域
本发明涉及与真菌性角膜炎相关的抗真菌治疗化合物和真菌诊断化合物。
背景技术
角膜是眼睛前部透明的圆顶形窗口，并且有助于将光线聚焦到眼睛中。真菌性角膜炎(FK)是由真菌引起的角膜感染。全球FK发病率不断上升——每年约有150万人被诊断为患有FK，特别是在东南亚等热带气候地区(Brown等人，2021)。FK可能在眼睛受伤或使用隐形眼镜后发生。如果不及时治疗，它可能会导致失明。在许多情况下，治疗无法恢复视力，并且可能会出现永久性视力受损或失明。大约50％的患有中度至重度FK的FK患者会因失明或严重视觉受损而丧失视力。大约25％的患有角膜感染的患者需要摘除眼睛。
早期诊断和治疗对于最大限度地减少组织损伤并确保尽可能最好的视力结局至关重要(Bacon等，1993)。由于临床特征不具有特异性，因此很难将真菌与微生物性角膜炎的其他病因区分开来。患者通常最初会接受抗细菌剂治疗，并且如果最初的抗细菌治疗无效或如果做出真菌的明确诊断(通常基于微生物测试)，则患者将接受抗真菌剂。
目前有三种方法用于FK的明确诊断：临床检查、角膜刮片微生物测试和体内共聚焦显微术(IVCM)。然而，这些方法中的每一种方法均具有局限性。临床检查依赖于FK的特征性特征(例如卫星病变)的存在，这些特征通常在早期溃疡中不存在，并且即使存在，这些特征也可能很难区分，经验丰富的眼科医生只有2/3的时间能识别出这些迹象(Dalmon等人，2012)。为了微生物测试而进行的角膜刮片是一种侵入性程序，并且只能获取浅表溃疡中存在的生物体，并且在某些情况下只能在40％的病例中检测到生物体(Burton等，2011)。浅表角膜刮片可能会漏掉仅存在于更深的组织中的生物体，诸如在感染涉及角膜后半部分的中度至重度FK中。真菌培养结果可能需要长达14天的时间，而在开始正确的治疗方案之前的这种时间延迟可能会导致严重的角膜组织损伤，并最终导致患者视觉结局不佳。此外，世界许多地区没有具有真菌培养所需的设施的微生物实验室。最终的诊断技术IVCM是非侵入性的，并且允许在第一次就诊时快速诊断。然而，该设备价格昂贵，因此在世界范围内不容易获得。IVCM还需要在图像采集和解释方面进行广泛的培训，以便能够诊断FK(Chidambaram等人，2016)。因此，它主要在全球研究中心使用，而不是在日常实践中使用。
分子生物学技术的最新进展已使得不依赖于培养物的诊断方法成为可能。一种这样的技术是PCR，其已被证明可用于各种微生物感染(包括真菌病)的不依赖于培养物的诊断。然而，通过PCR成功扩增来自角膜刮片的真菌DNA仍需要至少48h的接种后时段，并且需要有配备专业设备的实验室。此技术目前仅用于研究环境，尚未成为临床实践中常规使用的测试。
发达国家和LMIC目前诊断真菌性眼睛感染的临床途径如下，以英国和印度为例：
·英国(Tuft等人，2013)：如果存在FK的临床特征，则由眼科医生通过裂隙灯检查来识别该临床特征，通常随后进行角膜刮片。真菌的微生物培养大约需要7-14天，并且如果阳性，患者通常使用5％纳他霉素滴眼剂(美国生产，价格昂贵且进口有时间延迟)治疗。经验性治疗在等待微生物学测试结果的同时启动，并且根据是否检测到FK的任何临床特征，可能包括抗生素滴眼剂+/-抗真菌滴眼剂。1％伏立康唑滴眼剂(最常见的是不含防腐剂的制剂)也可用于治疗真菌性眼睛感染，但这由于稳定性问题而必须根据需要订购，因此可能需要几天时间才能提供给患者。体内共焦显微术(如果可以获得)也可以被用于作出立即诊断，但这些机器价格昂贵，而且英国只有大约10台。
·印度：患者更有可能在FK后期去看眼科医生，因此基于临床特征进行诊断通常更困难(Chidambaram等人，2018)。与在英国一样，患者在等待微生物结果的同时可能最初会接受抗生素滴眼剂和抗真菌滴眼剂。印度很少有眼科诊所拥有体内共聚焦显微镜(大约6个)，但是如果有的话，可以在第一次就诊时使用它来快速诊断溃疡内的真菌。5％纳他霉素和1％伏立康唑滴眼剂在印度本地生产，并且易于以低成本获得。
Perlin等人开发了一种经改良的卡泊芬净(Caspofungin)分子，该分子具有使用FMT1500体内成像器系统(近红外680nm波长激光)进行可视化的荧光探针(Perlin等人，2018)。卡泊芬净被用作全身性真菌病的真菌治疗，但尚未在全球范围内用于滴眼剂制剂(Neoh等，2014)。卡泊芬净对曲霉菌属(Aspergillus)种具有一定活性，注意到它对临床分离株具有中等MIC。然而，卡泊芬净对镰刀菌属(Fusarium)种并不是特别有效(如临床分离株中的MIC测试所示)(Arikan等人，2001)。Perlin也是EP 2846840 A2的发明人，该专利描述了使用与可检测标记(例如荧光标记)结合的抗真菌药物(包括卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净)检测真菌细胞的方法。
Lee等人开发了一种经改良的莫西沙星分子来标记真菌细胞(Lee等人，2018)。莫西沙星是一种广谱抗生素。经改良的莫西沙星分子缺乏特异性，因为它似乎与其他角膜细胞(如树突状细胞、角膜神经和可能的角质细胞)结合，并且可能靶向细菌。
需要开发这样的高度特异且灵敏的诊断工具，其能够在不使用任何特殊或昂贵的医疗设备的情况下快速可靠地检测真菌性角膜炎，以便此技术可以在全球范围内轻松引入和采用。
还需要开发新型抗真菌治疗药，因为现有药物溶解度较差，并且它们的功效由于缺乏对角膜组织的渗透而受到限制。对于FK治疗，纳他霉素5％滴眼剂被认为是对诸如镰刀菌属种和曲霉菌属种的丝状真菌的一线治疗(Oldenburg等人，2017)。也可使用1％伏立康唑滴眼剂，但它对丝状真菌的效果不如纳他霉素(Prajna等人，2013)。这两种药物在治疗曲霉菌性角膜炎和深部真菌性溃疡方面具有较差的结局，因此对作为安全有效的FK疗法的新型抗真菌滴眼剂治疗的需求仍然未得到满足。
发明内容
本发明提供了化合物及其盐以及在微生物感染特别是眼睛感染的成像、诊断和治疗中使用所述化合物和盐的方法。
本发明的化合物具有以下通式结构：
环(Arg-Lys-Lys-Xaa-Trp-Phe-Trp-Yaa)式I
R1-Arg-Lys-Lys-Xaa-Trp-Phe-Trp-Yaa-R2式II
应当理解，本发明涵盖这些化合物的盐。合适的肽盐是本领域已知的。
R1和R2可以是H和OH，或者可以是本领域技术人员显而易见的合适基团。Xaa是具有疏水侧链的氨基酸残基。Yaa是一个氨基酸残基或一对氨基酸残基。
本发明的化合物可以用荧光团标记，在这种情况下Yaa可以包含带有荧光团的赖氨酸残基。在一些情况下，该荧光团连接在C端，在这种情况下R2是或包含荧光团。该化合物可以是未经标记的，在这种情况下，它们不包含带有荧光团的赖氨酸残基，但是Yaa可以是或包含赖氨酸残基。
在第一方面，本发明可提供式I或式II的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R1为H、C1-4烷基、C1-4酰基、磷酰基(PO3 2-)或生物素基；
R2为OH、NH2、H或O(C1-4烷基)；
Xaa是例如选自Phe、phe、Ala、ala、Pro、pro、Gly、Val、val、Leu、leu、Ile、ile、Met、met、Tyr、tyr、Trp和trp的具有疏水侧链的天然或非天然氨基酸残基；
Yaa选自Gly、Lys、Lys-Gly、Lys*、Lys*-Gly、Zaa、Zaa*、Zaa-Gly和Zaa*-Gly，其中Zaa是具有游离胺、叠氮化物或炔烃侧链的非天然氨基酸，并且Zaa*是用荧光团官能化或带有荧光团的所述非天然氨基酸；
其中Lys*，如果存在的话，是带有荧光团的赖氨酸残基。
应当理解，当R1是H时，线性肽的N端是未经取代的(NH2或其质子化形式)。然而，本发明涵盖在此位置用例如短烷基(诸如甲基)、酰基(诸如乙酰基)、磷酰基(PO3 2-)或生物素基团进行的取代。该生物素基团是：
优选地，R1是H、C1-4烷基或C1-4酰基，例如H、甲基(Me)或乙酰基(Ac)。最优选地，R1是H。
当R2是OH时，C端是游离羧酸或其去质子化形式。R2也可以是NH2；也就是说，线性肽可以以酰胺终止。R2也可以是H；也就是说，线性肽可以以醛终止。R2还可以是O(C1-4烷基)；也就是说，线性肽可以以烷基酯终止。优选地，R1是OH。
在一些实施方案中，Xaa选自Phe、phe、Ala、ala、Pro、pro、Gly、Val、val、Leu、leu、Ile、ile、Met、met、Tyr、tyr、Trp和trp。在一些实施方案中，Xaa选自phe、ala、pro和Pro。在一些实施方案中，Xaa是phe。在一些实施方案中，Xaa是ala。在一些实施方案中，Xaa是pro。在一些实施方案中，Xaa是Pro。
在一些实施方案中，Yaa选自Gly、Lys、Lys-Gly、Lys*和Lys*-Gly。在一些实施方案中，Yaa是Gly。在这些实施方案中，该化合物或盐是未经标记的。在一些实施方案中，Yaa是Lys*或Lys*-Gly。在这些实施方案中，该化合物或盐是经标记的。
在一些实施方案中，该化合物或盐是环肽；即根据式I的肽。在一些实施方案中，该化合物或盐是直链肽；即根据式II的肽。
在一些实施方案中，该化合物是经标记的化合物并且该荧光团选自羧基荧光素酸和青色素(Cyanine)5。
在一些情况下，该化合物选自以下化合物：
表1
或它们的药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，该化合物或盐是经荧光团标记的MFIGAF001。
在进一步的方面，本发明提供了药物组合物，其包含式I或式II的化合物或盐以及药学上可接受的赋形剂。适当地，该组合物被配制用于眼睛使用，例如局部施用至眼睛。
另一方面，本发明提供了式I或式II的化合物或盐或包含此种化合物或盐的药物组合物，其用于治疗方法。
该治疗方法适合于微生物感染，例如真菌感染、细菌感染或阿米巴感染。适当地，受感染的组织是眼睛。该感染可以选自真菌性角膜炎(FK)、细菌性角膜炎或棘阿米巴性角膜炎。优选地，该感染是FK。
本发明人已经证明，未经标记的和未经标记的化合物都具有针对这些感染的期望活性。因此，经标记的和未经标记的化合物都可以用于治疗中。然而，应当理解，未经标记的化合物可能优选用于治疗过程。
本发明的经标记的化合物可用于对此类感染进行成像和诊断，并且有利地，成功的成像表明经标记的和相应的未经标记的化合物可用于治疗感染，从而减少可能导致群落中抗微生物耐药性的发展的无效抗微生物剂的不必要使用。
因此，在进一步的方面，本发明涉及诊断微生物感染的方法并且可以提供式I或式II的化合物或盐，其中Yaa是Lys*、Lys*-Gly、Zaa*或Zaa*-Gly；或者包含此种化合物或盐的药物组合物，其用于诊断患者的真菌、细菌或阿米巴感染的方法，所述方法包括：
a)使所述化合物、盐或组合物与所述患者的眼睛接触；
b)检查所述患者的眼睛以确定是否可检测到荧光；以及
c)记录荧光，如果存在的话，并对所述患有真菌、细菌或阿米巴感染的患者进行诊断。
该方法还可以包括用本发明的化合物治疗该感染，该化合物可以与用于诊断的化合物相同或不同。感染的类型可以通过检查荧光区域的形态来确定。
在进一步的方面，本发明提供了使用式I或式II的化合物或盐(其中Yaa是Lys*、Lys*-Gly、Zaa*或Zaa*-Gly)，或者包含此种化合物或盐的药物组合物对组织中的微生物生长进行成像的方法，该方法包括：
a)使所述化合物或组合物与组织接触；
b)检测所述化合物或组合物的荧光。
微生物生长的类型可以通过检查荧光区域的形态来确定。
应当理解，该方法可以是体内的，在这种情况下，该化合物或盐将通常作为药物组合物，诸如离体或体外滴眼剂制剂提供。
对本领域的贡献
认识到与有效诊断和治疗FK相关的困难，本发明人着手提供快速、无毒、广谱的真菌特异性的荧光诊断探针以快速诊断真菌性角膜炎。
与目前可用的诊断方法相比，本发明人相信本文所述的经标记的化合物具有成本效益的潜力并且仅需要最少的培训和设备。预计该诊断探针将允许人角膜中的真菌的直接可视化，从而促进在临床中的快速诊断。由于这些分子使用与其他广泛使用的滴眼诊断剂所使用的荧光波长相同的荧光波长进行激发/发射，因此可以通过使用裂隙灯生物显微镜来执行探针的可视化，该生物显微镜被眼保健专业人员(诸如验光师、配镜师、眼科护士和眼科医生)用作日常实践中的标准设备。
设想了可以在诊断试剂盒中提供经标记的化合物，该诊断试剂盒包括滴眼剂，并且还可以包括手持光源。该试剂盒的预期用途是对真菌性角膜炎提供快速且准确的诊断；使用此试剂盒只需要最少的培训。在使用中，预计患者将以与普通滴眼剂相同的方式使用探针。使用裂隙灯生物显微镜或合适的手持灯作为激发光源和检测方法，任何潜在的真菌感染都将在短时段(例如5至20min)后以荧光信号的形式显现。
本文所述的化合物(经标记的和未经标记的)也显示出期望的生物活性并且可以用于如本文所述的治疗方法中。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这种组合明显不允许或明确避免。
附图概述
现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施例和实验，在附图中：
图1示出的HPLC图表示出了于37℃用灰色链霉菌(Streptomyces griseus)蛋白酶处理后MFIGAF001和类似物PAF26的纯度。图1a)是MFIGAF001在0h时的纯度的图表。图1b)是MFIGAF001在24h时的纯度的图表。图1c)是类似物PAF26在0h时的纯度的图表。图1d)是类似物PAF26在24h时的纯度的图表。
图2示出人肺A549上皮细胞在与不同浓度的MFIGAF001温育4h后的活力的图表。使用PBS作为阴性对照，并且使用DMSO作为阳性对照。数据表示为平均值±sd，n＝3。阴性对照和任何治疗之间没有显著差异(p>0.05)。
图3示出10μM MFIGAF002、MFIGAF001a和MFIGAF001在人红细胞(RBC)中的溶血活性的图表。将分子、DMSO(作为阳性对照)和PBS(作为阴性对照)与人RBC于37℃一起温育，并且在1h后评估它们的活力。
图4示出了在与本文所述的化合物一起温育后重建的角膜样上皮的活力。图4a是在与MFIGA001一起温育后重建的角膜样上皮(RhCE，EpiOcularTM)的活力的图表。NC＝阴性对照；PC＝阳性对照。图4b是在与10μM MFIGA001a和MFIGAF001b一起温育后重建的角膜样上皮(RhCE，EpiOcularTM)的活力的图表。NC＝阴性对照；PC＝阳性对照；A2＝MFIGAF001a；B1＝MFIGAF001b。
图5示出了MFIGAF001a在兔眼中的耐受性的图表。测试了三只兔(兔1、2和3)。所有兔在治疗后立即和接下来的7天内似乎都没有受到任何影响，且没有任何刺激性迹象并且一般状况也没有变化。MFIGAF001a以10μM和50μL使用并且让其进入兔的右眼中。
图6含有用PBS或MFIGAF001处理的受YFP-烟曲霉菌(A.fumigatus)感染的离体角膜的图像。在前8小时内，每2小时使用一滴试剂处理所有角膜，然后在剩余的16小时内每8小时使用一滴试剂处理所有角膜。使用此治疗方案继续治疗72小时。MFIGAF001以100mg/L使用。
图7含有使用利用黄色荧光蛋白(YFP)的荧光共聚焦活细胞成像方法的用MFIGAF001处理的受烟曲霉菌感染的离体角膜的图像。黄色荧光信号(原始图表中的黄色，此处再现为白色)指示渗透到角膜组织中的活真菌负荷。在前8小时内，每2小时使用一滴试剂处理所有角膜，然后在剩余的16小时内每8小时使用一滴试剂处理所有角膜。使用此治疗方案继续治疗72小时。MFIGAF001以100mg/L使用。
图8含有使用利用YFP的荧光共焦活细胞成像方法的用纳他霉素或MFIGAF001处理的受烟曲霉菌感染的离体角膜的图像。在前8小时内，每2小时使用一滴试剂处理所有角膜，然后在剩余的16小时内每8小时使用一滴试剂处理所有角膜。使用此治疗方案继续治疗72小时。黄色荧光信号(原始图表中的黄色，此处再现为白色)指示渗透到角膜组织中的活真菌负荷。MFIGAF001以100mg/L使用。纳他霉素以120mg/L使用。
图9示出了MFIGAF001a和MFIGAF001b(荧光，2.5μM)在与各种病原真菌(白色念珠菌(C.albicans)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、烟曲霉菌和新型隐球菌(C.neoformans))一起在RPMI中于37℃温育15min后的活细胞成像。顶部图示出了用MFIGAF001a/b标记的真菌细胞的荧光图像，并且底部图示出了真菌细胞的明场图像。
图10示出了在与烟曲霉菌一起在RPMI中于37℃温育的MFIGAF001a(荧光，2.5μM)的活细胞成像。
图11示出了于37℃下在RPMI中添加MFIGAF001a(荧光，2.5μM)后10min烟曲霉菌与人上皮细胞系A549的共培养物的活细胞成像。顶部图像示出了烟曲霉菌菌丝(左)连同A549细胞(右)的明场图像，底部图像示出了同一视图的荧光通道并展示了MFIGAF001a相对于A549细胞选择性地标记烟曲霉菌。
图12示出猪角膜感染模型中经MFIGAF001a(荧光，2.5μM，37℃温育15min)选择性标记的烟曲霉菌的活细胞成像。(A)荧光图像示出在猪角膜组织(深色背景)上的经MFIGAF001a选择性标记的烟曲霉菌(荧光丝)；(B)显示受烟曲霉菌感染的猪角膜；(C)明场图像示出烟曲霉菌在猪角膜组织内的生长。
图13示出了MFIGAF001a(荧光，2.5μM)与铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)一起在RPMI中于37℃温育1h的活细胞成像。顶部图像示出了指示铜绿假单胞菌未被MFIGAF001a标记的荧光通道，并且底部图像示出了铜绿假单胞菌的明场图像。
图14示出了MFIGAF001a(荧光，2.5μM，37℃下温育20min)与金黄色葡萄球菌(S.aureus)一起在RPMI中的活细胞成像。顶部图像示出了指示金黄色葡萄球菌被MFIGAF001a标记的荧光通道，并且底部图像示出了金黄色葡萄球菌的明场图像。
图15示出了受烟曲霉菌和金黄色葡萄球菌共同感染的猪角膜感染模型中的MFIGAF001a(荧光，2.5μM，37℃下温育15min)的活细胞成像。顶部图像示出的荧光通道示出在角膜组织上被MFIGAF001a标记的烟曲霉菌(丝状结构)和金黄色葡萄球菌(点)的尺寸差异，并且底部图像示出受共同感染的角膜的明场图像。
具体实施方式
现在将参考附图讨论本发明的方面和实施方案。此外的方面和实施例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本文中提及的所有文献都通过引用并入本文。
氨基酸命名法
氨基酸和氨基酸残基(肽链内的氨基酸部分)通过它们的常规的三字母或单字母代码来提及。大写字母指示天然存在的L-氨基酸，而小写字母表示相应的D-氨基酸。例如，Pro和P表示L-脯氨酸，而pro和p表示D-脯氨酸。
线性肽从N端到C端，从左到右书写。
环肽由序列前面的术语“环”指示。
非天然氨基酸和非天然氨基酸残基是肽链中不天然存在的氨基酸和氨基酸残基。非天然氨基酸可以作为细菌、真菌、植物或海洋生物体中的次级代谢物形成，或者它们可以以化学方法合成。
用星号标识的残基如本文所述进行标记。即，Lys*表示经标记的赖氨酸氨基酸或残基。如本文所述，Lys*用荧光团标记。该荧光团例如通过酰胺键连接在赖氨酸部分的伯胺处。在指定了荧光团的情况下，在紧随残基之后的括号中提供缩写并省略星号。例如，Lys(CF)和K(CF)表示用羧基荧光素酸标记的赖氨酸。
经标记的化合物和诊断方法
本文描述了两种类型的相关化合物，称为经标记的化合物和未经标记的化合物。经标记的化合物带有荧光团，该荧光团可用于诊断诸如真菌性角膜炎(FK)的眼睛感染。经标记的化合物可以作为滴眼剂提供，并且在被施加时结合到受感染区域，并且因此在短时段(例如，长达20分钟)之后，可以通过检测标记的荧光来对感染进行成像。这很容易使用裂隙灯生物显微镜或类似设备来检测。世界各地的大多数眼科诊所、医院眼科和验光实践都有具有荧光功能的裂隙灯生物显微镜，因为这是眼科护理专业人员在日常实践中使用的。当然，可以设想另一种合适的光源和任选的分开的放大器。
本发明的经标记的化合物及其盐，或含有所述化合物或盐的药物组合物可用于诊断微生物感染例如眼睛感染的方法。
诊断患者眼睛感染的方法可以包括以下步骤：
a)将化合物、盐或组合物施加至患者的眼睛；
b)检查所述患者的眼睛以确定是否可检测到荧光；以及
c)记录荧光，如果存在的话，并对该患有眼睛感染的患者进行诊断。
因此，包含适合于施加至眼睛的经标记的化合物的组合物(例如，呈滴眼剂的形式)可以在诊断试剂盒中提供。
本发明人已发现本发明的化合物结合至真菌(诸如FK)、某些细菌和阿米巴。因此，本发明的经标记的化合物可用于检测任何此种感染的存在。
在一些情况下，诊断为对真菌感染，诸如FK的诊断。在一些情况下，诊断为对细菌感染，诸如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染，例如细菌性角膜炎的诊断。在某些情况下，诊断是对阿米巴感染的诊断。
换句话说，在一些情况下，眼睛感染是真菌性眼睛感染。在一些情况下，眼睛感染是细菌性眼睛感染。在一些情况下，眼睛感染与阿米巴，例如阿米巴感染，诸如棘阿米巴角膜炎有关。
因此，应当理解，实践者将认识到，荧光区域的不存在可用于确定患者的眼睛未感染或感染了本发明的化合物不结合至的病原体。例如，荧光的不存在可用于确定患者没有患有FK。
有利地，本发明人已发现，本发明的经标记的化合物显示出与未经标记的化合物类似的期望生物活性，因此在治疗感染方面具有额外的效用。因此，诊断测试本身可以立即启动感染的治疗。如果合适的话，然后可以开出本发明的化合物(或其他合适的剂)的处方。应当理解，所开出的治疗处方通常但不一定是未经标记的化合物。
通过观察和解释与荧光相关的形态，可以确定感染的类型。
因此，在一些情况下，该感染提供了一种诊断患者的眼睛感染的方法，其包括以下步骤：
a)将该化合物、盐或组合物施加至患者的眼睛；
b)检查所述患者的眼睛以确定是否可检测到荧光；以及
c)记录荧光，如果存在的话，观察荧光区域的形态；
d)基于荧光的存在对该患有感染的患者进行诊断，并基于该形态将感染分类为真菌、细菌或阿米巴。
该检查通常将在如本文所述的时间段之后进行，并且将使用裂隙灯生物显微镜或类似装置(或合适的光源和任选的分开的放大器)。观察形态可以利用共焦显微镜。
在一些优选的情况下，眼睛感染是真菌性眼睛感染，诸如FK。有利地，本发明人已发现本发明的经标记的化合物显示出所需的抗真菌活性，并因此在FK的治疗中具有额外的效用。因此，诊断测试本身可以立即启动FK的治疗。如果合适的话，然后可以开出本发明的化合物(或其他抗真菌剂)的处方。应当理解，所开出的治疗处方通常但不一定是未经标记的化合物。
诊断患者的FK的方法可以包括以下步骤：
a)将该化合物、盐或组合物施加至患者的眼睛；
b)检查所述患者的眼睛以确定是否可检测到荧光；以及
c)记录荧光，如果存在的话，并对该患有真菌性角膜炎的患者进行诊断。
该化合物、盐或组合物可以作为滴眼剂施用于患者。随后可以在施用后在检查患者的眼睛之前等待一定时段，例如等待5至30分钟，优选5至20分钟，例如10至20分钟。使用例如裂隙灯以视觉方式检查患者的眼睛，如本领域技术人员所熟悉的。换句话说，步骤(b)可以包括照亮患者的眼睛，然后对其进行视觉检查。经标记的化合物结合至真菌，如果存在的话
，并且可以如所附实施例中所示进行观察。应当理解，此种使用痕迹或染料的观察是技术人员诸如配镜师、验光师、眼科护士和眼科医生所熟悉的。
重要的是，本发明人已发现该结合以及因此检测对于该化合物对其具有活性的感染是特异性的，并且对于检测真菌感染(诸如FK)特别有用，从而确保治疗是适当的。这可能有助于避免抗生素的不必要使用，这是管理抗微生物剂耐药性的流行以及耐药微生物菌株的出现和增殖的重要考虑因素。
成像方法
本发明的化合物、其盐或药物组合物可用于使组织中的微生物生长成像的方法。用于使组织中的微生物生长成像的方法的化合物、其盐或药物组合物是其中Yaa是Lys*、Lys*-Gly、Zaa*或Zaa*-Gly，使得该化合物、盐或药物组合物是经荧光团标记的。
使组织中的微生物生长成像的方法包括：
a)使所述化合物或组合物与组织接触；
b)检测所述化合物或组合物的荧光。
在某些情况下，该生长是真菌，例如与FK相关的真菌的生长。在一些情况下，该生长是细菌，诸如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的生长。在某些情况下，该生长是阿米巴的生长。
应当理解，该成像可用于确定生长的存在，生长的存在可用于诊断患者中如上所述的感染。该成像也可以在实验室中作为体外方法或离体方法，例如用于研究目的或在尸检期间。生长的类型可以通过观察和解释荧光的形态来确定。观察形态可以利用共焦显微术(例如滑移灯生物显微镜(slip lamp biomicroscope))或类似技术，尽管其他成像和放大技术可以酌情使用并且在本领域中是已知的。
因此，本发明可以提供如本文所述的经标记的化合物在微生物生长，例如体内、离体或体外的真菌、细菌或阿米巴生长的成像中的用途。
氟树脂(Fluoropfwres)
本发明的经标记的化合物带有荧光团。术语荧光团是本领域所理解的并且是指在光激发后可以重新发射光的荧光化学化合物或部分。
由于MFIGA001在体外具有最强效的抗真菌活性，因此它被认为是作为诊断剂评估的最合适的候选物，但应当理解，本文描述的其他化合物可以以相同的方式被标记。
用于制备如本文所述的经标记的化合物的合适的荧光团包括青色素5和羧基荧光素。还设想了其他花青染料，例如Cy5.5或Cy7。具有符合眼科使用的国际标准和安全性要求(诸如眼科仪器的ANSI Z80.36-2016标准，或ISO15004-1和15004-2:2007标准)的发射和激发波长的其他可商购获得的荧光团也可用于标记本发明的化合物，例如MFIGAF001。
连接至胺基的方式将是本领域技术人员所认可的，但可包括酰胺键形成、磺酰胺键形成和离去基团置换以产生仲胺。
优选的荧光团是青色素5和羧基荧光素，它们经由酰胺键连接。
治疗方法
所述化合物(经标记的和未经标记的)及其盐，或含有所述化合物或盐的药物组合物可以用于治疗方法。
该治疗方法可以是治疗真菌感染诸如真菌性角膜炎的方法。该治疗方法可以是治疗细菌感染诸如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染的方法。该治疗方法可以是治疗阿米巴感染的方法。该治疗方法可以是治疗微生物感染的方法。
药物组合物
本发明的化合物或其盐可以以药物组合物提供。换言之，本发明提供了本发明的药物组合物，其包含本发明的化合物或盐和药学上可接受的赋形剂。
适当地，药物组合物被配制用于例如作为滴眼剂向眼睛施用。因此，药物组合物可以提供在滴眼管瓶中，或提供在具有移液管的瓶中，或提供在一次性使用滴眼剂容器中。
药物组合物可以酌情用于检测/诊断和/或治疗，并且可以相应地进行标记或附有合适的说明书。
***
在前述描述或所附权利要求或附图中公开的特征(以其具体形式或根据用于执行所公开功能的方式或用于获得所公开结果的方法或过程来表述)，视情况而定，可单独地或以此类特征的任何组合被用来以其各种形式实现本发明。
虽然已经结合上述示例性实施方案描述了本发明，但是当给出本公开时，许多等效修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，上面阐述的本发明的示例性实施方案被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下可对所描述的实施方案作出各种修改。
为了避免任何疑问，本文中提供的任何理论解释都是为了提高读者的理解而提供的。本发明人不希望受这些理论解释中的任何解释的束缚。
本文所使用的任何小节标题仅出于组织性目的并且不应解读为限制所描述的主题。
在整个说明书(包括所附权利要求)中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和"包括"和诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”和"包括"的变型应理解为暗示包含陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。
必须指出的是，除非上下文另有明确规定，如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一种/个(a)”、“一种/个(an)”和“该(the)”包括复数指示物。范围可在本文中被表述为从“约”一个具体值和/或至“约”另一个具体值。当表述此种范围时，另一个实施方案包括从该一个具体值和/或至该另一个具体值。类似地，在通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应了解具体值形成另一个实施方案。与数值相关的术语“约”是任选的并且表示例如+/-10％。
合成实施例
化学品
除非另有说明，所有化学品均购自Sigma-Aldrich(https://www.sigmaaldrich.com)。所有购买的可商购获得的试剂都在未经进一步纯化的情况下使用。
器皿
除非另有说明，所有有机化学反应均在干燥清洁的玻璃器具中在氮气下进行。所有肽合成反应都在配有聚乙烯多孔盘的聚苯乙烯注射器中进行。所有微波反应均使用带有用于内部温度测定的表面传感器的聚焦单模式微波炉(CEM Corporation的“Discover”)进行。在反应期间通过对微波室进行通风的压缩空气来提供冷却。
薄层色谱
为了监测反应的进展或纯化的进展，在Merck硅胶60F254片上执行薄层色谱(TLC)，并将其通过254nm和365nm波长的紫外(UV)光可视化。
HPLC仪器
分析型HPLC：
在与多波长UV检测系统连接的Agilent 1100分离模块上进行分析型高效液相色谱(HPLC)分析。用于分析型HPLC的参数为：
固定相：Symmetry C18柱，4.6×150mm，粒径尺寸为5μm。流动相：A：水+0.1％甲酸(FA)，B：乙腈+0.1％ FA。使用线性流动相梯度，流速为1mL/min。标准样品制备：注入10μL1mg/mL浓缩的样品在MeOH中的溶液。检测：根据样品，从280nm至至多650nm进行吸光度检测。保留时间(tR)以分钟记录。
制备型HPLC
除非另有说明，否则肽粗品均使用Agilent 1100半制备型HPLC系统进行纯化。用于制备型HPLC的参数为：
固定相：Agilent半制备型C18柱，21.2×150mm，直径尺寸为10μm。流动相：A：水+0.1％ FA，B：乙腈+0.1％ FA。使用线性流动相梯度，流速为20mL/min。标准样品制备：多次注入50μL 10mg/mL浓缩的样品在水中的溶液。检测：根据样品，从280nm到650nm进行吸光度检测。
核磁共振(NMR)仪器
1H-NMR和13C-NMR谱在Bruker Avance 500(500MHz)或Avance 400(400MHz)仪器上记录。化学位移以自内标Me4Si(δ＝0ppm)的低场的δppm报告；J值以Hz提供。多重性用以下符号表示：s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、dt(双重三重峰)、dd(双重双峰)、ps(伪单峰)、pd(伪双峰)。
质谱(MS)仪器
使用LTQ-FT Ultra(Thermo Scientific)质谱仪获得电喷雾电离(ESI)正高分辨率质谱(HRMS)分析数据。使用Bruker Ultraflex质谱仪进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析。
合成实施例1-荧光探针的制备
可商购获得的荧光探针
为本研究购买的荧光探针列于表2中。丹磺酰氯和羧基荧光素购自MerckMillipore，纯度为95％。其余荧光探针购自Sigma Aldrich。应当理解，这些荧光团可以用作本发明化合物中的荧光团。
表2-可商购获得的荧光探针
合成的荧光探针
本研究中合成的荧光探针列于表3中。
表3-合成的荧光探针
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合成实施例1a-Cv5
2-((1E,3Z)-3-(5-羧基吡啶-2-基)-5-((E)-1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基)五-1,3-二烯-1-基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-碘化鎓(Cy5)：
将3H-吲哚鎓-2,3,3-四甲基碘(198mg,MW＝274.8,0.72mmol)、NaOAc(270mg,MW＝266.1,0.72mmol)和6-(1,3-二氧丙烷-2基)烟酸(100mg,MW＝193.2,0.36mmol)与10mLAc2O/AcOH(1:1)一起添加到微波反应器皿中。然后将混合物在微波照射下加热至160℃保持0.5h，之后在真空下蒸发溶剂。然后使用柱色谱法(DCM:MeOH 98:2至90:10)纯化粗品以产生呈蓝色固体的2-((1E,3Z)-3-(5-羧基吡啶-2-基)-5-((E)-1,3,3-三甲基二氢吲哚-2-亚基)五-1,3-二烯-1-基)-1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-碘化鎓(144mg，收率80％，纯度>98％)。
HPLC:tR:＝4.72min
MS(m/z)：C33H34N3Q2 +的[M+]计算值：504.3；实测值：504.4。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.26(d,J＝1.3Hz,1H),8.44(s,1H),8.41(s,1H),8.40(d,J＝2.2Hz,1H),8.39(d,J＝2.2Hz,1H),7.65(d,J＝7.4Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),7.42(dd,J＝8.0,1.2Hz,2H),7.40(d,J＝1.1Hz,2H),7.28(ddd,J＝7.4,6.5,1.9Hz,4H),5.85(d,J＝14.3Hz,4H),3.39(s,3H),1.91(s,6H),1.76(s,6H)。
13C NMR(126MHz,DMSO)δ174.4(2C),172.5(C),165.0(C),151.4(CH),143.1(C),141.6(2C),128.9(4C),125.5(2CH),122.8(2CH),111.8(2CH),101.0(2CH),95.1(2CH),63.3(2C),49.6(C),31.5(2CH3),27.4(2CH3),21.6(2CH3)。
合成实施例2-肽的一般制备
一般固相肽合成(SPPS)程序
固相肽合成由从C端到N端组装氨基酸组成。α-羧基基团经由酸不稳定的接头连接到固体支持物。常用的树脂由聚苯乙烯组成。氨基酸的氨基端受到碱不稳定的Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)保护基团的保护，而侧链通常受到酸不稳定基团的保护。将第一个氨基酸负载到树脂上后，在温和的碱性条件下除去Fmoc基团(脱保护)。然后进行游离胺测试以确认所有Fmoc保护基均被除去。然后，通过激活下一个Fmoc氨基酸的羧基将该下一个Fmoc氨基酸连接到不断生长的肽(偶联)。然后进行Kaiser/溴酚蓝测试以确认树脂上的所有游离胺均已发生完全偶联。然后通过Fmoc氨基端基团的脱保护和下一个氨基酸的偶联的循环进行合成，直到肽已完全合成。最后将肽从树脂上裂解，并使用三氟乙酸除去侧链保护基团(裂解)。
树脂负载
本研究中使用的大多数树脂均预先负载有Fmoc保护基团或氨基酸。在其他情况下，例如当使用2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂时，进行以下程序。将Fmoc-氨基酸(AA)-OH(1当量)与DIPEA(3当量)一起在DCM中在室温下连接到树脂(1当量)，持续10min，然后将DIPEA(7.0当量)连接到树脂，持续40min。添加0.8μL MeOH/mg树脂封闭剩余的三苯甲基，持续10min。之后，过滤树脂并用DCM(4×1min)和DMF(4×1min)洗涤。通过滴定Fmoc基团来确定树脂的负载量。
经由Fmoc定量确定树脂负载量
一般来说，在第一个合成步骤后，通过测量二苯并富烯-哌啶加合物的吸光度来确定树脂负载量。精确称重三等分的Fmoc-氨基酸树脂(约1mg)并将其悬浮在1ml哌啶溶液(20％在DMF中)中。30min后，将混合物按1:10稀释，并使用50μl紫外石英微量比色皿并使用哌啶溶液(20％在DMF中)作为空白在Agilent 8453紫外-可见分光光度计中在单光束模式下在290nm和330nm处测量吸光度。根据比尔-朗伯定律计算树脂负载量。
L(％)＝C实际/C理论
同时，C实际＝(A290-A空白)/￡Fmoc，其中￡Fmoc＝8100M-1cm-1(290nm)，并且C理论＝m树脂×L树脂。
L：经负载树脂的百分比；C实际：溶液中实际Fmoc-哌啶加合物的浓度；C理论：溶液中理论Fmoc基团的浓度；A290：290nm处的吸光度；m：称重的树脂量(mg)；F树脂：树脂负载量(mmolg-1)。
Fmoc脱保护的标准程序
通过将珠粒在20％的哌啶在DMF中的溶液中振摇来去除Fmoc基团(1×1min，2×10min)。然后用DMF并在此后用DCM彻底洗涤珠粒。在每个脱保护步骤后进行溴酚蓝测试和Kaiser测试。在脱保护不完全的情况下，重复该程序。
游离胺测试
在每个脱保护步骤后进行溴酚蓝测试和Kaiser测试。当发现脱保护不完全时，重复该程序。
溴酚蓝测试
在进行此测试之前，用DMF充分洗涤树脂。
溶液1：0.05％的溴酚蓝在DMA中的溶液(25℃下储存)
程序：
1)将少许树脂珠粒放入小试管中。
2)添加5-10滴溶液。
3)立即检查。
表4-溴酚蓝测试结果说明
Kaiser测试
溶液1：100mL乙醇中的5g茚三酮(25℃下储存，包上箔纸(folied)置于暗处)
溶液2：20mL乙醇中的80g苯酚(25℃下储存，包上箔纸置于暗处)
溶液3：在98mL吡啶中的2mL 0.001M KCN(25℃下储存，包上箔纸置于暗处)
程序：
1)将少许树脂珠粒放入小试管中。
2)用乙醇洗涤树脂2-3次，以除去吸附的DMF。
3)每种溶液添加2-5滴，然后混合并加热至100℃保持2min。
表5-Kaiser测试结果说明
N-Fmoc氨基酸偶联的标准程序
在使树脂负载并去除Fmoc基团后，用DMF(4×1min)、DCM(3×1min)和DMF(4×1min)洗涤树脂。除非另外指出，否则使用适当的Fmoc-α氨基酸(3当量)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC，6当量)和OxymaPure(3当量)在DMF溶液中的溶液执行标准偶联程序，持续1h。混合溶液后，在施加到树脂上之前进行五分钟的预-活化程序。通过Kaiser测试来监测偶联的完成情况。如果结果为阳性，则重复之前的步骤。否则，过滤树脂并用DCM(4×1min)和DMF(4×1min)洗涤树脂，并以相同的方式使后续氨基酸偶联，直到肽达到其设计长度。
N-末端乙酰化
在最终偶联步骤和最终Fmoc脱保护之后，用Ac2O(10当量)和DIPEA(20当量)在DMF中的溶液处理树脂。在室温下反应1h后，将树脂沥干并再次用相同量的新鲜反应混合物再处理1h。然后，用DMF(4×3min)、DCM(4×3min)彻底洗涤树脂，并将其在真空下干燥12h。
侧链脱保护
一般侧链脱保护
除非另有说明，否则在最终裂解步骤期间使用适当的基于TFA的混合液(cocktail)试剂去除侧链保护基团(例如tBu、Boe、Trt)。
烯丙氧羰基(Alloc)脱保护
将三苯基膦(PPh3，0.8当量)和乙酸钯(Pd(AcO)2，0.2当量)与少量DMF混合，并对混合物进行超声处理，直至形成鲜艳的浅棕色混浊混合物。然后将此混合物与苯基硅烷(PhSiH3，12当量)和5mL干燥DCM一起添加到树脂中(2×20min)。
最终裂解
聚苯乙烯(PS)树脂的一般裂解
通过将珠粒在5ml适当的混合液试剂(基于TFA)中在室温下搅拌2h来除去树脂和侧链保护基团。用TFA彻底洗涤珠粒，并将其在旋转蒸发后用冰冷的乙醚沉淀。
裂解混合液1：82.5:5:5:2.5:5-TFA/水/茴香硫醚/EDT/苯酚
裂解混合液2：85:5:5:5-TFA/水/TIS/苯酚
裂解混合液3：95:2.5:2.5-TFA/水/TIS
裂解混合液4：95:5-TFA/水
2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂的裂解
将树脂结合的肽用含1％TFA的DCM处理5次(每次处理1min)并用DCM洗涤。将合并的经过滤的混合物倒在DCM上并真空蒸发。
合成实施例4-新型合理设计的线性PAF26衍生物肽的制备
本研究中设计的线性PAF26衍生物(名为MFIGAF000、MFIGAF002、MFIGAF003和MFIGAF004)是基于计算分析，并在表7中列出。它们是经由如前所述的SPPS Fmoc化学法在2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂上合成的，它们的序列的中间掺入了一个额外氨基酸。使用含1％ TFA的DCM将它们在所有侧链均受到保护的情况下从树脂上裂解下来。然后使用裂解混合液2进行强力裂解以去除侧链保护基团。
通过半制备型RP-HPLC(Agilent半制备型C18柱，21.2×150mm，直径尺寸为10μm)用流动相如ACN(0.1％FA)/H2O(0.1％FA)以2mL·min-1的流速纯化肽粗品。在纯化后，将纯级分冻干以产生表7中列出的肽。
表6
表7-新型设计的线性肽的表征数据
合成实施例5-新型合理设计的环PAF26衍生物肽的制备
通过对肽MFIGAF000、MFIGAF002、MFIGAF003和MFIGAF004进行N至C端环化来合成MFIGAF005、MFIGAF001、MFIGAF007和MFIGAF008。肽MFIGAF000、MFIGAF002、MFIGAF003和MFIGAF004的合成与如先前所述相同地进行。然后将1当量侧链保护的CMN肽以100mg/mL的浓度溶解在DMN中。将1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓-3-氧化六氟磷酸盐(HATU，1当量)和2.5当量DIPEA添加到溶液中。使反应在室温下进行2h，然后使粗产物在水中沉淀。然后使用裂解混合液2(85:5:5:5-TFA/水/TIS/苯酚)在室温下进行强裂解，持续4h。此后，将溶液浓缩并使用Et2O沉淀。最后，通过半制备型RP-HPLC(Agilent半制备型C18柱，21.2×150mm，直径尺寸为10μm)用流动相如ACN(0.1％FA)/H2O(0.1％FA)以2mL·min-1的流速进行纯化。在纯化后，将纯级分冻干以产生表8中列出的肽。
表8-新型设计的环肽的表征数据
表9-环肽的光谱表征数据
成像方法和样品制备
活细胞成像的样品制备
使用于共焦活细胞成像的粗糙脉孢菌(N.crassa)交配型A WT在100％ Vogel琼脂培养基上于25℃生长3-5天，然后收获孢子。使用于共焦活细胞成像的烟曲霉菌CEA10菌株在100％ Vogel培养基上于37℃生长4-5天，然后收获孢子。在进行共聚焦实验之前，将粗糙脉孢菌孢子在8孔玻片培养室中于25℃在液体的10％Vogel培养基中温育3h，并且将烟曲霉菌孢子于25℃在液体的10％ Vogel培养基中温育16h，以便使萌发完全发生以进行成像。
宽视场显微术
使用倒置Nikon Eclipse TE2000E显微镜进行宽视场落射荧光显微术，该显微镜配备有DIC光学器件、60×(1.3NA)平面荧光物镜，并配备有Nikon DXM1200F相机和用于图像捕获的ACT-1软件。LED激发系统(CoolLED,pE300)在550nm处激发碘化丙啶荧光。使用500nm双色向滤光器(dichromic filter)和575nm长通发射滤光器进行荧光可视化。随后使用ImageJ软件加工图像。以.xlsx格式保存数据以供分析。
共聚焦显微术
使用配备有光电倍增管(PMT)、混合GaAsP(HyD)探测器和63倍水浸物镜的LeicaTCS SP8共焦激光扫描显微镜对萌发的真菌孢子进行活细胞成像。使用莱卡转盘白光激光器(WLL，450-750nm)、氩激光器(458nm、476nm、488nm和496nm)和紫外激光器(405nm)进行荧光激发。
表10-经荧光标记的肽的成像条件
应当理解，其他荧光团的成像条件对于技术人员来说是显而易见的。
图像加工
使用由Bitplane(Zurich,Switzerland)开发的lmaris Scientific3D/4D图像加工和分析软件8.0对从本研究获得的图像进行加工和分析。
生物学实施例
真菌物种和菌株
所有使用的真菌菌株都列于表11至13中。
表11-粗糙脉孢菌菌株
表12-烟曲霉菌菌株
表13-尖孢镰刀菌菌株
培养基和生长条件
本研究中使用的储备培养基溶液的配方在表14和15中示出。在高压灭菌之前，将储备液稀释并与琼脂(Oxoid Ltd.)混合至2％(w/v)。Vogel液体培养基省略了琼脂。
表14-对于每升dH2O的Vogel 50×储备溶液的组成
表15-对于每升dH2O的Vogel微量元素溶液的组成
注意：将成分以所示顺序添加，并且在添加下一种成分之前进行搅拌直至溶解。
粗糙脉孢菌的培养和收获
除非另有说明，否则粗糙脉孢菌的温育在25℃在温育箱中在恒定的人造光下进行。
对于分生孢子培养，将菌株接种在小型(35×10mm)Vogel培养基板(Vogel.1956)上并温育五天。在第五天到第七天从培养物中收获分生孢子。在此之后不再收获分生孢子，以确保所有分生孢子的年龄相同。
对于突变菌株，通过将52μl潮霉素B添加到300ml Vogel培养基中来向培养基中补充潮霉素B至最终浓度为200μg/ml。
通过在培养物表面上重复洗涤1ml，在无菌dH2O中从板中收获粗糙脉孢菌分生孢子。然后将所得悬浮液通过三层Miracloth过滤以除去菌丝碎片。然后剧烈涡旋孢子悬浮液以分离分生孢子并确保它们的均匀分布。将10μl悬浮液混合到990μl dH2O中，并使用Fuchs-Rosenthal血球计(http://www.marienfeld-superior.com)测定分生孢子密度。
培养和收获烟曲霉菌
使烟曲霉菌菌株在沙氏(Sabouraud)葡萄糖琼脂(SAB琼脂)上于37℃生长3天。通过用抹刀在真菌菌落表面轻轻刮擦，将分生孢子收集在补充有0.1％tween-20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水中。然后使孢子溶液穿过经高压蒸气灭菌的Miracloth以去除任何菌丝残留物，并将该溶液储存在4℃下。按照与针对粗糙脉孢菌所描述的方式相同的方式对孢子进行计数并测定浓度。
培养和收获尖孢镰刀菌
使尖孢镰刀菌在液体的马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)中于28℃在振摇(170rpm)下生长5天。将悬浮液通过折叠的Miracloth(4层)过滤并在室温下离心10min。弃去上清液，将沉淀重悬于1.5mL无菌dH2O中并进行定量。
念珠菌和隐球菌菌株的培养和收获
使所使用的念珠菌属(Candida)菌株于37℃在SAB琼脂上生长3天，并且使隐球菌属(Cryptococcus)菌株于37℃在SAB琼脂上生长6天。使用无菌接种环通过如下方式收获细胞：取出单个菌落并重悬于补充有0.1％tween-20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水中。然后用血细胞计数器对细胞浓度进行定量。为了确定最小抑制浓度，用20％液体Vogel培养基将细胞密度调整至106个细胞/mL。
细菌菌株的培养和收获
使所使用的细菌菌株于37℃在溶源肉汤(Lysogeny Broth,LB)琼脂上生长1天，并使用无菌接种环通过取出单个菌落并重悬于PBST中来收获该细菌菌株。使用血细胞计数器对细胞浓度进行定量。为了确定最小抑制浓度，用20％液体LB培养基将细胞密度调整至106个细胞/mL。
生物学实施例1-抗真菌活性测定
基于生物质光密度测量值的IC50测定
经由此方法确定了所有未经标记的肽对真菌生长的剂量依赖性抑制(由IC50值指示)。使用Nunc 262162 U96聚苯乙烯圆底透明板(www.nuncbrand.com)进行测定。
当针对烟曲霉菌测试肽时，将不同浓度的肽与烟曲霉菌分生孢子混合以达到每孔100μL的最终体积。在10％ Vogel培养基中的最终分生孢子浓度为5×105个细胞/mL。在96孔板中于37℃温育24h后，通过在TriStar LB 941多模式酶标仪中测量610nm处的光密度来确定不同肽浓度下的真菌生长。使用由Sigma Plot 10.0提供的四参数逻辑回归公式确定IC50值。值表示为两次独立实验的平均值±SEM(n＝3)。
当针对粗糙脉孢菌和尖孢镰刀菌测试肽时，如上所述进行实验，不同之处是将温育温度改变为25℃(对于粗糙脉孢菌)和35℃(对于尖孢镰刀菌)。
基于荧光素酶测定法进行的经荧光标记的化合物的IC50测定
使用上一节中描述的光密度方法无法准确测定经荧光标记的肽的IC50。这是因为荧光团结构吸收610nm处的光，这是用于光密度测量的波长。为了克服这个问题，使用了从Promega购买的BacTiter-GloTM微生物细胞活力测定试剂盒。BacTiter-GloTM试剂依赖于将产生“辉光型(‘glow-type’)”发光信号的专有的热稳定的荧光素酶(Ultra-GloTM重组荧光素酶)和用于从真菌细胞中提取ATP的专有配方的特性。这种发光信号是由方案1所示的荧光素酶反应产生的，根据实验条件，其信号半衰期超过30min。该发光信号与存在的ATP的量成比例，该ATP的量与存在于培养物中的活细胞的数目成正比。
方案1-荧光素酶反应。在Mg2+、ATP和分子氧存在下通过荧光素酶催化荧光素的单氧化。
使用Greiner CELLSTAR白色聚苯乙烯孔平底96孔板对所有经荧光标记的肽进行IC50测定。温育条件与上一节中描述的光密度测量保持相同。温育程序完成后，将板平衡至室温。然后将BacTiter-GloTM缓冲液和底物的混合物添加到板中(每孔100μL)。将板振摇5min并使用Tristar LB491光度计读数。使用Sigma Plot 10.0进行数据分析。显示的所有值均以两次独立实验(n＝3)的平均值±SEM表示。
表16-针对MFIGAF001和类似物测定的抗真菌功效
*IC50(mg/L)值表示至少三次独立实验的平均值
生物学实施例2
已评估MFIGAF001对多种真菌(包括烟曲霉菌和尖孢镰刀菌)的抗真菌活性，表明MFIGAF001对主要病原真菌表现出亚微摩尔IC50值。还观察到对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。
表17
MIC＝最小抑制浓度
生物学实施例3
MFIGAF001与其类似化合物(0％纯度)相比在37℃下用灰色链霉菌蛋白酶混合液处理24h后表现出极大的稳定性(99％纯度，即保留完整肽)(图1)。因此，MFIGAF001具有良好的热稳定性，并且能抵抗蛋白酶消化。
表18-灰色链霉菌蛋白酶随时间的热稳定性
生物学实施例4
即使在0.5mg/L(440μM)的浓度下，MFIGAF001对A549也几乎没有表现出细胞毒性(图2)。
使用Invitrogen的Vybrant MTT细胞增殖测定试剂盒测定MFIGAF001对人肺上皮细胞系A549的细胞毒性。
生物学实施例5
还对人红细胞(HRBC)进行了细胞活力测定，表明MFIGAF001/MFIGAF002/MFIGAF001a(10μM)对HRBC没有溶血活性(图3)。
从新鲜抽取的抗凝人血中分离红细胞，并将其用PBS(1:5)稀释。将50μl的量的红细胞悬浮液添加到50μl 10μM化合物中。DMSO用作阳性对照，并且PBS用作阴性对照。将板于37℃温育1h，将每个孔用150μl PBS稀释，并将板在1,200g下离心15min。将每孔总共100μl上清液转移至新鲜板中，并在酶标仪中测量350nm处的吸光度。数据表示为作为来自三次独立实验(n＝3)的平均值的细胞活力的百分比。
生物学实施例6
MFIGAF001、MFIGAF001a和MFIGAF001b没有表现出明显的毒性(图4)。
MFIGAF001还由CRO(Evotec)在符合OECD要求的重建的角膜样上皮细胞模型(RhCE、EpiOcularTM)中进行了独立评估。即使在0.5mg/L(440μM)下，也未观察到细胞毒性。
表19-平均组织OD和活力
OD＝光密度；NI＝无刺激性；I＝刺激性
表20-平均组织OD和活力
/>
OD＝光密度；NI＝无刺激性；I＝刺激性
生物学实施例7
在体内对兔眼睛进行了耐受性研究，未出现眼睛刺激性现象(图5)。测试了三只兔(兔1、2和3)。所有兔在治疗后立即和接下来的7天内似乎都没有受到任何影响，且没有任何刺激性迹象并且一般状况也没有变化。MFIGAF001a以10μM和50μL使用并且让其进入兔的右眼中。
MFIGAF001a在兔眼中具有良好的耐受性。
生物学实施例8
猪角膜制备
新鲜收获的猪眼(整个眼球)是在处死后24小时内从当地屠宰场收集的。所有后续程序均在无菌条件下进行。用补充有0.1％tween-20和5％青霉素-链霉素(PBST-PS，Sigma-Aldrich)的50mL无菌磷酸盐缓冲盐水洗涤眼球10分钟。角膜解剖在II级微生物安全柜中进行，以避免潜在的污染。使用无菌器械，通过在角膜缘处进行角膜巩膜解剖来将角膜从眼球中取出，留下2-3毫米的巩膜边缘。然后去除诸如虹膜或晶状体的任何其他组织，留下单独的角膜钮形物(corneal button)。然后将角膜在5mL无菌PBST-PS中通过轻轻浸没并振摇约1分钟来轻轻洗涤3次。使用无菌镊子夹住巩膜边缘，并在该程序过程中注意不要刮伤角膜表面。然后将经洗涤的角膜放入含有新鲜PBST-PS的无菌培养皿中，直至解剖时程(<1小时)完成。完成解剖后，将每个单独的角膜纽形物转移到含有1mL培养基(RPMI-PS或PBST-PS，表1)和一个上皮朝上的角膜钮形物的6孔组织培养板的孔中。
烟曲霉菌对角膜的感染
从在PBST中37℃的SAB琼脂上生长的3天龄培养物中收获YFP-烟曲霉菌孢子，并使用血细胞计数器对其进行定量。
将含有角膜纽形物和培养基的有盖6孔培养板放置在II级柜中，使用无菌皮下注射针(规格27G，B BraunTM，Fisher Scientific)轻轻划伤角膜上皮的中心区域，以平行产生5处线性磨损。使用1μL无菌接种环以划动的动作转移浓度为106至103孢子/mL(含有大约1000个至大约1个孢子，这取决于实验设置)的1μL接种物。每次接种时进行活菌计数，以确认每种悬浮液中的孢子数。将6孔培养板关合并静置10-15分钟，然后转移至温育箱。将角膜纽形物于37℃下温育所需的时段(从1小时到48小时，这取决于实验设置)，补充有5％CO2。将未受感染的角膜以相同的方式划线接种1μL无菌PBS，然后与受感染的角膜一起维持在同一6孔培养板中以进行每次实验。在培养时段期间每24小时更新培养基，通过在除去现有培养基后避开角膜移液来添加新鲜培养基。每24小时定期核查放置每个角膜的培养基中是否存在真菌，以确保唯一的感染部位位于角膜组织的顶部(top sode)上，而不是来自下方。从实验中取出在培养基中有肉眼可见的真菌生长的角膜样品。经过所需的培养时段后，将角膜纽形物从温育箱中取出以进行后续成像。当多个角膜纽形物等待成像时，在其他纽形物被成像的同时，未被成像的纽形物在将6孔培养板包裹在石蜡膜(Bemis，HeathroScientific)中后在短时段(少于2小时)内储存在4℃下。
通过使用共焦显微术在所需时间点对活细胞成像来监测感染的进展。从6孔培养板中取出培养的角膜纽形物，并将上皮朝下放入2孔ibidi成像室(ibidi GmbH，Martinsried，Germany)中。该成像室填充有与用于感染实验的培养基匹配的1mL培养基(RPMI-PS或PBST-PS，表1)。采用具有长工作距离25倍水浸物镜的Leica TCS SP8共焦显微镜(Leica Microsystems Ltd.，Milton Keynes，UK)对烟曲霉菌角膜感染的发展进行成像。使用514nm的激发波长和525-545nm之间的发射波长对烟曲霉菌表达的YFP进行成像。使用“Z补偿函数”对激光激发进行细微调整，以补偿角膜较深部分的信号减少。这些调整跨z堆栈的5个点完成，从而防止采集曝光过度或曝光不足。使用lmaris v8.0软件(BitplaneScientific软件模块；Zurich,Switzerland)分析所采集的图像。使用lmaris上的“表面模块”将荧光信号转换为“表面模型”，以对占据的活真菌生物量进行定量。
MFIGAF001减少感染了YFP-烟曲霉菌的离体角膜中的真菌负荷。在宏观水平上，图6显示在经盐水处理的角膜1中真菌感染已大大进展，而经MFIGAF001处理的角膜2在处理72h后显示出较不严重的感染。
两个角膜被约1个孢子/角膜YFP表达烟曲霉菌感染，黄色荧光信号指示渗透到角膜基质中的活真菌负荷。在PBST-PS中温育36小时后建立感染。感染建立后，通过局部施用用盐水或MFIGAF001处理角膜。在前8小时内，每2小时使用一滴试剂处理所有角膜，然后在剩余的16小时内每8小时使用一滴试剂处理所有角膜。使用此治疗方案继续治疗72小时。纳他霉素以120mg/L使用。
图7示出了经MFIGAF001处理的角膜2中活真菌负荷的消除，其中荧光信号(原始图表中的黄色，此处再现的白色)指示渗透到角膜组织中的活真菌负荷。
生物学实施例9
MFIGAF001离体表现出与纳他霉素相当的功效。在前8小时内，每2小时使用一滴处理所有角膜，然后在剩余的16小时内每8小时使用一滴试剂处理所有角膜。
使用此治疗方案继续治疗72小时。MFIGAF001以100mg/L使用。纳他霉素以120mg/L使用。结果在图8中示出，其中荧光信号(原始图表中的黄色，此处再现的白色)指示渗透到角膜组织中的活真菌负荷。
生物学实施例10
发明人已经表明，荧光诊断剂MFIGAF001a和MFIGAF001b即使是在低浓度下标记了引起真菌性角膜炎的所有主要病原真菌。主要病原真菌包括白色念珠菌、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌和新型隐球菌。图9示出了MFIGAF001a和MFIGAF001b(荧光，2.5μM)在与各种病原真菌(白色念珠菌、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌和新型隐球菌)一起在RPMI中于37℃温育15min后的活细胞成像，其证明了MFIGAF001a表现出快速且高度荧光的标记。图10示出了在与烟曲霉菌一起在RPMI中于37℃温育的MFIGAF001a(荧光，2.5μM)的活细胞成像。
生物学实施例11
MFIGAF001选择性地标记烟曲霉菌而不是人上皮细胞系A549。图11示出了于37℃下在RPMI中添加MFIGAF001a(荧光，2.5μM)后10min烟曲霉菌与人上皮细胞系A549的共培养物的活细胞成像。
生物学实施例12
对猪角膜感染模型中的MFIGAF001a进行了研究(图12)。经MFIGAF001a(原始数据中的红色，此处显示为白色；条件：2.5μM，37℃温育15min)选择性标记的烟曲霉菌的活细胞成像。
使用与上述(生物学实施例8)相同的方法用烟曲霉菌感染猪角膜。确认感染成功后，将1滴MFIGAF001水溶液(2.5μM)局部添加到角膜表面，并在共聚焦显微术之前于37℃温育15min。
生物学实施例13
MFIGAF001a对诸如革兰氏阴性细菌假单胞菌的细菌表现出极大的选择性(图13)。MFIGAF001a标记革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。(图14)。
生物学实施例14
本发明人已经证明MFIGAF001a可用于区分真菌性角膜炎和革兰氏阳性细菌性角膜炎。
图15示出了在Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(购自Thermo Fisher Scientific)中受烟曲霉菌和金黄色葡萄球菌共同感染48h的猪角膜感染模型中的MFIGAF001a(荧光，2.5μM，37℃下温育15min)的活细胞成像。当使用基于评估荧光区域的形态的共聚焦显微术时，可使用经标记的化合物区分真菌和金黄色葡萄球菌。真菌菌丝可以基于其特有的丝状形状进行观察和识别，并且它的尺寸与看起来小得多且具有点状形状的细菌相比要大得多。
参考文献
上面引用了许多出版物，以便更全面地描述和公开本发明以及本发明所属领域的现有技术状态。下面提供了这些参考文献的完整引用。这些参考文献中每一篇的全部内容均并入本文。
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Claims (15)

1.一种式I或式II的化合物：
环(Arg-Lys-Lys-Xaa-Trp-Phe-Trp-Yaa)式I
R1-Arg-Lys-Lys-Xaa-Trp-Phe-Trp-Yaa-R2式II
或其药学上可接受的盐，其中
R1为H、C1-4烷基、C1-4酰基、磷酰基(PO3 2-)或生物素基；
R2为OH、NH2、H或O(C1-4烷基)；
Xaa是具有疏水性侧链的天然或非天然氨基酸残基；
Yaa选自Gly、Lys、Lys-Gly、Lys*、Lys*-Gly、Zaa、Zaa*、Zaa-Gly和Zaa*-Gly，其中Zaa是具有游离胺、叠氮化物或炔烃侧链的非天然氨基酸，并且Zaa*是用荧光团官能化或带有荧光团的所述非天然氨基酸；并且
其中Lys*，如果存在的话，是带有荧光团的赖氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中Xaa选自Phe、phe、Ala、ala、Pro、pro、Gly、Val、val、Leu、leu、Ile、ile、Met、met、Tyr、tyr、Trp和trp；任选地，其中Xaa选自phe、ala、pro和Pro。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物或药学上可接受的盐，其中Yaa是Gly。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物或药学上可接受的盐，其中Yaa是Lys*或Lys*-Gly。
5.根据权利要求4所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物或盐具有式I。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述荧光团选自羧基荧光素酸和青色素5。
7.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物选自MFIGAF001、MFIGAF005、MFIGAF007和MFIGAF008。
8.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物是经荧光团标记的MFIGAF001。
9.根据权利要求1所述的化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物选自MFIGAF000、MFIGAF002、MFIGAF003和MFIGAF004。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1至9中任一项所述的化合物或盐和药学上可接受的赋形剂。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或盐，或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于治疗方法。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或盐，或根据权利要求10所述的药物组合物，其用于治疗真菌感染、细菌感染或阿米巴感染的方法。
13.根据权利要求12所述使用的化合物或盐，其中所述感染是真菌性角膜炎或细菌性角膜炎。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或盐、或如权利要求10所述的药物组合物，其中Yaa是Lys*、Lys*-Gly、Zaa*或Zaa*-Gly，其用于诊断患者的真菌、细菌或阿米巴感染的方法，所述方法包括：
a)使所述化合物、盐或组合物与所述患者的眼睛接触；
b)检查所述患者的眼睛以确定是否可检测到荧光；以及
c)记录荧光，如果存在的话，并对所述患有真菌、细菌或阿米巴感染的患者进行诊断。
15.一种使用根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或盐，或权利要求10所述的药物组合物对组织中微生物生长进行成像的方法，其中Yaa是Lys*、Lys*-Gly、Zaa*或Zaa*-Gly，所述方法包括：
a)使所述化合物或组合物与所述组织接触；
b)检测所述化合物或组合物的荧光。
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