CN117651561A - 用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因且E3区没有缺损的限制增殖型腺病毒、以及以所述限制增殖型腺病毒为有效成分的用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物。

Description

用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物
相关申请
本申请要求基于日本专利申请2021-084823(2021年5月19日提出申请)的优先权，其内容作为参照引入本说明书中。
技术领域
本发明涉及骨与软组织肿瘤的治疗领域。
背景技术
“骨与软组织”肿瘤是“骨”肿瘤和“软组织”肿瘤的统称，恶性骨与软组织肿瘤分为原发性骨与软组织肿瘤和转移性骨与软组织肿瘤。原发性恶性骨肿瘤(骨中发生的恶性肿瘤的统称)为罕见疾病，发生频率推测为每100万人中4人。关于原发性恶性骨肿瘤的组织型，约40％为骨肉瘤，频率最高，其次是软骨肉瘤、尤文肉瘤。骨肉瘤和尤文肉瘤在儿童中多发，10～19岁分别占全部的40％和43％。关于骨肉瘤的预后，无转移的四肢发病病例的5年无病生存率为约60～70％，总生存率为约70～80％。关于软骨肉瘤的预后，由于即使经过5年或10年也可能复发，据报道5年生存率为59％、20年总生存率为35％。尤文肉瘤的5年无病生存率为69％、5年总生存率为72％。预后根据发生部位而异，四肢远端发病病例的5年无病生存率为68％，而四肢近端为61％、骨盆发生为50％。
骨肉瘤的情况下，作为标准术前化学疗法而实施多柔比星或顺铂的给药、大剂量甲氨蝶呤(MTX)疗法，通过术前化学疗法而使肿瘤缩小后，进行肿瘤的外科手术切除。术后建议基于术前化学疗法的组织学效果判定进行辅助化学疗法。对于化学疗法的反应性通常是良好的，但是期待仅通过化学疗法治愈较为困难，骨盆、躯干发病病例由于无法切除肿瘤，以目的在于改善症状、延长生命的治疗为主。化学疗法的奏效率仅为29％(非专利文献1)。另外，老年人、有严重并发症的患者存在化学疗法不能充分进行、化学疗法无效的问题，复发病例存在没有其它治疗选项的问题。
软骨肉瘤对放射线、化学疗法均有抵抗性，手术为唯一治疗方法。通常认为化学疗法本身无效，虽然也存在对晚期病例进行的化学疗法，但是有效性本身较低(非专利文献2)。就能够大范围切除的四肢发病病例而言，可通过切/离断术而得到根治，但就躯干发病病例等不能大范围切除的病例而言，不完全切除的结果通常是反复复发，最后因肿瘤而死亡。另外，也存在在反复复发期间恶性度变高、引起远端转移的病例。因此，如果能够通过可靠地治疗局部肿瘤来阻止局部复发，则不仅大概率能够改善包括远端转移在内的生命预后，而且局部肿瘤缩小本身对患者而言也明显有利。即，在无法切除的复发/转移病变增大的情况下，会出现疼痛、功能障碍，而且肿瘤增大而穿透皮肤时会导致感染、出血等严重症状。但是，目前不存在能够使软骨肉瘤切实地缩小的治疗方法，其是医疗需求仍未得到满足的恶性骨肿瘤。
在尤文肉瘤的治疗中，需要在用于局部控制的手术或放射疗法(或两者)的同时使用全身化学疗法。化学疗法的标准方法是包括长春新碱、多柔比星、异环磷酰胺、依托泊苷的多剂联用疗法。但是，化学疗法的奏效率仅为35％(非专利文献3)。特别是施行化学疗法后复发/转移病例的预后不良，对复发/转移病例确认了有效性的推荐化学疗法尚不存在。另外，脊椎发病病例中，能够通过外科手术治愈切除的病例非常少，与其它部位发病相比预后不良。另外，作为针对无法手术的病例的替代疗法的放射线治疗还存在继发癌症的问题，期望开发新的治疗方法。
脊索瘤为低恶性度但局部破坏性增殖的骨肿瘤，最常发生在骶骨(50％)，颅底(30％)、其它脊椎(20％)次之。发病年龄的中位数为60岁，颅底发病病例中儿童居多。对于脊索瘤，与软骨肉瘤同样地以外科手术切除治疗为主。复发病例中局部控制较困难，长期生存的可能性也低(非专利文献4)。近年来报道了重粒子射线有效，据报道重粒子射线对脊索瘤的5年局部控制率为77.2％(非专利文献5)。但是，由于对同一部位再次照射有损伤健康器官的风险，因此根治性照射在通常情况下并不适用。30～40％的脊索瘤合并远端转移，通常在局部复发后的病例中发生。对于晚期脊索瘤，不存在有效的化学疗法(脊索瘤的化学疗法奏效率仅为0～2％)，虽然存在分子靶向治疗药的临床试验的报道，但是尚未获得批准(非专利文献4、6)。脊索瘤也与软骨肉瘤同样，如果能够通过切实地治疗局部肿瘤而阻止局部复发，则不仅大概率能够改善包括远端转移在内的生命预后，而且局部肿瘤的缩小本身对患者而言也明显有利。即，在无法切除的复发/转移病变增大的情况下，会出现疼痛、功能障碍，而且肿瘤增大而穿透皮肤时会导致感染、出血等严重症状。而且，脊索瘤的情况下，骶椎和颈椎为多发部位，有时因压迫脊髓、神经根而带来神经性疼痛、运动麻痹，给患者造成痛苦，因此如果能够通过使肿瘤缩小而稍微减轻这样的症状，则明显有利。但是，目前不存在使脊索瘤切实缩小的治疗方法，因此脊索瘤是没有任何现有治疗方法的、医疗需求仍未得到满足的代表性恶性骨肿瘤。
骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤以外的组织型的骨肿瘤由于病例数少而未建立起基于循证的标准治疗方法，根据主治医生的判断而实施治疗。例如，骨未分化高恶性度多形性肉瘤(所谓的MFH)作为高恶性度骨肿瘤，采用与骨肉瘤同样的治疗。骨纤维肉瘤的病例数少，尚未建立起标准化学疗法，因此以通过手术完全切除为核心治疗方式。因此，以脊索瘤、软骨肉瘤为代表的多种恶性骨肿瘤尚未建立起作为标准治疗的化学疗法，虽然存在针对晚期病例进行的化学疗法，但是有效性低。
另一方面，原发性恶性软组织肿瘤(软组织中发生的恶性肿瘤的统称)为每10万人中2～3人，虽然比原发性恶性骨肿瘤稍多，但是也为不常见的肿瘤。关于组织型的频率，此前是恶性纤维组织细胞瘤(MFH：malignant fibrous histiocytoma)最多，2013年WHO修改了软组织肉瘤诊断标准，不再使用MFH。现在，脂肪肉瘤、未分化多形性肉瘤(狭义的MFH)、平滑肌肉瘤的频率高。
对于原发性恶性软组织肿瘤而言，已建立了化学疗法、放射疗法作为标准治疗的仅有圆形细胞肉瘤中的骨外尤文肉瘤、横纹肌肉瘤，频率高的脂肪肉瘤、未分化多形性肉瘤以手术治疗为主。最近，作为分子靶向治疗药的靶向血管内皮生长因子(VEGF)的帕唑帕尼(Pazopanib)被批准用于恶性软组织肿瘤。但是，对个别组织型的有效性尚不能说已充分确定，现状是备选治疗方案少。
非圆形细胞肉瘤为由纺锤形、多形性的细胞形成的平滑肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、滑膜肉瘤等软组织肿瘤。发生频率远远高于圆形细胞肉瘤，但是对化学疗法的敏感性低，其有效性尚未确定。对于可切除的非晚期病例，世界范围内的标准治疗均为手术，但近年来荟萃分析表明利用多柔比星(doxorubicin)和异环磷酰胺(ifosfamide)的辅助化学疗法有效。但是，化学疗法中需要关注不良事件，应该考虑患者的年龄、全身状态确定适应性，应该在对患者充分说明风险和收益的基础上实施。
存活蛋白反应性限制增殖型腺病毒(Surv.m-CRA)是目标在于通过使病毒在表达存活蛋白(survivin)的恶性肿瘤细胞中特异性增殖来杀伤感染肿瘤细胞的“肿瘤溶解性病毒(Oncolytic Virus)”或又称为“限制增殖型腺病毒(Conditionally-replicatingadenovirus：CRA)”(专利文献1、非专利文献4)。关于本病毒，通过在腺病毒增殖所必需的E1A基因的上游使用基因重组技术导入在肿瘤细胞中特异性地异常高活化的存活蛋白启动子，能够实现肿瘤特异性的病毒增殖，并且通过在其下游导入的巨细胞病毒启动子来控制突变E1B(55KD编码区域缺失)的表达，能够通过不同的机制实现肿瘤特异性的病毒增殖，因此定位是下一代CRA(非专利文献7、专利文献2)。
据报道，存活蛋白在正常组织中观察不到表达，另一方面，在肺癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌及淋巴瘤中可见强表达。本发明人此前报道了在胃癌、大肠癌、肝癌、宫颈癌及骨肉瘤细胞株中确认到存活蛋白mRNA的表达，而在成纤维细胞、成骨细胞中几乎不表达(非专利文献8)。但是，存活蛋白启动子在以脊索瘤为代表的恶性骨与软组织肿瘤中显示肿瘤特异性高活性这一点迄今并无报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2005/115476号公报
专利文献2：国际公开第WO2005/012536号公报
非专利文献
非专利文献1：Fariba Navid.等，CANCER(2008)Vol.113(2)：419-425.
非专利文献2：A.Italiano.等，Annals of Oncology(2013)24：2916-2922.
非专利文献3：Elizabeth Fox.等，The Oncologist 2012；17：321.
非专利文献4：Stacchiotti S.等，Lancet Oncol.2015Feb；16(2)：e71-83.
非专利文献5：Imai R.等，Int J Radiation Oncol Biol Phys，95(1)：322-327，2016
非专利文献6：Loic Lebellec.等，Hematology 95(2015)125-131
非专利文献7：Nagano S.等，Gene Ther.12(18)：1385-1393，2005.
非专利文献8：Kamizono J等，Cancer Res 2005，65：5284-5291.
发明内容
发明所要解决的问题
恶性骨与软组织肿瘤预后不良的倾向强，尚未发现能够彻底治愈该疾病的治疗方法。另外，利用限制增殖型腺病毒治疗癌症以往虽然有报道，但是尚未发现单独在癌症中发挥效果的治疗方法。本发明的课题在于，提供新的限制增殖型腺病毒及使用其的骨与软组织肿瘤的新的治疗方法。
用于解决问题的方法
本发明人为了提供治疗骨与软组织肿瘤的方法进行了深入研究，结果发现，以具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制之下的E1A基因的限制增殖型腺病毒为有效成分的治疗用药物组合物对骨与软组织肿瘤有效，尤其是对包括标准治疗在内的现有治疗方法无效的复发病例，也发挥远远超过以往报道的限制增殖型腺病毒的显著效果和安全性，从而完成了本发明。进而，本发明人对于使用具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制之下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的更有效的治疗方法进行了探索，结果开发出了可提高其有效性的给药方法。
进而，本发明人发现，与以往报道不同，通过保持腺病毒的E3区，具有高度的肿瘤特异性的Surv.m-CRA(上述Kamizono et al.)的肿瘤特异性进一步提高，能够在维持肿瘤细胞杀伤效果的状态下降低杀伤正常细胞的副作用。
第1方式中，本发明提供以下的[1]～[15]。
[1]一种药物组合物，其为含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制之下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的用于治疗骨与软组织肿瘤(优选恶性骨与软组织肿瘤，例如原发性恶性骨肿瘤、转移性骨肿瘤、原发性恶性软组织肿瘤、转移性软组织肿瘤)的药物组合物，上述限制增殖型腺病毒的E3区没有缺损。
[2]根据[1]所述的药物组合物，其中，骨与软组织肿瘤为原发性骨与软组织肿瘤。
[3]根据[1]所述的药物组合物，其中，骨与软组织肿瘤为复发的原发性骨与软组织肿瘤或复发的转移性骨与软组织肿瘤。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的药物组合物，其中，骨与软组织肿瘤为骨肿瘤。
[5]根据[4]所述的药物组合物，其中，骨肿瘤为脊索瘤。
[6]根据[1]所述的药物组合物，其中，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1010vp～1×1012vp。
[7]根据[1]所述的药物组合物，其中，单次给药或者4周1次地反复给药，优选4周1次地给药而给药总计3～5次。
[8]根据[1]所述的药物组合物，其中，根据给药对象的肿瘤体积而改变给药液量。
[9]根据[1]所述的药物组合物，其中，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp。
[10]根据[1]所述的药物组合物，其中，两个以上部位存在肿瘤时，对肿瘤最大的3处给药，根据肿瘤体积分配各给药量。
[11]根据[1]所述的药物组合物，其中，一个肿瘤的体积为30cm3以上时，仅对1处给药。
[12]根据[8]或[10]所述的药物组合物，按照以下方式确定给药液量：
给药对象的肿瘤体积小于5cm3时为1mL；
给药对象的肿瘤体积为5cm3以上且9小于cm3时为2mL；
给药对象的肿瘤体积为9cm3以上且小于15cm3时为3mL；
给药对象的肿瘤体积为15cm3以上且小于21cm3时为5mL；
给药对象的肿瘤体积为21cm3以上且小于30cm3时为7mL；且
给药对象的肿瘤体积为30cm3以上时为10mL。
例如，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp的情况下，药物组合物在任一给药液量的情况下均含有1×1011vp的限制增殖型腺病毒。给药于两个以上肿瘤的情况下，各给药液量合计含有1×1011vp的限制增殖型腺病毒。
[13]一种限制增殖型腺病毒，其为具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒，所述限制增殖型腺病毒的E3区没有缺损。
[14]根据[1]所述的药物组合物或[13]所述的限制增殖型腺病毒，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区为E1BΔ55K。
[15]根据[14]所述的药物组合物或限制增殖型腺病毒，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区受不同于E1A区的启动子控制，例如受选自CMV启动子、RSV启动子、CA启动子、E2F启动子、EF1A启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、CBA启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子、Nanog启动子、Nes启动子、Tuba1a启动子、Camk2a启动子、SYN1启动子、Hb9启动子、Th启动子、NSE启动子、GFAP启动子、iba1启动子、ProA1启动子、hRHO启动子、hBEST1启动子、Prnp启动子、Cnp启动子、K14启动子、BK5启动子、mTyr启动子、cTnT启动子、αMHC启动子、Myog启动子、ACTA1启动子、MHCK7启动子、SM22a启动子、EnSM22a启动子、Runx2启动子、OC启动子、Col1a1启动子、Col2a1启动子、aP2启动子、Adipoq启动子、Tie1启动子、Cd144启动子、CD68启动子、CD11b启动子、Afp启动子、Alb启动子、TBG启动子、MMTV启动子、Wap启动子、HIP启动子、Pdx1启动子、Ins2启动子、Hcn4启动子、NPHS2启动子、SPB启动子、CD144启动子、TERT启动子、TRE启动子FLK-1启动子、VEGF启动子、c-Myc启动子、SLPI启动子、PSA启动子、酪氨酸酶启动子中的任一启动子、优选CMV启动子控制。
进而，本发明提供以下的[16]～[20]。上述第1方式的[1]～[15]中规定的各要件可应用于下述[16]～[20]。
[16]一种用于治疗复发的骨与软组织肿瘤的药物组合物，其含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒。
[17]一种药物组合物，其为含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物，所述药物组合物单次给药或4周1次地反复给药，优选4周1次地给药而给药总计3～5次。
[18]一种药物组合物，其为含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物，根据肿瘤体积而改变给药液量。
[19]一种药物组合物，其为含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量在1×1010vp～1×1012vp的范围内且能够安全地治疗。
[20]一种药物组合物，其为含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp。
第2方式中，本发明提供以下的[1]～[19]。
[1]一种(安全地)治疗骨与软组织肿瘤(优选恶性骨与软组织肿瘤，例如原发性恶性骨肿瘤、转移性骨肿瘤、原发性恶性软组织肿瘤、转移性软组织肿瘤)的方法，其包括将具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒给药于对象的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，其中，骨与软组织肿瘤为原发性骨与软组织肿瘤。
[3]根据[1]所述的方法，其中，骨与软组织肿瘤为复发的原发性骨与软组织肿瘤或复发的转移性骨与软组织肿瘤。
[4]根据[1]所述的方法，其中，骨与软组织肿瘤为骨肿瘤。
[5]根据[4]所述的方法，其中，骨肿瘤为脊索瘤。
[6]根据[1]所述的方法，其中，限制增殖型腺病毒每一次对患者的总给药量为1×1010vp～1×1012vp。
[7]根据[1]所述的方法，其中，限制增殖型腺病毒单次给药或4周1次地反复给药，优选4周1次地给药而给药总计3～5次。
[8]根据[1]所述的方法，其中，根据给药对象的肿瘤体积而限制增殖型腺病毒的改变给药液量。
[9]根据[1]所述的方法，其中，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp。
[10]根据[1]所述的方法，其中，两个以上部位存在肿瘤时，对肿瘤最大的3处给药限制增殖型腺病毒，根据肿瘤体积分配各给药量。
[11]根据[1]所述的方法，其中，一个肿瘤的体积为30cm3以上时，仅将限制增殖型腺病毒给药于1处。
[12]根据[8]或[10]所述的方法，其中，按照以下方式确定限制增殖型腺病毒的给药液量：
给药对象的肿瘤体积小于5cm3时为1mL；
给药对象的肿瘤体积为5cm3以上且小于9cm3时为2mL；
给药对象的肿瘤体积为9cm3以上且小于15cm3时为3mL；
给药对象的肿瘤体积为15cm3以上且小于21cm3时为5mL；
给药对象的肿瘤体积为21cm3以上且小于30cm3时为7mL；且
给药对象的肿瘤体积为30cm3以上时为10mL。
例如，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp的情况下，在任一给药液量的情况下均给药1×1011vp的限制增殖型腺病毒。给药于两个以上肿瘤的情况下，各给药液量合计给药1×1011vp的限制增殖型腺病毒。
[13]根据[1]所述的方法，其中，限制增殖型腺病毒的E3区没有缺损。
[14]根据[1]所述的方法，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区为E1BΔ55K。
[15]根据[1]所述的方法，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区受不同于E1A区的启动子(如第1方式所述)控制。
[16]根据[1]所述的方法，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区受CMV启动子控制。
第3方式中，本发明提供以下的[1]～[15]。
[1]一种含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的组合物，其在骨与软组织肿瘤(优选恶性骨与软组织肿瘤，例如原发性恶性骨肿瘤、转移性骨肿瘤、原发性恶性软组织肿瘤、转移性软组织肿瘤)的治疗中使用，上述限制增殖型腺病毒的E3区没有缺损(保持了E3区)。
[2]根据用于[1]所述的使用的组合物，其中，骨与软组织肿瘤为原发性骨与软组织肿瘤(例如，原发性恶性骨肿瘤、原发性恶性软组织肿瘤)。
[3]根据用于[1]或[2]所述的使用的组合物，其中，骨与软组织肿瘤为复发的原发性骨与软组织肿瘤(例如，原发性恶性骨肿瘤、原发性恶性软组织肿瘤)或复发的转移性骨与软组织肿瘤(例如，转移性骨肿瘤、转移性软组织肿瘤)。
[4]根据用于[1]～[3]中任一项所述的使用的组合物，其中，骨与软组织肿瘤为骨肿瘤。
[5]根据用于[4]所述的使用的组合物，其中，骨肿瘤为脊索瘤。
[6]根据用于[1]～[5]中任一项所述的使用的组合物，其中，限制增殖型腺病毒每一次对患者的总给药量为1×1010vp～1×1012vp。
[7]根据用于[1]～[6]中任一项所述的使用的组合物，其中，单次给药或4周1次地反复给药，优选4周1次地给药而给药总计3～5次。
[8]根据用于[1]～[7]中任一项所述的使用的组合物，其中，根据给药对象的肿瘤体积而改变给药液量根据。
[9]根据用于[1]～[8]中任一项所述的使用的组合物，其中，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp。
[10]根据用于[1]～[9]中任一项所述的使用的组合物，其中，两个以上部位存在肿瘤时，对肿瘤最大的3处给药，根据肿瘤体积分配各给药量。
[11]根据用于[1]～[9]中任一项所述的使用的组合物，其中，一个肿瘤的体积为30cm3以上时，仅对1处给药。
[12]根据用于[1]～[11]中任一项所述的使用的组合物，其中，按照以下方式确定给药液量：
给药对象的肿瘤体积小于5cm3时为1mL；
给药对象的肿瘤体积为5cm3以上且小于9cm3时为2mL；
给药对象的肿瘤体积为9cm3以上且小于15cm3时为3mL；
给药对象的肿瘤体积为15cm3以上且小于21cm3时为5mL；
给药对象的肿瘤体积为21cm3以上且小于30cm3时为7mL；且
给药对象的肿瘤体积为30cm3以上时为10mL。
例如，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp的情况下，组合物在任一给药液量的情况下均含有1×1011vp的限制增殖型腺病毒。给药于两个以上肿瘤的情况下，各给药液量合计含有1×1011vp的限制增殖型腺病毒。
[13]根据用于[1]～[12]中任一项所述的使用的组合物，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区为E1BΔ55K。
[14]根据用于[1]～[13]中任一项所述的使用的组合物，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区受不同于E1A区的启动子(如第1方式所述)、例如CMV启动子控制。
[15][14]所述的限制增殖型腺病毒，其为具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒，所述限制增殖型腺病毒为E3区没有缺损的限制增殖型腺病毒，优选E1B区为E1BΔ55K，进一步优选E1B区受不同于E1A区的启动子(如第1方式所述)、例如CMV启动子控制。
进而，本发明提供以下的[16]～[20]。上述第3方式的[1]～[15]中规定的各要件也可应用于下述[16]～[20]。
[16]一种含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的组合物，其在复发的骨与软组织肿瘤的治疗中使用。
[17]一种在骨与软组织肿瘤的治疗中使用的、含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的组合物，所述组合物单次给药或4周1次地反复给药，优选4周1次地给药而给药总计3～5次。
[18]一种在骨与软组织肿瘤的治疗中使用的、含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的组合物，根据肿瘤体积而改变给药液量。
[19]一种在骨与软组织肿瘤的治疗中使用的、含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的组合物，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量在1×1010vp～1×1012vp的范围内且能够安全地治疗。
[20]一种在骨与软组织肿瘤的治疗中使用的、含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的组合物，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp。
附图说明
图1示出低用量的骶骨脊索瘤患者(45岁、女性)的治疗经过。该患者于2007年罹患骶骨脊索瘤，2013年右臀部软组织处复发，不适用化学疗法、放射线治疗，2016年8月给药Surv.m-CRA-1。中间的表示出给药前至给药起114周后的RECIST标准的奏效性判定(上排)和Choi标准的奏效性判定(下排)。最下部所示的照片从左侧起示出给药前、给药12周后、给药28周后、给药100周后的病变部CT图像。(PR：部分缓解、SD：病情稳定)
图2示出低用量的胸椎脊索瘤患者(61岁、男性)的治疗经过。该患者于2006年接受从右纵隔起的胸椎脊索瘤切除手术后，2017年发现相邻椎体(第7胸椎)第4次复发，通过标准治疗未确认到效果，因此给药Surv.m-CRA-1。中间的表示出给药前至给药起135周后的治疗经过。表中从上侧起依次示出长径(mm)及其变化率(％)、CT值(HU)及其变化率(％)、RECIST标准的奏效性判定、Choi标准的奏效性判定、非造影CT值及其变化率(％)。最下部所示的照片从左侧起示出给药前、给药4周后、给药12周后、给药56周后的病变部CT图像。(PR：部分缓解、SD：病情稳定)
图3为示出体外感染Surv.m-CRA-1的肝癌细胞株(HepG2)和正常成纤维细胞(WI-38)的细胞存活率(cell viability)的图。纵轴示出各条件下设对照Ad.dE1.3的活细胞数为100％时相同条件(各MOI以及各天数)的Surv.m-CRA-1(有E3)和Surv.m-CRA(无E3)的活细胞数的比(％)。横轴表示感染复数(MOI)。*表示相对于对照统计学上有显著性差异(P＜0.05)。
具体实施方式
一个方式中，本发明涉及用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物，其以具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒为有效成分。
“限制增殖型腺病毒(Conditionally-replicating adenovirus：CRA)”是指通过肿瘤特异性增殖来进行杀伤的病毒。“限制增殖型腺病毒”也被称为肿瘤溶解性病毒，其含义是该领域中公知的。
本说明书中，“具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因”是指存活蛋白启动子以能够直接调节E1A基因的表达的方式结合在E1A基因的上游。例如，存活蛋白启动子可以结合在E1A基因的转录起始区的10～200bp上游。优选限制增殖型腺病毒的E1B区为E1BΔ55K。“E1BΔ55K”为腺病毒的E1B蛋白中缺失了p53结合区域的蛋白(JAMESR.BISCHOFF等，SCIENCE 18OCT 1996：373-376)，也称为E1B19K。已知具有E1BΔ55K的病毒能够在p53缺失的肿瘤细胞中增殖且不能在具有p53的正常细胞中增殖。
E1A区和E1B区(E1BΔ55K)优选受不同启动子控制。由此，能够分开控制E1A的表达和E1BΔ55K的表达(上述Nagano et al.、WO2005/012536)。本说明书中将这样的腺病毒记作“多因子限制增殖型腺病毒”(CRA regulated with multiple tumor-specificfactors；m-CRA)。控制E1B区的启动子只要不同于E1A区则没有特别限定。可列举例如CMV启动子、RSV启动子、CA启动子、E2F启动子、EF1A启动子、EFS启动子、CAG启动子、CBh启动子、CBA启动子、SFFV启动子、MSCV启动子、SV40启动子、mPGK启动子、hPGK启动子、UBC启动子、Nanog启动子、Nes启动子、Tuba1a启动子、Camk2a启动子、SYN1启动子、Hb9启动子、Th启动子、NSE启动子、GFAP启动子、iba1启动子、ProA1启动子、hRHO启动子、hBEST1启动子、Prnp启动子、Cnp启动子、K14启动子、BK5启动子、mTyr启动子、cTnT启动子、αMHC启动子、Myog启动子、ACTA1启动子、MHCK7启动子、SM22a启动子、EnSM22a启动子、Runx2启动子、OC启动子、Col1a1启动子、Col2a1启动子、aP2启动子、Adipoq启动子、Tie1启动子、Cd144启动子、CD68启动子、CD11b启动子、Afp启动子、Alb启动子、TBG启动子、MMTV启动子、Wap启动子、HIP启动子、Pdx1启动子、Ins2启动子、Hcn4启动子、NPHS2启动子、SPB启动子、CD144启动子、TERT启动子、TRE启动子FLK-1启动子、VEGF启动子、c-Myc启动子、SLPI启动子、PSA启动子、酪氨酸酶启动子等。
作为多因子限制增殖型腺病毒，可列举国际公开第WO2005/115476号公报或Junichi Kamizono等，Cancer Res June 15 2005(65)(12)5284-5291中记载的腺病毒。该腺病毒为将腺病毒基因组中的E1A区的内源性启动子及E1B区(优选E1BΔ55K)的内源性启动子分别置换成存活蛋白启动子及CMV启动子的多因子限制增殖型腺病毒。
优选限制增殖型腺病毒的腺病毒的E3区中未插入外源基因。换言之，限制增殖型腺病毒为E3区没有缺损(即，具有野生型腺病毒的E3区)的限制增殖型腺病毒。
E3区中存在编码称为腺病毒死亡蛋白的诱导肿瘤细胞死亡的基因的区域，因此一般认为具有E3区者治疗效果高(Fanny Georgi,et.al.，FEBS Letters 594(2020)1861-1878)。但是，与这样的现有常识不同，我们发现保持了E3区的限制增殖型腺病毒与E3区缺损的限制增殖型腺病毒相比，在体外的肿瘤特异性细胞杀伤效果高。并且，在实施例所示的临床试验中，确认到保持了E3区的限制增殖型腺病毒(Surv.m-CRA-1)具有充分的治疗效果和安全性。即，保持了E3区(E3区没有缺损)的限制增殖型腺病毒维持了足够临床上预期有充分治疗效果的肿瘤细胞杀伤效果且对正常细胞的非特异性杀伤效果大幅降低，因此可成为更安全且有效的治疗药。
本发明的限制增殖型腺病毒作为用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物有用。
本说明书中，“骨与软组织肿瘤”是指骨及软组织(肌肉、脂肪、神经、血管等)中形成的肿瘤，包括：普通型骨肉瘤、成软骨细胞型、成纤维细胞型、成骨细胞型、血管扩张型骨肉瘤、小细胞型骨肉瘤、继发性骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、骨膜性骨肉瘤、高恶性度浅表性骨肉瘤等骨肉瘤；普通型软骨肉瘤、去分化型软骨肉瘤、间叶性软骨肉瘤、透明细胞软骨肉瘤、骨外粘液样软骨肉瘤等软骨肉瘤；尤文肉瘤；骨未分化高恶性度多形性肉瘤(所谓的MFH)；骨纤维肉瘤；脊索瘤；恶性骨巨细胞瘤；骨血管肉瘤；骨平滑肌肉瘤；以及骨脂肪肉瘤等。“骨与软组织肿瘤”包括骨肿瘤和软组织肿瘤，优选骨肿瘤，更优选脊索瘤。
“骨与软组织肿瘤”优选恶性骨与软组织肿瘤，可分为原发性骨与软组织肿瘤和转移性骨与软组织肿瘤。“原发性骨与软组织肿瘤”是指由骨及软组织本身癌变而产生的恶性肿瘤。“转移性骨与软组织肿瘤”是指内脏等其它器官癌转移到骨及软组织而产生的恶性肿瘤。
本发明的限制增殖型腺病毒对复发的原发性骨与软组织肿瘤、转移性骨与软组织肿瘤也有效。“复发的原发性骨与软组织肿瘤”是指已应用了基于放射线治疗、化学疗法治疗和/或实施了切除等外科手术治疗的原发性骨与软组织肿瘤，在该治疗后肿瘤恶化、发生转移。同样，“复发的原发性骨与软组织肿瘤”是指已实施了治疗的转移性骨与软组织肿瘤，在该治疗后恶化、发生转移。
本发明的限制增殖型腺病毒也可以与现有公知的骨与软组织肿瘤的治疗方法组合使用。骨与软组织肿瘤的治疗方法在本申请申请时的软组织肿瘤诊疗指南(JapaneseOrthopaedic Association(JOA)Clinical Practice Guidelines on the Management ofSoft Tissue Tumors)、NCCN指南、ESMO诊疗指南、EURACAN指南以及其它国家的指南(Cancer Chemother Pharmacol.2016Jan；77(1)：133-46.等)中有记载。例如，在骨与软组织肿瘤的治疗中，作为化学疗法剂，包括长春新碱(vincristine)、多柔比星、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺、依托泊苷(etoposide)、帕唑帕尼、曲贝替定(trabectedin)或艾瑞布林(eribulin)、或者它们的组合。
另一个方式中，本发明涉及：骨与软组织肿瘤患者的治疗方法，其特征在于，给药有效量的具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒；用于治疗原发性骨与软组织肿瘤的、具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒；或者，具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒在制造原发性用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物中的应用。上述中限增殖型腺病毒为保持了野生型的E3区、优选E1B区为E1BΔ55K的限制增殖型腺病毒。
一例中，本发明的限制增殖型腺病毒或以其为有效成分的药物组合物例如以4周给药1次的日程给药1～10次、2～8次、3～5次或4～5次。给药通过注射进行，可以为血中给药或肿瘤内给药，优选肿瘤内给药。
肿瘤内给药的情况下，本发明的药物组合物可以根据肿瘤体积而改变给药液量。例如，本说明书记载的药物组合物的给药液量可以按照以下方式确定：
给药对象的肿瘤体积小于5cm3时为1mL；
给药对象的肿瘤体积为5cm3以上且小于9cm3时为2mL；
给药对象的肿瘤体积为9cm3以上且小于15cm3时为3mL；
给药对象的肿瘤体积为15cm3以上且小于21cm3时为5mL；
给药对象的肿瘤体积为21cm3以上且小于30cm3时为7mL；且
给药对象的肿瘤体积为30cm3以上时为10mL。
通过这样根据肿瘤体积而改变给药液量，可以使病毒在肿瘤内更广泛地散布。
治疗对象的患者中两个以上部位存在肿瘤的情况下，限制增殖型腺病毒例如可以给药于肿瘤最大的3处(优选肿瘤直径大的3处肿瘤)，这种情况下，可以根据肿瘤体积分配各给药量。或者，在一个肿瘤体积为30cm3以上时，不进行分配而仅给药于1处肿瘤。另外，在多次给药时，在第2次以后的给药时刻，在到上次为止接受了给药的肿瘤的体积减少的情况下，限制增殖型腺病毒可以给药于该第2次以后的给药时刻的、给药病变中肿瘤直径大的3处肿瘤。在此，肿瘤直径大的3处肿瘤是指肿瘤直径最大的肿瘤、肿瘤直径第二大的肿瘤及肿瘤直径第三大的肿瘤。或者，在多次给药时，在第2次以后的给药时刻，在到上次为止接受了给药的肿瘤中1个肿瘤的体积减少的情况下，限制增殖型腺病毒可以给药于首次给药时刻的、给药病变中肿瘤直径第四大的肿瘤。同样，在到上次为止接受了给药的肿瘤中2个肿瘤的体积减少的情况下，限制增殖型腺病毒可以给药于首次给药时刻的、给药病变中肿瘤直径第四大的肿瘤和第五大的肿瘤。另外，在到上次为止接受了给药的肿瘤中3个肿瘤的体积减少的情况下，限制增殖型腺病毒可以给药于首次给药时刻的、给药病变中肿瘤直径第四大的肿瘤、第五大的肿瘤及第六大的肿瘤。
限制增殖型腺病毒的每一次给药量可以设为1×1010vp～1×1012vp，优选为1×1011vp。限制增殖型腺病毒的给药可以为单次给药，也可以为反复给药，总给药量可以设为1×1010vp～1×1012vp，优选为1×1011～5×1011vp或3×1011～5×1011vp。
本发明的药物组合物的形态只要为适合于对肿瘤部位进行给药的形态，则没有特别限定，可以为含有药理学上可接受的载体、添加物的形态。作为这样的载体、添加物，可列举例如溶剂、助溶剂、助悬剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、无痛剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂等。
作为溶剂，可列举纯化水、生理盐水、磷酸缓冲液等。
作为助溶剂，可列举聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、苯甲酸苄酯、乙醇、碳酸钠、柠檬酸钠、水杨酸钠、乙酸钠等。
作为助悬剂或乳化剂，可列举月桂基硫酸钠、阿拉伯胶、明胶、卵磷脂、单硬脂酸甘油酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠等纤维素类、聚山梨酯类、聚氧乙烯氢化蓖麻油等。
作为等渗剂，可列举氯化钠、氯化钾、糖类、甘油、尿素等。
作为稳定剂，可列举聚乙二醇、葡聚糖硫酸钠以及氨基酸类等。
作为无痛剂，可列举葡萄糖、葡糖酸钙、盐酸普鲁卡因等。
作为防腐剂，可列举对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。
作为抗氧化剂，可列举：作为水溶性抗氧化剂的抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；作为脂溶性抗氧化剂的抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及作为金属螯合剂的柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸。
本发明的药物组合物例如可以制成在添加有甘油的Tris缓冲生理盐水缓冲液(含有2.5％(v/v)甘油，25mM NaCl、20mM Tris，pH 8.0)中含有限制增殖型腺病毒的注射用制剂。所含有的限制增殖型腺病毒的量可以根据目的、用法用量适当选择，可以优选设为1×1011vp/mL。
实施例
以下为了更详细地说明本发明而示出实施例，但是本发明不受这些实施例限定。需要说明的是，本申请整体引用的所有文献均通过参照而直接并入本申请。
实施例1
使用的药物(Surv.m-CRA-1)以多因子限制增殖型人腺病毒5型为有效成分，所述多因子限制增殖型人腺病毒5型的E1区以在存活蛋白启动子控制下表达E1A基因且在CMV启动子控制下表达E1B19K基因的方式进行了改造。该腺病毒以从5型腺病毒基因组除去了病毒增殖所需的E1A及E1B区的内源性启动子而得到的m-CRA为基本骨架，不具有治疗基因。该药物通过在缺失的内源性E1A启动子部分重组存活蛋白启动子(Survpr)、在内源性E1B启动子缺失部分重组CMV启动子(CMVpr)，从而在存活蛋白活化的肿瘤细胞中选择性增殖。另一方面，在存活蛋白活性低的正常细胞中的增殖受到抑制。进而，Surv.m-CRA-1中保持有E3。
本剂的最终制剂剂型为注射用制剂。1制剂中含有浓度为1×1011vp/mL的病毒0.6mL/vial。基剂的组成为由GTS缓冲液(含有2.5％甘油(v/v)的25mM NaCl、20mM Tris、pH8.0)构成的缓冲液。
＜受试者的适合性＞
将满足以下全部选择标准且不符合任一排除标准的患者登记为适合。
(选择标准)
1)组织学上诊断为下述任一者。
原发性恶性骨肿瘤
转移性骨肿瘤
原发性恶性软组织肿瘤
转移性软组织肿瘤
2)进行过作为前期治疗的标准治疗的情况，登记时已经是治疗后经过4周以上。
3)不属于有可能延长寿命、缓解症状的通常认可的标准治疗方法的对象。
4)具有能够测量肿瘤的短径/长径/高度及能够向肿瘤内给药受试制品的病变。
5)取得同意时年龄为10岁以上且不满85岁。
6)ECOGPS为0～2。
7)预期可生存3个月以上。
8)主要器官功能尚在。(登记前2周以内的最新检查)
血红蛋白≥8g/dL
白细胞数≥2,000/μL
血小板数≥70,000/μL
AST(GOT)≤100U/L
ALT(GPT)≤100U/L
总胆红素≤1.5mg/dL
血清肌酐≤2.0mg/dL
9)男性的情况下，满足以下任一者。
无精症。
输精管切除术等外科避孕手术后。
同意在取得同意时起至给药受试制品后受试制品Surv.m-CRA-1从体内消失为止的期间正确使用避孕套或通过禁欲来避孕。
女性伴侣已绝经1年以上、或两侧卵巢摘除术等手术后、或同意从取得同意时起至给药受试制品后受试制品Surv.m-CRA-1从体内消失为止的期间通过口服避孕药(避孕用药丸)、宫内避孕用具(节育环)进行避孕。
10)女性的情况下，满足以下任一者。
已绝经1年以上。
两侧卵巢摘除术等外科避孕手术后。
同意从取得同意时起至给药受试制品后受试制品Surv.m-CRA-1从体内消失为止的期间通过口服避孕药(避孕用药丸)、宫内避孕用具(节育环)或禁欲进行避孕。
男性伴侣为无精症、或输精管切除术等外科避孕手术后、或同意在取得同意时起至给药受试制品后受试制品Surv.m-CRA-1从体内消失为止的期间正确使用避孕套来避孕。
11)对于参加本试验，已获得受试者本人或法定代理人的书面同意。
(排除标准)
1)具有以下任一并发症。
重度心脏病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、肝病
控制不良的糖尿病
需要持续治疗的传染病
2)有青霉素或猪、牛(包括牛奶)过敏史。
3)患有需要全身给药免疫抑制剂或类固醇的疾病(允许为预防造影剂过敏而使用类固醇，但是在使用的情况下间隔1周左右再给药受试制品并考虑感染预案等)。
4)含有活动性的重复癌症。(经适当治疗的基底细胞癌、上皮内癌、浅表膀胱癌或5年以上未发生转移/复发的恶性肿瘤无需排除)
5)原发疾病所伴随的发热/疼痛无法控制。
6)妊娠期、哺乳期的女性、绝经前或绝经后1年以内妊娠检查为阳性的女性。
7)取得同意前4周以内接受过其它未获批准的药物的给药。
8)试验负责医师/试验协助医师判断不适合参加本试验的其它因素。
以晚期实体癌(原发性恶性骨肿瘤、转移性骨肿瘤、原发性恶性软组织肿瘤、转移性软组织肿瘤)为对象，通过Surv.m-CRA-1的肿瘤局部单次给药来进行用于研究安全性/耐受性及初步有效性的开放标签用量递增I期试验(Surv.m.CRA-1-001试验)。分别对满足上述适合性的受试者3名给药低用量(1×1010病毒粒子，以下记作“vp”)、中用量(1×1011vp)、高用量(1×1012vp)。
关于作为给药对象的肿瘤部位，根据解剖学位置按照下述标准来选择1处。原发灶和转移灶均可。肿瘤部位存在2处以上时，从给药操作容易等观点出发来选择给药对象。
1)肿瘤的尺寸大，给药操作容易
2)为不邻近大血管及胸腔的部位
3)不为推测与疼痛等症状相关的部位
根据受试者登记时的影像评价所见计算肿瘤体积。肿瘤体积的计算中使用下式并舍去小数点第2位及以后。
＜肿瘤体积计算＞
肿瘤体积(cm3)＝短径(cm)×长径(cm)×高(cm)×1/2
关于对1个病变的药物液量，低用量组、中用量组、高用量组中，如果肿瘤体积大于33.3cm3则将药物稀释成10mL而给药。低用量组、中用量组中，如果肿瘤体积为3.4cm3以下则不稀释而直接给药，如果为3.5cm3～33.3cm3以下，则稀释成肿瘤体积的30％而给药。高用量组中，如果肿瘤体积为33.3cm3以下，则将药物以全量给药，不进行稀释。
在治疗室内，在直接目视下、X射线透视下、CT指导下或超声波指导下，将对1处给药对象病变部位的给药液量以改变针尖方向的同时分成总计5～10处左右而使其遍布在同一肿瘤内的方式给药。
(结果)
将I期试验的受试者的治疗效果示于表1。其中，低用量的骶骨脊索瘤患者(45岁、女性)为骶骨脊索瘤发病起6年后转移到肝脏及肺、在右臀部软组织中复发的类型。化学疗法剂、放射线治疗未见效，复发肿瘤也无法切除。本药物在这样的复发类型(且化学疗法剂、放射线治疗不奏效类型)中仅通过单次给药也能够实现部分缓解(Partial Response：PR)。特别是治疗效果和安全性均值得一提。即，以往报道的限制增殖型腺病毒的临床试验，即使是反复给药情况下，也没有在这样的低用量下可见治疗效果的报道。进而，在限制增殖型腺病毒的临床试验中，给药后经过2年以上也可见治疗效果的例子也未见报道。图1示出治疗经过。
另外，低用量的胸椎脊索瘤患者(61岁、男性)为接受右纵隔至胸椎脊索瘤切除手术后在11年后在相邻椎体中观察到第4次复发、标准治疗没有效果的类型。本药物在这样的复发类型中也可以实现PR。更值得一提的是，治疗后4周可见治疗效果，进而12周时可见骨重建的观察结果。骨重建是骨肿瘤被杀灭而首先诱导的治愈再生现象，在临床上证明了高的治疗效果。另外，该病例为骨内形成的肿瘤，因此即使肿瘤进入细胞死亡、存在骨的再生，也并未完全阻塞肿瘤所在的位置，因此无法通过用于评价肿瘤直径的RECIST来完全评价肿瘤的缩小效果，推测本来可以观察到更明显的治疗效果。进而，通过造影CT来评价的Choi表示CT值的增加率，即显著发生了再生治愈的骨重建，显示出非常良好的结果。由此，综合考虑这些结果可认为，该患者实际上接近得到了完全奏效(Complete response)的强治疗效果的状态。进而，如第1例时也记载的那样，以往报道的限制增殖型腺病毒的临床试验即使反复给药，也没有在这样的低用量下可见治疗效果的报道，因此此次试验中通过单次给药得到了上述优良结果这一点是极显著的效果。进而，在限制增殖型腺病毒的临床试验中，给药后如该病例这样经过135周(2年7个月以上)也可见治疗效果的例子尚无报道，因此可以说是强的治疗效果。图2示出治疗经过。
另外，表1示出进行了临床试验的全部9例患者的治疗效果小结。治疗效果通过基于Choi标准以及RECIST标准的肿瘤缩小效果来判定。PD为病情进展、SD为病情稳定、PR为部分缓解。安全性(不良事件和副作用)是以受试制品给药日至观察期结束为止所出现的全部不良事件为对象进行分析的。不良事件的评价中，使用不良事件共通术语标准(CTCAE)ver.4.0日语译本日本临床肿瘤研究组(JCOG)版(CTCAE ver.4.0)。
单次给药的低用量组(最大量的1/100量；全球的竞争技术范围内，即使反复给药也未见治疗效果的量)中，发挥了对肿瘤的长期/持续性治疗效果(2年以上、肿瘤不断缩小并减小一半)，得到了整个用量组9例中的6例在临床试验中奏效(PR以上)这一领先的治疗作用/效果。这样的高的有效性在以往全世界所进行的限制增殖型腺病毒的临床试验中未有报道(记载于表2)，因此，证明本剂具有远远超过竞争技术的性能。
[表1]
本药物给药时的安全性方面，无用量依赖性倾向，未见明显问题。作为严重副作用，观察到1例4级淋巴细胞数减少，但是无症状且恢复正常。淋巴细胞减少在肿瘤溶解性病毒中经常观察到，是一过性的重组病毒扩增中可能发生的现象，在过去的限制增殖型腺病毒的临床试验中也有报道。其机制与以往的化学疗法(抗癌剂)的骨髓抑制(非常成问题的副作用)不同，推测由于本药物的作用机制、即随着肿瘤内的病毒增殖/细胞破坏而将淋巴细胞暂时动员到肿瘤内、淋巴结内，导致外周血中的淋巴细胞减少，由于并非骨髓抑制，因此可很快恢复。因此，某种意义上也可以说这是该药物发挥强大作用的依据。另外，受试制品给药日至给药起28天以内，无死亡受试者。需要说明的是，未观察到会导致中止的不良事件及DLT(dose limiting toxicity，剂量限制毒性)。除作为不良事件报告的异常情况外，未观察到临床检查值或生命体征发生任何临床上有问题的变化。
整体上来说，血中腺病毒、腺病毒排泄(唾液、尿)、抗腺病毒抗体效价、细胞因子及12联心电图任一群体者均未观察到临床上有问题的值或变动。细胞因子上升轻微，即未诱发针对病毒感染的过度免疫反应，侧面证明了安全性。
患者未抱怨轻度的一过性发热等严重症状，证明了安全性极高。以上表明，Surv.m-CRA-1不论是否保持有E3均保持了对肿瘤细胞的强治疗效果，另一方面抑制了在正常细胞中的非特异性的病毒增殖，表明成功构建了具有E3且安全性高的腺病毒。
进行了给药后的体液中病毒定量。将结果示于表2。低用量情况下，1例仅给药当天(仅第1天)唾液中的病毒为阳性，血液、尿中为阴性，其它病例的血液、唾液、尿中均为阴性。中用量情况下，2例的血液截止7天后(第8天)为阳性，1例的唾液截止7天后(第8天)为阳性，另一例的唾液截止21天后(第22天为阳性，但是14天以后(第15天以后)为20拷贝/μL以下的低浓度。高用量情况下，3例的血液均截止7天后(第8天)为阳性，2例的唾液截止7天后(第8天)为阳性，3例的尿全部为阴性。虽然观察到受试制品给药后一过性呈阳性的受试者，但是至试验治疗/评价期(第29天)结束时为阴性。
[表2]
治疗后的病毒排泄量(血液/尿/唾液)的推移
用量(VP/mL)病毒(Surv.m-CRA-1)量
低(1×1010)数值：拷贝/μL
中(1×1011)-：＜10拷贝/μL
高(1×1012)＊：确认阴性后未实施
另外，关于有效性，试验治疗/评价期(第29天)结束时，低用量群体中2例、中用量群体中1例、高用量群体中2例可见局部奏效，其中，低用量群体的2例(作为原发性恶性骨肿瘤的脊索瘤)中，从观察期开始后的9个月至2年时刻(1例为最长观察期即2年7个月时刻)维持了局部奏效。根据以上，本制品耐受性方面无问题，具有非常高的安全性，得到了远远超过以往报道的限制增殖型腺病毒的治疗效果(肿瘤缩小效果)。以下的表3示出以往报道的限制增殖型腺病毒与Surv.m-CRA-1的临床试验结果的比较。
[表3]
上述Surv.m-CRA-1I期试验的群体3(高用量)中给药1×1012vp的受试制品，确认其安全性。关于受试制品给药后体液中的病毒检测，几乎所有病例均在7天后、群体2(中用量：1×1011vp中仅1例在最长21天后确认到唾液中的病毒。另一方面，体液中可检测到病毒期间，未确认到显示上呼吸道炎症等症状的病例。根据以上，受试制品给药起4周后，所给药的病毒从体液中消失，表明再次给药所带来的风险处于与首次给药同等或与其接近的水平。这表明，利用Surv.m-CRA-1的治疗适合设计为每隔4周重复给药。另外表明，通过将给药次数设为5次，总给药量(1×1011vp×5次＝5×1011vp)不会超过Surv.m-CRA-1I期试验群体3(高用量的给药量1×1012vp)，并且，可以将有望有治疗效果的用量的1×1011vp作为1次给药量。
已知骨肿瘤的肿瘤直径大则病例性骨折的风险变高(Mirel’s score：以肿瘤直径评价病理性骨折的风险)，用以手术适应性判断。据报道，各种癌症中原发灶和转移灶(淋巴结转移等)的合计体积(Total Tumor Volume)与预后负相关，骨肉瘤情况下，也有报道指出多发肺转移的总体积为预后不良因子。以肿瘤直径大的肿瘤为治疗对象预期可减小患者的总肿瘤体积。由此想到，研究从肿瘤直径大的病变开始给药的可能性、选择给药对照病变。考虑到给药对照病变的数量多则每个病变的给药量减少、患者的负担增加，想到将最多3处作为给药对照病变。另外，第1处肿瘤的体积大至30cm3以上时，如果分成2处以上则每个肿瘤的给药量变少(Surv.m-CRA-1I期试验中，以肿瘤体积的30％为标准而给药)，因此决定仅对1处进行给药。
本试验中，可肿瘤内给药受试制品的病变为符合以下全部的病变。
主要部位为骨或软组织(骨肿瘤的转移病变)
能够从体表向肿瘤内注射
非淋巴结病变
肿瘤的最小直径为10mm以上
肿瘤整体非囊泡性病变
关于对1个病变的药物液量，计算给药对象的肿瘤体积并按照以下标准确定给药液量。需要稀释时，根据给药液量用生理盐水稀释后给药。
肿瘤体积和给药液量(稀释后)
可给药病变有多处时，使用肿瘤体积的合计基于上述标准计算给药液量。各次给药中，可向肿瘤最大的3处给药。对两个以上肿瘤给药时，根据肿瘤体积分配且总给药量设为1×1011vp。其中，一个肿瘤体积为30cm3以上时仅对1处进行给药，不对其他的肿瘤给药。可给药病变有多处时，给药对象病变的选择由试验负责医师或受试协助医师基于以下标准判断。
肿瘤直径大
从体表能触及
附近没有重要的神经、血管等，可安全地给药
根据受试者登记时的影像评价所见计算肿瘤体积。肿瘤体积的计算中使用下式，舍去小数点第2位及以后。
＜肿瘤体积计算＞
肿瘤体积(cm3)＝短径(cm)×长径(cm)×高(cm)×1/2
实施例2
基于Surv.m-CRA-1为m-CRA制作技术(专利文献2、非专利文献7)，通过将其改进而成的新方法如以下那样制作。另外，对于Surv.m-CRA-1的结构，以往无报道。首先，通过专利文献2记载的方法制作在含有增殖控制用单元的载体质粒(P1质粒：Replication-controllable plasmid)中在E1A的上游插入小鼠存活蛋白启动子(-173～-19)、在E1BΔ55K的上游插入CMV启动子的pSurv.E1A-CMV.19K质粒。然后，将pSurv.E1A-CMV.19K质粒用限制酶I-Ceul消化，接着用限制酶PI-Seel消化，分离并纯化从上游起具有存活蛋白启动子/E1A/CMV启动子/E1BΔ55K的DNA序列。另一方面，使含有E1区的人腺病毒5型的342-3523bp缺失，在该部位赋予I-Ceul、PI-Seel识别序列，以亚克隆P1质粒的基因，另一方面，将保持有E3区的腺病毒基因组质粒的pAd.HM3(Dr.Mark A.Kay，Stanford University提供)用限制酶I-Ceul消化，接着用限制酶PI-Seel消化，在各步骤中用苯酚/氯仿纯化后进行乙醇沉淀。将上述存活蛋白启动子/E1A/CMV启动子/E1BΔ55K的DNA用T4DNA连接酶插入该经I-Ceul/PI-Seel处理的pAd.HM3，得到限制增殖型腺病毒载体质粒pAd.HM4-Surv.E1A-CMV.19K。将该质粒pAd.HM4-Surv.E1A-CMV.19K转染于293细胞，提取出现的病毒嗜斑并扩增、纯化，由此得到作为“E1A基因表达受存活蛋白启动子控制、进而E1BΔ55K表达受CMV启动子控制、保持E3区的多因子限制增殖型腺病毒”的Surv.m-CRA-1。
实施例3
使Surv.m-CRA-1以各自的感染复数(Multiplicity of Infection：MOI)在体外感染作为恶性肿瘤细胞的肝癌细胞株HepG2和作为正常细胞的成纤维细胞WI-38，感染3天后和5天后用WST-8(Nacalai Tesque公司、产品目录编号07553-44)评价细胞存活率(cellviability)。为了进行特性比较，在实验中在同样的条件下使用E3区缺损的“E1A基因表达受存活蛋白启动子控制、进而E1BΔ55K表达受CMV启动子控制、E3区缺损的多因子限制增殖型腺病毒”Surv.m-CRA(无E3)、作为“基于病毒增殖的杀伤”的评价对照的非增殖型腺病毒Ad.dE1.3进行了比较实验。另外，限制增殖型腺病毒在恶性肿瘤中病毒迅速增殖并引起基于其的细胞杀伤效果，因此恶性肿瘤HepG2的MOI设为0.3、1、3，而正常细胞WI-38的任一组中，基于病毒增殖的细胞损伤程度均低，因此为了使其组间差异明显可见，以与HepG2相比各增加3倍的量的方式，将MOI设为1、3、10的条件。
对于各MOI以及各天数(感染后天数)中的各3组进行比较，将结果示于图3。各条件下，将对照Ad.dE1.3的活细胞数设为100％，以％示出针对其的同一条件(各MOI以及各天数)的Surv.m-CRA-1(有E3)和Surv.m-CRA(无E3)的活细胞数的比较。因此，图3的图中，纵轴终究为“同一条件(各MOI以及各天数)下的3组的比较”，图的纵轴的％不是不同MOI间的比较或不同天数间的比较。另外，任一组中，N＝5，将其平均和标准误差示于图3。同一条件(各MOI以及各天数)下，2组间的统计学的差异显著性计算通过学生t检验来进行，P＜0.05为有显著性差异，与对照Ad.dE1.3的比较中有显著性差异时，在Surv.m-CRA-1(有E3)和Surv.m-CRA(无E3)的各棒图上标记*。
恶性肿瘤细胞株HepG2情况下，在该实验条件下在MOI 1以上确认到基于病毒增殖的杀伤效果。MOI 1情况下，仅Surv.m-CRA(无E3)确认到显著的基于病毒增殖的杀伤效果，MOI 3情况下，Surv.m-CRA(无E3)和Surv.m-CRA-1(有E3)两者均确认到显著的基于病毒增殖的杀伤效果。即，表明最终得到了同等治疗效果。另一方面，正常细胞WI-38情况下，第3天、第5天的任一MOI下Surv.m-CRA-1(有E3)均未观察到细胞损伤，而Surv.m-CRA(无E3)情况下，在第3天、第5天两者中仅MOI 10下观察到显著的细胞损伤。即，Surv.m-CRA(无E3)情况下可对肿瘤细胞HepG2诱导显著的细胞死亡的MOI 3下，正常细胞WI-38中未发生显著的细胞死亡，因此这2种存活蛋白反应性多因子限制增殖型腺病毒均可观察到肿瘤特异的细胞损伤效果，具有优良的作为可靠的癌治疗药的性能，但是Surv.m-CRA-1(有E3)在肿瘤特异性(安全性)方面更优良。
能够全面且准确地评价和反映人类患者体内的有临床意义的长期(数十天、月、年度单位)治疗效果的体外实验体系、能够准确评价其详细不同的动物模型并不存在，但是可以说本发明中可进行的体外实验体系得到了以下的科学结论。即，病毒增殖受存活蛋白启动子控制的限制增殖型腺病毒显示充分的肿瘤细胞死亡和肿瘤特异性(安全性)，进而对正常细胞无影响，Surv.m-CRA-1(有E3)被赋予了更高的安全性(体外实验体系中，达到未观察到对正常细胞的影响的水平)，因此Surv.m-CRA-1(有E3)为更优良的限制增殖型腺病毒。另外，肿瘤治疗效果方面，有E3的Surv.m-CRA-1与无E3的Surv.m-CRA相比，虽然在体外实验的某些条件下观察到细胞损伤性低(该发现与以往的结论完全相反，这也很重要)，但是在实际的临床中作为治疗药使用时，在以合适的量且有益于患者的临床治疗效果长期持续(即，不是体外那样的数小时、数天单位)时，Surv.m-CRA-1(有E3)带来(不逊色于无E3的)充分且强的治疗效果。这与上述实施例1所示的骨与软组织恶性肿瘤的人类患者的临床试验中的强的(超过以往限制增殖型腺病毒的)治疗效果和极高的安全性(未见严重的副作用)一致。即，本发明实施例2中首次从科学观点出发而发现的超过现有技术的本技术同时也在本发明实施例1中通过人类临床试验首次得到证明。因此，本发明的Surv.m-CRA-1为治疗效果和安全性两方面性能都大大超过以往的限制增殖型腺病毒、能够单独作为癌症治疗药的新的限制增殖型腺病毒。
实施例4
反复给药试验
[病例1]
示出针对骶骨复发脊索瘤(60岁、男性)的利用Surv.m-CRA-1的治疗经过。患者于2014年罹患骶骨脊索瘤并开始粒子放射治疗。2019年由于转移到左肾而行肾切除。2020年12月确认骶骨脊索瘤增大，于2021年5月开始给药Surv.m-CRA-1。患者满足实施例1的选择标准且不符合排除标准。肿瘤体积为315cm3(30cm3以上)，因此将1×1011vp的Surv.m-CRA-1分9处，间隔4周地共5次(合计5×1。
表4示出给药部位(骶骨)中的、给药前至给药起32周后的RECIST标准的奏效性判定和Choi标准的奏效性判定及非给药部位(右髂翼)的给药前至给药起32周后的RECIST标准的奏效性判定。
[表4]
给药部位(骶骨)
非给药部位(右髂骨翼)
SD：病情稳定，PD：病情进展
如表4所示，非给药部位处肿瘤增大，与此相对地，给药部位处病变得到抑制、肿瘤体积减少。虽然为相当大的肿瘤，但是在给药开始后8个月(32周)时可见SD效果。给药期内未确认到不良事件。
[病例2]
示出针对骶骨复发脊索瘤(73岁、男性)的利用Surv.m-CRA-1的治疗经过。患者于2016年罹患骶骨脊索瘤，以S3水平切除肿瘤。2018年实施重粒子放射治疗(2次)。2020年10月切除右腓肠肌转移，2021年实施3个疗程的化学疗法(ADR)。2021年左股骨转子部病理性骨折，2021年10月确认会阴部、骶骨部皮下的肿瘤增大(骶骨复发脊索瘤)，于2021年11月开始给药Surv.m-CRA-1。患者满足实施例1的选择标准且不符合排除标准。
关于肿瘤体积，会阴部为22.8cm3、骶骨部皮下为14.95cm3。第1～3次，将5×1011vp的Surv.m-CRA-1如下分配而给药。3次给药后，根据缩小的肿瘤体积而将Surv.m-CRA-1的给药量调整为3.5×1011vp(7ml)，给药第4、5次。每隔4周进行给药。
表5示出给药部位(会阴部、骶骨部皮下)的给药前至给药后140天的RECIST标准的奏效性判定和Choi标准的奏效性判定及非给药部位(直肠左、直肠右、左臀肌内、右髂骨)的给药前至给药后第84天的RECIST标准的奏效性判定。
[表5]
给药部位(会阴部、骶骨部皮下)
非给药部位(直肠左、直肠右、左臀肌内、右髂骨)
PR：部分缓解，SD：病情稳定，PD：病情进展
如表5所示，非给药部位的肿瘤增大，与此相对地，给药部位的病变得到抑制、长径(RECIST)确认到SD效果、Choi标准(造影效果)下确认到PR效果，肿瘤体积可见明显的缩小。给药期内，除了淋巴细胞减少(750/μl)以外未确认到不良事件。
如上所述，反复给药情况下Surv.m-CRA-1的安全性和有效性也得到证明。如病例2中所实施那样，通过根据肿瘤体积的变动而调整给药液量，能够更安全且有效地治疗。

Claims (15)

1.一种药物组合物，其为含有具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒的用于治疗骨与软组织肿瘤的药物组合物，其中，所述限制增殖型腺病毒的E3区没有缺损。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，骨与软组织肿瘤为原发性骨与软组织肿瘤。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，骨与软组织肿瘤为复发的原发性骨与软组织肿瘤或复发的转移性骨与软组织肿瘤。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的药物组合物，其中，骨与软组织肿瘤为骨肿瘤。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，骨肿瘤为脊索瘤。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1010vp～1×1012vp。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，单次给药或者4周1次地反复给药。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，根据给药对象的肿瘤体积而改变给药液量。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，每一次给对象的限制增殖型腺病毒的总给药量为1×1011vp。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，在两个以上部位存在肿瘤时，对肿瘤最大的3处给药，根据肿瘤体积分配各给药量。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，在一个肿瘤体积为30cm3以上时，仅对1处给药。
12.根据权利要求8或10所述的药物组合物，其中，按照下述方式确定药物组合物的给药液量：
给药对象的肿瘤体积小于5cm3时为1mL；
给药对象的肿瘤体积为5cm3以上且小于9cm3时为2mL；
给药对象的肿瘤体积为9cm3以上且小于15cm3时为3mL；
给药对象的肿瘤体积为15cm3以上且小于21cm3时为5mL；
给药对象的肿瘤体积为21cm3以上且小于30cm3时为7mL；且
给药对象的肿瘤体积为30cm3以上时为10mL。
13.一种限制增殖型腺病毒，其为具有处于存活蛋白(Survivin)启动子表达控制下的E1A基因的限制增殖型腺病毒，其中，所述限制增殖型腺病毒的E3区没有缺损。
14.根据权利要求1所述的药物组合物或根据权利要求13所述的限制增殖型腺病毒，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区为E1BΔ55K。
15.根据权利要求14所述的药物组合物或限制增殖型腺病毒，其中，限制增殖型腺病毒的E1B区受不同于E1A区的启动子控制。
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